博 士 （ 情 報 科 学 ） 岩 淵 禎 弘
学 位 論 文 題 名
虚血・再灌流時におけるアストロサイトの 機能動態変化と細胞外ATP ―プリン受容体
シグナル伝達系に関する研究 学位論文内容の要旨
【背 景】 脳を栄 養する 血管の 閉塞や 狭窄 により 血流が 途絶す ると 、数分 で細胞 代謝活動は停止し、血 流停 止が 持続す るとエ ネルギ ー貯蔵 能カに乏しい神経細胞は死滅して早期の脳機能障害に陥る。また、
血流 再開 によル エネル ギー代 謝が回 復しても、虚血時間や虚血状態（梗塞部位や梗塞範囲）などにより 神経 細胞 の細胞 代謝活 動が回 復せず 、遅発性細胞死などが生じる。脳梗塞の治療法としてほ、早期に血 栓部 位を 治療し て血流 回復す る以外 の有 効な治 療法は なく、 血栓 溶解剤 (t‑PA) の臨床使用が海外で行 われ てい るが、 t‑PA の投 与によ り神経細胞が死滅するとの報告もある。したがって、脳虚血性疾患の複 雑な 発症 胎癒メ カニズ ムを解 明し、 画期 的な治 療法を 探索す るこ とは極 めて意 義のある研究である。
こ れまで は、神 経細 胞と共 に中枢神経系を構成しているグリア細胞（アストロサイト）は単なる神 経細 胞の 支持体 として 考えら れてい た。しかし近年、アストロサイトは脳虚血などの障害時には積極的 にそ の形 態・機 能を変 化させ て神経 細胞保護作用を示すことが報告されている。具体的には、虚血・再 灌流 時に おいて 、グリ ア細胞 は神経 栄養因子を放出して、残存している神経細胞の軸索突起の再伸長な どを 促す など、 脳内ネ ットワ ークの 再構築に寄与していることが示唆されているが、形態変化したアス トロ サイ ト自身 が正常 な血管 を圧迫 して障害をもたらす（再灌流障害）ことも報告されており、詳細は 不明 な点 が多い 。中程 度の脳 虚血後 にはアストロサイトが主役となり脳内の環境が改善されるにも関わ らず 、こ れまで アスト ロサイ ト単層 培養系を用いた虚血ストレスへの応答、すなわちアストロサイト自 身の 虚血 ・再灌 流時の 挙動に 着目し た研 究は殆 ど行わ れてい ない 。
【 目的】 本研 究では 、アス トロサ イト におけ る虚血 耐性メ カニ ズムの 解明を 目的と し、特 にATP 感 受性 プリ ン受容 体(P2Y receptors) を 介した シグ ナル伝 達機構の虚血耐性効果の関与にっいて研究を行 った 。虚 血後の アスト ロサイ ト間で は活発な情報伝達のやり取りがなされているはずであり、それらが 広範 囲に おける 虚血耐 性効果 獲得メ カニズムに寄与するものと考えた。とりわけアストロサイト問の情 報 伝達機 構であ るCaz+ waves のdynamics が虚血 処置前 後で 変化す る可能 性が考 えられ たの で、caged calcium ionophore を用 いてCa2 十waves を虚 血処 置後の アスト ロサイ ト培 養系に おいて 誘導し 、その dynamics の変化 と虚血 耐性と の機 能連関 を検証 した。
【結 果・ 考察】 まず、 新生児 ラット 大脳 皮質由 来アス トロサ イト 培養系 に対し て、虚血模擬処置であ
る脱 酸素 ・脱グ ルコース処置(oxygen‑glucose deprivation; OGD) を施し、虚血耐性効果の存在を確認し
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た 。 培 養 系 にOGD処 置 を 行 い 、 通 常 培 養 す る こ と で 再 灌 流 模 擬 と し た 。 ア ス ト ロ サ イ ト に 対 し て は4 時 間 未 満 のOGD処 置 は 非 致 死 的 な 虚 血 模 擬(sublethal OGD; sOGD)処 置 で あ り 、8時 間 以 上 は 致 死 的 で あ っ た 。 ま た 、sOGD処 置 を 行 っ た1日 後(preconditioning; PC処 置 ） に 再 び 致 死 的 なOGD処 置 を 行 う と 、 有 意 に 致 死 的OGDに よ る 細 胞 死 が 抑 制 さ れ た 。 し た が っ て 、 ア ス ト ロ サ イ ト 培 養 系 に お い て 確 か にPC処 置 に よ り虚 血 耐 性 効 果 が 獲得 さ れ る こ と が わ かっ た 。
ア ス ト ロ サ イ ト 培 養 系 にcaged calcium ionophoreを 導 入 し 、 紫 外光(350 nm)を 局 所的 に 照 射 す る こ とで 、 目 的 と す る 細胞 群 に お け る 細 胞内Ca2゛ 濃 度 （ ［Cali） を 上 昇 させ る ことが 可能 であっ た。 また、
[Ca2+J,の 上 昇 とぃう 情報 が、次 々と 周囲の アス トロサ イト に伝搬 され る Ca2十waves がcaged calcium ionophoreを 用 い る こ と で 非 侵 襲 的 に 誘 導 可 能 で あ り 、 非OGD処 置 群 で は 主 に 細 胞内 ギ ャ ッ プ 結 合 を 介 し た 伝 搬 経 路 で 伝 達 す る こ と が わ か っ た 。 一 方 、sOGD処 置 後 の 再 灌 流1時 間 （ 初 期 ） 、 再 灌 流1日 後
（ 後 期 ） で は 、Ca＋wavcsの 伝 搬 速 度 、 伝 搬 距 離 が 非 （ ）GD処 置 群 よ り も 有 意 に 亢 進 し て い た 。soGD 処 置 に よ りCa2＋wavesが 亢 進 す る 現 象 の メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る た め 、soGD処 置 後に 細 胞 内 情 報 伝 搬 経 路 に関 連 す る ギ ャ ッ プ結 合 タ ン パ ク 質 （conne】dn43；Cx43） の 発 現 量 、 活 性化率 など を調査 した が、sOGD 処 置 有 無 群 で 明 確 な 差 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、 細 胞 内 情 報 伝 搬 経 路 の 活 性 化 に よ りCa2＋wavcs が 亢 進 し た 可 能 性 は 低 い こ と が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、 非Oくm処 置 群 で はCa2＋wavcsの伝 搬 に あ ま り 関 与 し て い な い 細 胞 外 情 報 伝 搬経 路 （ATP． ￣P2Yreccptorsシ グナ ル 伝 達 経 路 ） が、sOGD処 置後 で は 活 性 化
（ 誘 発 ） す る 可 能 性 が 考 え ら れ た ので 、 細 胞 外A11P濃 度 （D虹P］ 。 ） な ら ぴ にP2Yreceptorgの 発 現 量 を 調 査 し た 。soGD処 置 直 後 な ら び に 再 灌 流 初 期 で は 明 ら か に 叫 司 。 上 昇 が 認 め ら れ 、 再 灌 流 中 にArP放 出 経路 の ー っ で あ るhemich曲nelsを 阻害 す る と 、 ［ATP］ 。上 昇 が 抑 制 さ れ た。 ま たsO（m処 置 再灌流 初期 で はP2Yl′2Y2rcceptorsの 発 現 量 な らび に 各 種 拮 抗 剤 に対 す る 感 受 性 は 、非O（ 〕D処 置 群と 比 較 し て 有 意 に 増 加 し て い た 。 ま たP2Yrec叩torS阻 害 剤 を 負 荷 す る こ と で 、soGD処 置 再 灌 流 初 期 に お け るCa2十 w轟csの 亢 進 は 抑 制 さ れ た 。 以 上 の 結 果 よ り 、soGD処 置 再 灌 流 初 期 で はArPlP2Yrecepねrsシ グ ナ ル 伝 達 経路 が 活 性 化 し た 結果 、Ca2＋wavesが 亢進 す る こ と が わ かっ た 。
最 後 にOGD耐 性 効 果 獲 得 メ カ ニ ズ ム にTP‐P2Yreceptorsシ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 活 性 化 が 関 与 し て い る か を 調 査 し た と こ ろ 、sO（m処置 再 灌 流 初 期 に おい て は 、A11P‐P2Yreceptors伝 達 経 路 の下 流 シ グ ナ ル で あ るAktやERK1／2が 活 性 化 さ れ て お り 、 再 灌 流 後 期 で は 再 灌 流 初 期 に お け るEI水1′2の 活 性 化 が も た ら す 、 転 写 調 節 因 子c一Fos、c￣Junの 発 現 量 が 亢 進 して い た 。 ま た 、P2Yreceptors、ERKl/2阻 害 剤 を sOGD処 置 再 灌 流 期 間 中 に 負 荷 し た と こ ろ 、 そ の 後 の 致 死 的 な0GD処 置 に 対 す る 抵 抗 性 が 消 失 し た 。
【 結 語 】 ア ス ト ロ サ イ ト 自 身 がO（m耐 性 効 果 を 獲 得 す る た め に はEI水1/2を 介 し たArP−P2Yreceptors シ グ ナ ル 伝 達 経 路 、 す な わ ちCa2＋wavesに お け る 細 胞 外 伝 搬 経 路の 活 性 化 が 必 須 で あり 、s0（m処 置 後 に 早 期 に 活 性 化 さ れ たATP＿P2Yreceptorsシ グ ナ ル 伝 達 経 路に よ り 転 写 調 節 因子 の 発 現 が 亢 進 し 、様 々 な 遺 伝 子 発 現 が 変 化 す る こ と が 致 死 的 な0GDstressに 対 す る 耐 陸 効 果 に 寄 与 し て い る こ と を 示 し た 。 OGD中 のA田 放 出 メ カ ニ ズ ム な ら び に0GD耐 性 効 果 に 寄 与 す る 転 写 調 節 因 子 活 性 化 と 新 規 タ ン パ ク 質 産生 と の 機 能 連 関 の解 明 と が 今 後 に 残さ れ た 重 要 な 課 題 であ る 。
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学位論文審査の要旨 主査 教 授 河原 剛一 副査 教 授 遠藤 俊徳 副査 准教授 岡嶋孝治
学 位 論 文 題 名
虚血・再灌流時におけるアストロサイトの 機能動態変化と細胞外 ATP ―プリン受容体
シグナル伝達系に関する研究
脳を 栄 養す る血管の閉塞 や狭窄により血流が 途絶すると、エネ ルギー貯蔵能カに 乏しい神経細胞は死 滅し て早期の脳機 能障害に陥る。血流 再開後も虚血時間 や虚血状態により 神経細胞の細胞代謝活動が回復せず、
遅発性細胞死 などが生じるため、 脳虚血性疾患の複 雑な発症／治癒メ カニズムを解明し、画期的な治療法を 探索 す るこ とは極めて意 義のある研究である 。これまでは神経 細胞と共に中枢神 経系を構成している グリ ア細 胞 （ア ストロサイト ）は単なる支持体と して考えられてい たが、障害時には 積極的にその形態・ 機能 を変 化 させ て神経細胞保 護作用を有すること が報告きれている 。中程度の脳虚血 後にはアストロサイ トが 主役 と なり 脳内の環境が 改善されるにも関わ らず、アストロサ イト単層培養系を 用いた虚血ストレス ヘの 応答 、 すな わち虚血・再 灌流時の挙動に着目 した研究は殆ど行 われていない。虚 血後は細胞間で活発 な情 報伝 達 のや り取りがなさ れているはずであり 、それらが広範囲 における虚血耐性 効果獲得メカニズム に寄 与す る もの と考え、特に アストロサイト間の 情報伝達機構であ るカルシウム波の 虚血処置後のdynamicsの 変化 とATP感受性 プリン受容体(P2Y receptors)を介したシグナ ル伝達機構の虚血 耐性効果の関与につ いて 研究を行った 。
新 生 児ラ ット大脳皮質 由来アストロサイト 培養系に対して、 虚血模擬処置であ る脱酸素・脱グルコ ース 処置(oxygen‑glucose deprivation; OGD)を施し、通常培養す ることで再灌流模擬とした。本手法によるOGD 処置 で は、4時間 未満 は 非致 死的 な虚血模擬(sublethal OGD; sOGD)処置 であり、8時間以上はアスト ロサ イトに対して 致死的であることが わかった。また、sOGD処置を行って 再灌流した1日後（preconditioning;
PC処 置 ）に 、再 ぴ 致死 的なOGD処 置 を行 うと 、PC処 置を 施 さな いア ス トロ サイ トと比較して、有意 に細 胞死 が 抑制 された結果よ り、PC処置により虚 血耐性効果が獲得 されることがわか った。次に虚血処置 後の アストロサイ ト間のカルシウム波 のdynamicsの変化を検証した。培養系にcaged calcium ionophore (caged) を導 入 し、 紫外 光(350 nm)を 局所 的に 照 射す るこ と で、目的 とする細胞内のカ ルシウムイオン濃度 を上 ―44−
昇 さ せ る こ と が 可 能 で あ っ た 。 ま た 、 こ の カ ル シ ウ ム イ オ ン 濃 度 の 上 昇 と い う情 報 が、 周 囲の アス ト ロ サ イ ト に 伝 搬 さ れ る カ ル シ ウ ム 波 が 誘 導 さ れ 、 非OGD処 置 群 で は 主 に 細 胞 内 ギ ャ ッ プ 結 合 を介 した 細 胞 内 伝 搬 経 路 で 伝 達 す る こ と が わ か っ た 。 一 方 、sOGD処 置 後 の 再 灌 流1時 間 （ 初 期 ） 、 再 灌 流1日 後 （ 後 期 ） で は 、 カ ル シ ウ ム 波 の 伝 搬 速 度 、 伝 搬 距 離 が 非OGD処 置 群 よ り も 有 意 に 亢 進 し て い た 。sOGD処 置 後 に ギ ヤ ッ プ 結 合 タ ン パ ク 質(connexin 43; Cx43)の 発 現 量 や 活 性 化 率 な ど を 解 析 し た が 、 明 確 な 差 は認 めら れ な か っ た 。 そ こ で 細 胞 外 伝 搬 経 路(ATP‑P2Y receptorsシ グ ナ ル 伝 達 経 路 ） が 、sOGD処 置 後 で は 活 性 化 す る 可 能 性が 考え ら れた の で、 細 胞外 ´ 虹甲 濃度 （ ［ATP］ 。 ）な ら びにP2Y rec・eptorsの発現 量を解析した。 再灌流 初 期 で はhemichannels由 来で ［ATP］。 は 上昇 し、P2Yrcccptorsの 発現 量も 有 意に 増 加し て おり 、P2YreccptorS 阻 害 剤 を 負 荷 す る こ と で カ ル シ ウ ム 波 の 亢 進 は 抑 制 さ れ た 。 以 上 の 結 果 よ り 、 再 灌 流 初 期 で は 細 胞 内 伝 搬 経 路 の 活 性 化 で は な く 、 主 にATP・P2YreceptorSシ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 活 性 化 し た 結 果 、 カ ル シ ウム 波が 亢 進 す る こ と が わ か っ た 。 加 え て 再 灌 流 初 期 に お い て 、ATP‐P2YfeceptorS伝 達 経 路 の 下 流 シ グ ナ ル で あ るAkt やEIK1／2が 活 性 化 さ れ て お り 、 再 灌 流 後 期 で は 再 灌 流 初 期 に お け るEIKl/2の 活 性 化 が も た ら す 、 転 写 調 節 因 ′ 子cーFos、c一Junの 発 現 量 が 亢 進 し て い た 。 ま たP2YrcceptorS、EI取1/2阻 害剤 をPC処 置 後の 再灌 流 期 間 中 に負 荷し た とこ ろ 、そ の 後の 致 死的 なO（m処置 に 対す る 抵抗 性が 消 失し た 。
こ れ を 要 す る に 、 著 者 は 、 ア ス ト ロ サ イ ト が 虚 血 耐 性 効 果 を 獲 得 す る た めに はEIuく1/2を 介 したATP―P2Y receptorsシ グ ナ ル 伝 達 経 路 、 す な わ ち カ ル シ ウ ム 波 に お け る 細 胞 外 伝 搬 経 路 の 活 性 化 が 必 須 であ り、soGD 処 置 後 に 早 期 に 活 性 化 さ れ た 細 胞 外 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に よ り 転 写 調 節 因 子 の 発 現 が 亢 進 し 、 様 々 な 遺 伝 子 発 現 が 変 化 す る こ と が 、 致 死 的 なOGDstr・essに 対 す る 耐 性 効 果 に 寄 与 し て い る こ と な ど 多 く の新 知見 を 得 た も の で あ り 、 生 体 情 報 科 学 と く に 細 胞 情 報 科 学 に 対 し て 貢 献 す る と こ ろ 大 な る も の が あ る 。 よ っ て 著 者 は 、 北海 道大 学 博士 （ 情報 科 鈞の 学 位を 授与 さ れる 資 格あ る もの と認 め る。
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