博士（農学）伊勢島エリザ美智子 学位論文題名
Physiological and enzymological studies on sucrose : sucrose lF fructosyltransferase (SST) in the tubers of Helianthus と Mberos ひ s L.
（ キ ク イ モ に お け る ス ク 口 ― ス ： ス ク 口 ― ス 1F フルク卜シルトランスフェラーゼ(SST）の生理学的及び酵素学的研究）
学位論文内容の要旨
フ 少 ク タ ン 生 合 成 代 謝 の 鍵 酵 素 で あ る 、 ス ク ロ ー ス ： ス ク ロ ー ス1F フ レ ク ト シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ （ 以 下SSTと 略 す ） の 活 性 変 動 を キ ク イ モ (Helianめus tuberosusL． 野 生 種 及 び 品 種 都 城 ） の 生 育 期 、 開 花 期 、 結 実 期 及 び 枯 草 期 に つ い て 季 節 学 的 、 酵 素 学 的 に 検 討 し た 。 フ ル ク タ ン 代 謝 に お い てSST は2分 子 の ス ク ロ ー ス よ ル イ ソ ケ ス ト ー ス を 合 成 す る 酵 素 で あ り 、2分 子 の イ ソ ケ ス ト ー ス は フ ル ク タ ン ： フ ル ク タ ン フ ル ク ト シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (FFT)に よ ル ニ ス ト ー ス を 合 成 す る 。 こ の よ う に し て フ ル ク タ ン の 長 鎖 、 例 えばイヌリンカミ合成される。またイソケストースはオリニニ蹴唐゛甘．1米ネ斗として栄養 的に重要な資源である。
キ ク イ モ の 花 芽 形 成 初 期 に は 塊 茎 中 のSSTの 活 性 及 び 塊 茎 の 肥 大 は ー ・ 時 的 に 抑 え ら れ る が 、 塊 茎 形 成 の 初 期 、 即 ち 開 花 期 に はSST活 性 は 最 大 で あ っ た 。 塊 茎 の 生 育 肥 大 は 開 花 後 期 に は 最 大 に 到 達 し 、 そ の 後SST活 性tよ 急 激 に 低 下 し 、 休 眠 塊 茎のSST活性は認められなかった。
ま た 、 休 眠 中 の キ ク イ モ 塊 茎 組 織 を 無 菌 組 織 培 養 し 、SSTの 活 性 誘 導 を 試 み た 。 培 養 組 織 を0.3Mス ク ロ ー ス 中 で 培 養 す る と 、SSTの 活 性 が 増 加 し60時 間 後 最 大 に 到 達 す る が 、0.3Mマ ニ ト ー ル で 培 養 し た 組 織 で はSSTの 活 性 誘 導 は 認 め ら れ なかった。
こ れ ら の 結 果 は キ ク イ モ に お け るSSTの 活 性 を フ ル ク タ ン 代 謝 活 性 と し て 表 わ す な ら ば フ レ ク タ ン 代 謝 は 塊 茎 発 育 と 著 し い 関 連 を 持 っ こ と に な る 。 キ ク イ モ の 開 花 初 期 に お け る 塊 茎 中 のSSTの 活 性 が 最 も 高 い こ と か ら こ の 期 の 塊 茎 を 用 い てSSTの 抽 出 精 製 純 化 を 試 み た 。 精 製 は 粗 抽 出 液 の 硫 安 塩 析 、 ゲ ル ろ
過、疎水逆相カラム、高速液体クロマトグラフイ及び二次元電気泳動法を用い た。 高速液 体ク ロマ トクラフイによる溶出液のSSTのKmは127 mMで、比活性 は97.4 nKat/mg Proteinであった。
等電点電気泳動法によるSSTの分離ではpIは5.0でその分子量は65，000であっ た。二次元電気泳動によるSDS‑PAGEでの分子量は46，700と21，300のニつのベ プチドj二分かれた。このことはSST酵素蛋白質が二本がヘテロダイマーから成り 立っことを示唆している。
また、46.7 kDaベプチドのN．末端アミノ酸配列はジャガイモ及ぴトマトの 70 kDaのインベルターゼと61％の相同性を示した。一方、21.3 kDaベプチドの N．末端はトウモロコシのインベルターゼ（55％相同性）及び63 kDaのニンジン のインベルターゼ（51％相同性）と類似性が高く、トマト及びジャガイモのイ ンベルターゼとの類似性の低いことを明らかとした。46.7 kDaベプチドはトマ ト及ぴジャガイモのインベルターゼのN．末端アミノ酸配列と、また21.3 kDaの べプチドはトウモロコシ、ニンジンのインベルターゼのC末端近傍のアミノ酸配 列と類似しており、一本のべプチドからヘテロダイマーが生成することを示唆 した。また、無変性二次元電気泳動によるウエスタンブロッテイングでは、
46.7 kDa及び21.3 kDaに対する抗体は一箇所に反応した。さらに等電点電気泳 動とSDSによる二次元電気泳動後のSSTとの抗体反応では46.7 kDa及び21.3 kDa にのみ免疫反応が認められたが、抽出液に直接SDSを加えて変性した蛋白質溶液 のSDSPAGEによるウエスタンブロッテイングの免疫学的検出によって70 kDaヽ 46.7 kDa及び21.3 kDaに免疫反応が認められ、モノマーのSSTペプチドの存在が 確認された。
これらの実験結果から70 kDaの不活性型のモノマーSSTが生成し、これが2本 のヘテロダイマーに分かれ再構築されて活性型SSTを形成すると結論できる。
スクロースを加水分解する酵素インベルターゼはすべての植物に分布してい るが、フルクタンを貯蔵する植物には分類学的にキク目、キキョウ目、イネ科 及ぴユリ目など特異的に限られた種類が含まれており、両者のアミノ酸配列の 類似性は興味ある結果である。
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授 喜 久田 嘉郎 副 査 教 授 生 越 明 副 査 教 授 上 田 一 郎 学 位 論 文 題 名
Physiological and enzymological studies on sucrose : sucrose lF fructosyltransferase (SST) in the tubers of He2ianthus t ひ berosMs L.
（ キ ク イ モ に お け る ス ク 口 一 ス ： ス ク 口 一 ス 1F フ ルクト シル トラ ンス フェラ ーゼ(SST)の生理学的及び酵素学的研究）
本論文は、図24、表7、引用文献81編、総ベージ数96頁からなり、4章をもっ て構成される。その他7編の参考論文を添えている。
フ ル ク タ ン 生 合 成 代 謝 の 鍵 酵 素 で あ る 、 ス ク ロ ー ス ： ス クロ ー ス1F フ ルク トシル トラ ンス フェ ラーゼ （以下SSTと略す）の活性変動をキクイモ (Helian曲us tuberos usL．野生種及び品種都城）の生育期、開花期、結実期及 び枯草期について季節学的、酵素学的に検討した。フルクタン代謝においてSST は2分子のスクロースよルイソケストースを合成する酵素であり、2分子のイソ ケ ス ト ー ス は フ ル ク タン ： フ ル ク タ ン フ ル ク ト シ ルト ラ ンス フェ ラーゼ (FFT)によ ルニ スト ースを 合成 する。このようにしてフルクタンの長鎖、例 えばイヌリンが合成される。またイソケストース｜まオリゴ糖甘味料として栄養 的に重要な資源である。
キクイモの花芽形成初期には塊茎中のSSTの活性及び塊茎の肥大は一時的に抑 えられるが、塊茎形成の初期、即ち開花期にはSST活性は最大であった。塊茎の 生育肥大は開花後期には最大に到達し、その後SST活性は急激に低下し、休眠塊 茎のSST活性は認められなかった。
また、休眠中のキクイぞ塊茎組織を無菌組織培養し、SSTの活性誘導を試みた。
培養組織を0.3Mスク‐ロース中で培養すると、SSTの活性が増加し60時間後最大 に到達するが、0.3Mマニトー少で培養した組織ではSSTの活性誘導は認められ なかった。
これらの結果はキクイモにおけるSSTの活性をフ渺クタン代謝活性として表わ す な ら ば フ ル ク タ ン 代 謝 は 塊 茎 発 育 と 著 しい 関 連 を 持 つ こ と に な る 。 キクイモの開花初期における塊茎中のSSTの活性が最も高いことからこの期の 塊茎を用いてSSTの抽出精製純化を試みた。精製は粗抽出液p硫安塩析、ゲルろ 過、疎水逆相カラム、高速液体クロマトグラフイ及び二次元電気泳動法を用い た 。高速 液体クロマトクラフイによる溶出液のSSTのKmは127 mMで、比活性 は97.4 nKat/mg Proteinであった。
等電点電気泳動法によるSSTの分離ではpIは5.0でその分子量は65．000であっ た。二次元電気泳動によるSDS‑PAGEでの分子量は46，700と21．300のニつのベ プチドに分かれた。このことはSST酵素蛋白質が二本のへテロダイマーから成り 立っことを示唆している。
また、46.7 kDaベプチドのN．末端アミノ酸配列はジャガイモ及ぴトマトの 70 kDaのインベ少ターゼと61％の相同性を示した。一方、21.3 kDaベプチドの N．末端はトウモロコシのインベルターゼ(55％相同性）及び63 kDaのニンジン のインベ，レターゼ（51％相同性）と類似性が高く、トマト及びジャガイモのイ ンベルターゼとの類似性の低いことを明らかとした。46.7 kDaベプチドはトマ ト及びジャガイモのインベルターゼのN．末端アミノ酸配列と、また21.3 kDaの べプチドはトウモロコシ、ニンジンのインベルターゼのC末端近傍のアミノ酸配 列と類似しており、一本のべプチドからヘテロダイマーが生成することを示唆 した。
これらの実験結果から70 kDaの不活性型のモノマーSSTが生成し、これが2本 のヘテロダイマーに分かれ再構築されて活性型SSTを形成すると結論できる。
スクロースを加水分解する酵素インベルターゼはすべての植物に分布してい るが、フJレクタンを貯蔵する植物には分類学的にキク目、キキョウ目、イネ科 及びュリ目など特異的に限られた種類が含まれており、両者のアミノ酸配列の 類似性は興味ある結果である。
よっ て、審査員一同tま、最終試験の結果と合わせて、本論文の提出者 伊勢島エリザ美智子は博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格があるもの と認定した。
