脳虚 血 誘発神経 細胞死に対 する

博 士 （ 薬 学 ） 宮 崎 浩 之

学 位 論 文 題 名

脳虚 血 誘発神経 細胞死に対 する GDNF の防御効 果 学位論文内容の要旨

1．はじめに

  脳虚血に対し中枢神経系はきわめて脆弱であり，いかに神経細胞を虚血侵襲から保護し，

また機能を保持するかが脳虚血研 究の主要課題である．局所脳虚血における脳梗塞辺縁部 や全脳虚血における海馬CA1領域においては，細胞内Ca2゛濃度の上昇，細胞内フリーラジ カルの産生，ミトコンドリア機能 不全などに起因したネクローシスとアポ卜ーシスとの複 合的な機序によって選択的に細胞 死を誘発すると考えられている．今回，ラット脳虚血に 誘発される神経細胞死のメカニズ ム解明を目的に，カルシウムチャネル拮抗作用およびカ ルモジュリン阻害作用を有するジ ヒドロピリジン誘導体CV‑159の作用，およびグリア細胞 株由来神経栄養因子GDNFの役割について検討を行った．

2.結果および考察

1）脳虚血障害に対するカルシウム拮抗薬CV‑159の保護効果

  一過性前脳虚血に伴って，海馬CA1領域に選択的な遅発性神経細胞死が誘発される，今 回，脳虚血の2時間前にCV‑159（10 mg／kg，p．0．）を投与すると，有意な神経細胞死保護効 果が認められた．また中大脳動脈閉塞による脳梗塞および脳浮腫の誘発を顕著に抑制した，

一方，対照薬のmcardipincおよびnifbdipineはこれら脳虚血障害に対し有効性を示さなかっ た，以上の結果から，急性期における脳血管障害，とくに神経細胞死や脳梗塞を伴う虚血 性脳疾患に対し，C丶′．159は予防あるいは治療薬として有用であること を示唆した，

2）ラッ卜一過性前脳虚血におけるGDNFの発現変化

  15分問のラッ卜一過性前脳 虚血を施すことによって，海馬および大脳皮質に虚血6時間 後 をピ ーク とす るGDNF mRNA発 現の 誘導 が認 めら れた ，とくに海馬CAl領域では遺伝子 発 現の 変化 に伴 ってGDNF産生量が増加し， 脳虚血3日後の遅発性神経細 胞死誘発と同時 にGDNF量の 減少 を示 した ．正 常動 物お よび 脳虚 血急 性期において，GDNFの産生細胞は 主として神経細胞であること が免疫組織化学的検討から明らかとなったが，遅発性神経細 胞 死に 伴っ て海 馬CAl領 域のGDNF産生細胞は散在性を示し，虚血誘発反 応性アス卜ロサ イ トがGDNFを産 生す るこ とを 見出 した ，こ のよ うな ことから，脳虚血 に伴うGDNFの発 現 上昇 ，お よび 海馬CAl領域 における虚血誘発反応性アストロサイ卜のGDNF産生は海馬

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神 経細 胞 死に 深く 関与 していることが示唆さ れた．

3）GDNFの遅発性神 経細胞死保護作用

  一 過 性 前 脳 虚 血 に 誘 発 さ れ るGDNF発 現 の 役 割 を 明 ら か に す る た め ， 海 馬CA1領 域 あ る い は 脳 室 内 にGDNFの 微 量 投 与 を 試 み た ． 一 過 性 前 脳 虚 血 の20分 前 にGDNF（1.0 yg/2 yl) をCA1領 域 に 直 接 投 与 す る こ と に よ っ て ， 遅 発 性 神 経 細 胞 死 は 有 意に 抑制 され るこ と が明 ら か と な っ た ． また ， 脳室 内投 与(2.5Lt9/5 VI)に よっ て， 両側 海 馬の 神経 細胞 死が 有 意に 抑制された，さら に，TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase‑mediated dUTP nick‑end labeling)染 色 の検 討か ら，GDNFは 海馬 にお ける ア ポ卜 ーシ ス様 神 経細 胞死 を抑 制す る こと が 示 唆 さ れ た ， こ れ ら の こ と か ら ，GDNFはin vivoモ デ ル 動 物 に おい て， アポ 卜ー シ ス様 神 経 細 胞 死 を 抑 制 す る 可 能 性 を 示 唆 し ，脳 虚血 誘 発海 馬遅 発性 神 経細 胞死 に対 して 生 存・

保護因子として重 要な役割を果たしていること が示唆された．

4）神経細胞死に対するGDNFの保護機構

  ― 過 性 前 脳 虚 血 に 伴 っ て ， 海 馬 で はglutamateの 放 出 と 同 時 にdopamine (DA)の 過 剰 放 出が 引き 起 こさ れ， 海馬 神経 細 胞死 に対 して 憎悪 因 子と して 作用 す るこ とが 知ら れて い る，

ま た ，GDNFはDAニ ュ ー ロ ン に 対 し て 強 い 賦 活 作 用 を 有 す る こ と か ら ， 海 馬 に お け るDA ニ ュ ー ロ ン に 対 す るGDNFの 作 用 を 検 討 し た と こ ろ ，GDNFはtyrosine hydroxylase (TH)の 発 現 を 誘 導 す る 一 方 で ， 脳 虚 血 ス 卜 レ ス に 誘 発 され るTHの 過剰 発現 を顕 著 に抑 制す るこ と が 明 ら か と な っ た ，THの 発現 は ，mitogen‑activatedproteinkmaseを 介し た 細胞 内シ グナ ル 伝 達 に よ り 調 節 を う け て い る こ と が 知 ら れ て い る ， ま た ，THの 発 現 はD2受 容 体 お よ びDA tr孤spo】 缸 を 介 し たDAの 取 り 込 み に よ っ て 調 節 を うけ てい る， こ のよ うな こと から （mNF はDAの 取 り 込 み を 促 進 す る と 同 時 に ， 細 胞 内 情 報 伝 達 系 を 介 し てTH遺 伝 子 の 発 現 上 昇 を 調節している可能性が 示唆された．

  GDNFはGDNFfaIniりrecept．0ra1（GFRal） 受 容 体 と 結 合 し て 複 合 体 を 形 成 し ，R餅 rcceptorぢrosinekin諮c（R￠t冫と会合することに より細胞内の情報伝達を活 性化することが知 ら れ て い る ． こ の よ う な こ と か ら ，GDNFの 神 経 細胞 死保 護 機構 を解 明す る 目的 で， 各受 容 体 発 現 お よ び こ れ ら 受 容 体 を 介 す る 細 胞 内 シ グ ナル 伝達 経 路の 活性 化に っ いて 検討 を行 っ た ， そ の 結 果 ， 脳 虚 血 に 伴 っ て 海 馬 のR讎 発 現 が 誘 導 さ れ る と 同 時 に ，GDNFに よっ て発 現 調 節 さ れ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ． ま た ，GDNFに よ っ てR鋭 の チ ロ シ ン リン 酸化 が誘 発 され，eぬacenmarsignal‐r・egmatedhn恥e（EIK）およびphosph面dylinosit013＿knase（P13K）／

s曲e‐threomnebn郷eくAkt） の りン 酸化 を誘 導す る こと が明 らか となった ，さらに，c」壜佃 resp0恥celementbinmngprotcin（CI岨B）の りン 酸化 を誘 導 し， これ らの 活 性化 がTH遺伝 子 の 発 現 調 節 を 含 むGDNFの 神 経 細 胞 死 抑 制 機 構 お よ び 神 経 細 胞 の 生 存 維 持 に 関 わ っ て い る ものと考えられた．

5） 老 化 促 進 モ デ ル マ ウ スSAMに お け るGDNF発 現 の 加 齢 変 化

老 化 促 進 モ デ ル マ ウ スSAMの 加 齢 に 伴 うGDNF発 現 の 変 化 を 検 討 し た 結 果 ，S」 ｀MP8お

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よ びS」WP10の 若 齢 期 （20月 齢 ） に お い て ， 海 馬 に お け るGDNF発 現 量 はSAMRlに 比 して 有意 に減 少し てい た． また，S」WP8およびS心江P10の海馬CAl領域における神経細 胞数は加齢に伴って減少することが明らかとなった，このことから，GDNFは加齢に伴った 海馬機能低下，および海馬CA1領域の神経細胞死に対し重要な役割を担っていることが示 唆された，若齢期におけるGDNF発現量の低下は，その後の成長過程における神経細胞死，

お よ び 海 馬 の 学 習 記 憶 能 に関 連す る機 能障 害の 一因 をな して い るの かも 知れ ない ．   以上 ，本研究結果はGDNFの神経細胞死保護作用を明らかにし ，臨床における脳虚血障 害に対する有用性を示唆し，今後の臨床応用が 期待される，

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学位論 文審査の要旨 主査

副査 副査 副査

教授 教授 助教授 助教授

野村 鈴木 大熊 松岡

学 位 論 文 題 名

靖幸 利治 康修 一郎

脳 虚 血 誘 発 神 経 細 胞 死 に 対 す る GDNF の 防 御 効 果

  申 請 者 は ， ラ ヅ ト 脳 虚 血 に 誘 発 さ れ る 神 経 細 胞 死 の メ カ ニ ズ ム 解 明 を 目 的に ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 カ ル シ ウ ム 拮 抗 薬CV‑159の 作 用 ， お よ び 神 経 栄 養 因 子GDNFの 保 護 効 果 に つ い て 種 々 検 討 を 行 っ た ．CV‑159は 脳 虚 血 に 伴 う 細 胞 障 害 を 抑 制 し ， 急 性 期 脳 血 管 障 害 の 予 防 あ る い は 治 療 薬 と し て 有 用 で あ る こと を 示 唆 し た ． ま た ， 神 経 栄 養 因 子GDNFの 神 経 細 胞 死 に 対 す る 保 護 効 果 を 明 ら か に し ，GDNFの 臨 床 応 用 の 可 能 性 を 示 唆 し た ． 老 化 に 伴 う 海 馬 機 能 低 下 に 対 す るGDNFの 役 割 に つ い て も 新 た な 知 見 を 得 た ．

  CV‑159は カ ル モ ジ ュ リ ン 阻 害 作 用 を 併 せ 持 つ ユ ニ ー ク な カ ル シ ウ ム 拮 抗 薬 で あ り ， 一 過 性 前 脳 虚 血 に 伴 う 海 馬 の 遅 発 性 神 経 細 胞 死 に 対 し 顕 著 な 保 護 効果 を 有 し ， ま た 中 大 脳 動 脈 閉 塞 に よ る 脳 梗 塞 お よ び 脳 浮 腫 の 誘 発 を 顕 著 に 抑 制す る こ と を 明 ら か に し た ．N1cardipine等 の カ ル シ ウム 拮抗 薬に よる 改善 効果 は認 め ら れ な か っ た こ と か ら ，CV‑159は ， 従 来 の カ ル シ ウ ム 拮 抗 薬 よ り も 有 効 に 脳 虚 血 障 害 を 防 御 す る こ と を 示 唆 し ， 急 性 期 に お け る 脳 血 管 障 害 ， と く に 神経 細 胞 死 や 脳 梗 塞 を 伴 う 虚 血 性 脳 疾 患 に 対 し 有 用 で あ る こ と を 示 唆 し た ． な お，

CV‑159の 本 効 果 に 関 し 虚 血 性 脳 血 管 障 害 の 予 防 あ る い は 治 療 薬 と し て 特 許 を 申 請 中 で あ る ．

  一 方 ， 一 過 性 前 脳 虚 血 を 施 す こ と に よ っ て ， 海 馬 お よ び 大 脳 皮 質 に6時 間 後 を ピ ー ク と す るGDNF遺 伝 子 の 発 現 誘 導 が 認 め ら れ ，GDNFの 産 生 細 胞 は 主 と し て 神 経 細 胞 で あ る が ， そ の 後 反 応 性 ア ス ト 口 サ イ ト がGDNFを 産 生 す る 新 知 見 を 得 た ． 脳 虚 血 に 伴 うGDNF発 現 は ， 神 経 細 胞 死 が 誘 発 さ れ る 部 位 に お い て 強 発 現 し て い る こ と か ら ，GDNFの 役 割 を 明 ら か に す る た め ，invivo

実 験 に よ るGDNFの 海 馬 内 投 与 お よ び 脳 室 内 投 与 を 試 み ， 神 経 細 胞 死 に 対 す る 保 護 効 果 を 証 明 し た ． す な わ ち ，GDNFを 海 馬 あ る い は 脳 室 内 に 投 与 す る こ と に よ っ て 遅 発 性 神経 細 胞 死は 有 意 に抑 制 さ れる こ と ， また ，TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transfraSe‐mediateddUTPniCk‐endlabeling）染色の検言寸カゝら，

GDNFは ア ポ ト ー シ ス 様 神 経 細 胞 死 を 抑 制 す る こ と を 明 ら か に し た ． こ の こ と か ら ，GDNFはinvivoモ デ ル 動 物 に お い て ， ア ポ ト ー シ ス の 抑 制 を 示 唆 し ， 神 経 細 胞 死 に 対 し て 生 存 ・ 保 護 因 子 と し て 重要 な 役 割 を果 た し てい る こ とを 示 唆した．

  GDNFの 神 経 細 胞 死 抑 制 機 構 は ド バ ミ ン ニ ュ ー ロ ン を 用 い たinvitro実 験 に お い て 報 告 さ れ て い る が ， 詳 細 は 不 明 で あ る． 、 申 請 者は 今 回inviv0モ デ ル動 物 を 用 い る こ と に よ り ， よ り 生 体 に 近 い 反 応 を 詳 細 に 検 討 し （mNFの 有 用 性 を 明 ら か に し た ． と く に ， 海 馬 神 経 細 胞 死 に 対 す るGDNFの 生 存 維 持 あ る い は 保 護 機 構 を 示 唆 し た の は 本 研 究 が 初 め て であ り ， 脳 虚血 研 究 分野 に お いて 本 知 見 は 非 常 に 興 味 深 い ． っ ま り ，1）GDNFは ， 脳 虚 血 に 伴 う 海 馬CA1領 域 のtyrosinehydroxylase過剰 発 現 を 調節 し ， 憎悪 因 子 であ る ド バミ ン の 遊離 を 制 御 す る こ と ，2）GDNFは ， 関 連 受 容 体 の ー つ で あ るR．et受 容 体 の発 現 を 促し ， 自 己 リ ン 酸 化 に 伴 うERKお よ びP13酎Ab経 路 を 介 し た 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 を 活 性 化 す る こ と ，3）GDNFは オ ー ト ク ラ イ ン 的 調 節 機 構 に よ っ て 産 生 を 促 す と 同 時 に ， ま た ， グ リ ア 細 胞 か ら のtropmcsuppon機 構 に よ っ て 海 馬 神 経 細 胞 の 生 存 シ グ ナ ル を 活 性 化 し て い る こ と を示 唆 し た ．こ れ ら の機 構 に よっ て GDNFは ， 少 な く と も ア ポ ト ー シ ス を 合 む 海 馬 神 経 細 胞 死 に 対 し て 生 存 維 持 ・ 保 護 因 子 と し て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る こ とを 詳 細 か つ明 瞭 に 証明 し ， 神経 細 胞死に対するGDNFの有用性を示唆している．

  さ ら に ， 老 化 促 進 モ デ ル マ ウ スSAMを 用 い て ， 加 齢 に 伴 う 海 馬 神 経 細 胞 死 お よ び 海 馬 機 能 低 下 に 対 す るGDNFの 役 割 を 明 ら か に し ， 痴 呆 モ デ ル 動 物 に おけるGDNFの有用性も示唆した．

  以 上 の 結 果 か ら ， 申 請 者 はGDNFの 臨 床 応 用 と し て ， 神 経 細 胞 死 を 伴 う 脳 虚 血 障 害 や 脳 血 管 性 痴 呆 症 な ど へ の 応 用 を 示唆 し ， 本 専門 分 野 に対 す る 多大 な 情報をもたらすものと考えている．

  以 上 ， 本 論 分 審 査 委 員 会 は ，CV‐159お よ びGI）NFの 脳 虚 血 障 害 に 対 す る 有 用 性 を 明 ら か に し ， 臨 床 応 用 の 可 能 性 に つ いて 示 唆 し た論 文 で ある と 判 定し ， 本 論 文 は ， 博 士 （ 薬 学 ） の 学 位 を 受 け る に 十 分 値 す る も の と 認 め た ．