博 士 （ 薬 学 ） 山 本 哲 也
学 位 論 文 題 名
サイトカイン、増殖因子及びステロイドホルモンの シグナル伝達系のクロストークに関する研究
学位論文内容の要旨
1．はじめに
細胞 間 の情 報伝 達分 子 とし てサイトカイン，増殖因 子及びホルモン等の因子があ る。これら因子は 種 々の 細 胞か ら産 生さ れ ，細 胞の 増殖 や分 化 を含 めた 多彩 な生 物 活性 を示 す。生 体の恒常性はこれ らの 因子のバランスの上に成立し ている。そのため，これら 因子の生体における本来の機能を明らかに する ためには，単独因子のシグナ ル伝達系の解析では不十分 であり，因子間のクロストークの解析が重 要であると考えられる。本研究ではInterleukin‑6（IL‐6）11，Transforming growth factor‑p (TGF‑p)z)，ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン3） の シ グ ナ ル 伝 達 系 と の ク ロ ス ト ー ク の メ カ ニ ズ ム を 解 析 し た 。
2.IL‑6シZ空生堡達丞とZンドロゲンシグナル伝達丞堕2里ストーク4）
IL‑6はB細 胞刺 激 因子 とし て同 定さ れ たサ イト カイン であり，免疫応答，炎症反 応等の多彩な機能 を 有 す る 。IL‑6のIL‑6レ セ プ タ ー へ の 結 合 に よ りJAKキ ナ ー ゼ が 活 性 化 さ れ ， 転 写 因 子Signal transducer and activator of transcription3(STAT3）が核移行し，標的遺伝子の発現を誘導する。男性 ホルモンであるアンドロゲン（Dihydrotestostero孔e：DHT）は，その受容体であり転写活性を有するアンド ログンレセプター（Androgenreccptor：AR）と共に前立腺癌の進行に大きく関わっている。最近，前立腺 癌 の発 症にIL゜6の 関与 が知 ら れて いる 。そ こ で， 前立 腺癌 細胞 株LNCaPを 用い てIL―6とARシグ ナ ルの クロ ス 卜ー クを 検討 し たところ，IL．6刺激によっ て誘導されるC/EBP6遺伝子発 現はDHTの存在下 により増強され，IL．6とアンドロゲンシグナルのクロストークの存在が確認された。さらに，LNCaP細胞及 びヒ ト胎 児 性腎 癌細 胞株293Tを 用い たレ ポー タ ージ ーン アッ セイ に おい てDHTによ るS1、AT3転写活 性増 強作 用 が観 察さ れた 。 なお ，293T細 胞に お けるS1・AT3活性 化に はIL‐6に比 べその作用が強い lL．6ファミリーサイ卜カインに属するLeukemiainhibitoryfactor（LIF）を用いた。また，ドミナン卜ネガティ ブ型STAT3（DN‐S1・AT3）や抗アンドロゲン剤Flutamideにより，DHTによる 増強作用が消失したことか ら ，DHTがARを 介 し てSTAT3活 性 を 増 強 す る と 考 え ら れ た 。 さ ら に 種 々 の 欠 失 変異 型ARを 用い た 共沈実験からARのN末側領域がSn灯3との会合に必須であることがわかった。
3.IL‑6シZj‑ii達丞と三ろと里2ンシグj坐堡達丞のクロストーク ）
女性ホルモンであれるエストロゲン(17p‑EstradioI:E2)は，エストロゲンレセプター(Estrogen lceceptor:
ER)と共 に乳 癌や 骨 粗鬆 症へ の関 与が 知 られ てい る。これまで にE2はIL‑6誘導性の骨吸収を 抑制し，
骨代謝に寄与していることが報告されており，IL‑6とエストロゲンシグナルのクロストークの存在が示唆さ れ て い た 。 そ こ で ヒ 卜 乳 癌 細 胞 株MCF‑7を 用 い てIL‑6刺 激 に よ るSTAT3の 活 性 化とC/EBP6遺 伝 子 発現 に対 す るE2の効 果を 検討しとこ ろE2存在下で抑制作用が認 められ，IL‑6とエストロゲン シグナル のクロス トークの存在が確認された 。さらに，MCF‑7細胞及び293T細胞を用いたレポータージ ーンアッ セイ にお い てE2によ るSTAT3転写 活性 抑 制作 用が 観察 され た 。ま た， 抗エ ストロゲン剤Tamoxifenに よってこ のような抑制作用が消失し たことから，E2がERを介してSTAT3活性を抑制すると考え られた。
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さ ら に， 共 沈 実 験か らERと活 性 型STAT3で あるSTAT3‑Cの会合 が認め られた 。
生TGF‑p2Z‑ir達丞とエストログンシグj坐ニ堡達丞堕2ロストーク6川
TGF‑pは細胞 増殖抑 制，免 疫抑制， アポト ーシス 誘導等 の作用 を有す る増殖 因子で あり，そ のレセ プ タ ー 型キ ナ ー ゼ の活 性 化に より転 写因子Smadが核移 行し， 標的遺 伝子の発 現を誘 導する 。また ， TGF‑[3は細胞外マトリックスの産生促進やマトリックス分解酵素阻害因子の産生を介して細胞外マトリッ クス の蓄積 を誘導 し，組 織修復 や恒常 性の維 持に寄与 するこ とが知 られて おり，その過剰状態は動脈 硬化 や腎線 維症等 の組織 の線維 化を伴 う疾患 の要因と なると 考えら れる。 女性における糸球体硬化の 進 行遅延 はエス トロゲ ンによ るTGF‑p依存 性遺伝 子の発 現抑制 が関与 すると考 えられ ，両シ グナル の クロストークが示唆されていた。ヒト腎メサンギウム細胞においてTGF‑p刺激により誘導されるI型コラー ゲ ン 遺 伝子 発 現 へ のE2の 効果を 検討し たとこ ろE2.存在 下で抑 制作用 が認め られ，TGF‑pとエス トロ ゲン シグナ ルのク ロス卜 ークの 存在が 確認さ れた。さ らに，MCF‑7細胞や活性型レセプターであるTpR‑
I(T204D)を 導 入 し た293T細 胞 を 用 いた レ ポ ー ター ジ ー ン アッ セ イ に おい てE2によ るSmad転写 活性 抑制 作用が 観察さ れた。 また，Tamoxifenによ ってこ のような抑制作用が消失したことから，E2がERを 介 してSmad活 性を抑 制する と考え られた 。なお ，興味 深いこ とにTGF‑pシ グナル はE2によ り誘導 され るER転 写 活 性を 増 強 す る作 用 を 示 した 。 共 沈 実験 よ り 活 性型ERとSmad3の 会 合が 認 め ら れ，ERが Smad3のcoーfactorと して機 能する ことが示 唆され た。ま た，種 々の久 失変異型Smad3を用いた実験か らSmad3のC末 側 のMH2ドメ イン がTGF‑pシグ ナルと エス卜 ロゲン シグナ ルの双 方向の クロス 卜ークに おいて必須であることが明らかとなった。
墨：IL‑62Zナル伝達丞とTGF‑piZ士坐堡遭丞のクロストークル
炎 症 期 の 血中IL‑6の 上 昇は肝 細胞に おいて 種々の 急性期 タンパク を誘導 するが ，TGF‑[3は これに 対し て正負に 作用す ること が知ら れてい る。近 年，神 経上皮 細胞にお いてLIFとTGF‑pスーパーファミ リーに属するBone morphogenetic protein‑2のシグナルのクロストークが認められ，各々のシグナル伝達 分 子で あ るSTAT3とSmadlが 核内でp300を介し て複合 体の形 成する ことが明 らかに なった 。そこ で，
ヒ卜 肝癌細胞 株Hep3Bを 用いてIL‑6とTGF‑pシ グナル のクロ ス卜ーク をレポ ータージーンアッセイで検 討し たところIL‑6刺激 によっ て誘導 されるSI、AT3の活性化はTGF．B存在下で増強され，IL・6とTGF‐ Bシ グ ナ ルの ク ロ ス トー クの 存在が 確認さ れた。293T細胞に おけるDN．STAT3や 種々のSmadを用い た 解析 から，TGF．pはSmad3を 介してS1鮒3活 性を増強 するこ とが明 らかと なった。この増強作用はp300 の 過剰 発 現 に よっ て 上 昇し ，共沈 実験よ りSn廿3はp300を介 してSmad3と 結合す ること が明ら かとな った。
6．まとめ
本研究によりIL‑6シグナルとそれに影響するシグナルのクロストークのメカニズムが明らかとなった。
す なわち ，前立 腺癌細 胞にお いて認 められた アンド ロゲン シグナ ルによ るIL‑6シグナルの増強は両者 の シグナ ル伝達 分子で あるARとSTAT3が会合 するこ とにより生じることが示された。また，乳癌細胞で 認 められ たエス トロゲ ンシグ ナルに よるIL‑6シ グナル の抑制 はERとSTAT3の 会合に よるこ とが示 され た 。また，腎メサンギウム細胞や乳癌細胞で認められたエストロゲンシグナルによるTGF‑pシグナルの抑 制 はERがSmad3とMH2ドメ インを 介して 会合す ること により 生じるこ とが示 された。さらに，肝癌細胞 に お い て 認 め ら れ たTGF‑pシ グ ナ ル に よ るIL‑6シ グ ナ ル の 増 強 はSmad3とSTAT3がp300を 介 して 会合することにより生じることが明らかとなった。サイ卜カイン，増殖因子及びステロイドホルモンの作用は 前 立 腺 癌 ，乳 癌 ， 骨 粗鬆 症及 び糸球 体硬化 症等の疾 患の発 症や進 行に複 雑に影 響し合 いなが ら深く 関 与して いる。 これら シグナ ルクロス卜ークに関する研究は生体内での種々の因子の本来の機能や疾患 の 発症を 考える 上で非 常に重 要であ る。本研 究で確 立した 各種シ グナル 伝達系の再構築系やそれらを 用 いるこ とによ り得ら れた知 見は今 後のシグ ナル伝 達分子 を標的 にした 種カの治療薬の開発に極めて 有 用であ ると考 えられ る。こ れらの 結果からARがSTAT3のco‑activatorとして機能することが示唆され
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た。ERがSTAT3のco‑factorとして機能するこ とが示唆された。
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5． 6． 7． 8．
Matsuda, T. et. al. (2000) Cytokine Reference (Oppenheim, J. J., Feldmann, M., Eds), pp537‑563, Academic Press, London.
Sbi, Y. et. al. (2003) Cell 113, 685‑700.
Mangelsdorf, D. J. et. al. (1995) Cell 83, 835‑839.
Matsuda, T., Junicho, A., Yamamoto, T. et. al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 283, 179‑187.
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Matsuda, T., Yamamoto, T. et. al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 42908‑42914.
Yamamoto, T. et. al. (2002) Eridocrinology 143, 2635‑2642.
Yamamoto, T. et. al. (2001) FEBS Lett. 492, 247‑253.
‑ 91一
学位論文審査の要旨 主 査 教 授 松田 正 副 査 教 授 野村 靖幸 副査 助教授 高橋和彦 副査 助教授 大熊康修
学 位 論 文 題 名
サイトカイン、増殖因子及びステロイドホルモンの シグナル伝達系のクロストークに関する研究
細胞間の情報伝達分子としてサイトカイン，増殖因子及びホルモン等 の因子がある。これら因子は種々の細胞から産生され，細胞の増殖や分化 を含めた多彩な生物活性を示す。生体の恒常性はこれらの因子のバラン スの上に成立している。そのため，これら因子の生体における本来の機 能を明らかにするには，単独因子のシグナル伝達系の解析では：不十分で あり，因子間のクロストークの解析が重要であると考えられる。本研究 では
IL
−6
，TGF‑6，ステロイドホルモンのシグナル伝達系とのク口スト ークのメカニズムを解析した。1
．11‑6
シグナル伝達系とアンドロゲンシグナル伝達系のクロストークIL
−6
はB細胞刺激因子として同定されたサイトカインであり，免疫応 答，炎症反応等の多彩な機能を有する。11‑6の11‑6レセプターへの結合 により転写因子STAT3
が活性化され，標的遺伝子の発現が誘導される。男性ホルモンであるアンドロゲンは，その受容体であり転写活性を有す る
AR
と共に前立腺癌の進行に大きく関わっている。最近，前立腺癌の発 症 にIL−6
の関与することも報告されており、前立腺癌細胞株LNCaPを 用いて11‑6刺激によって誘導されるC/ EBP6遺伝子発現に対するアンド ロゲンの効果を検討したところアンドロゲン存在下で増強作用が認めら れ，11‑6
とアンドロゲンシグナルのクロストークの存在が確認された。ま た，LNCaP細胞及びヒト 胎児性腎癌細 胞株
293T
を用いたレポーター ジーンアッセイにおぃてアンドロゲンのSTAT3転写活性増強作用が観察 され，ドミナントネガテイブ型STAT3
や抗アンドロゲン剤を用いた解析 から，この現象にAR
とSTAT3
が介することが明らかになった。さらに，種 々 の 欠 失 変 異型
AR
を 用 いた 共沈 実 験か らAR
のN
末 側領 域がSTAT3
との会合に必須であることがわかった。2
．11‑6
シグナル伝達系とェストロゲンシグナル伝達系のクロストーク女性ホルモンであるエストロゲンはその受容体であるERと共に乳癌や 骨粗鬆症への関与が知られている。これまでにエストロゲンは11‑6誘導
― 92 ‑
性の骨吸収を抑制し，骨代謝に寄与していることが報告されており，IL‑
6
とエストロゲンシグナルのクロストークの存在が示唆されていた。そこ で ヒ ト 乳 癌細 胞 株MCF
−7
を用 いて11‑6
刺 激に よるSTAT3
の 活性 化とC/ EBP6
遺伝子発現に対するエストロゲンの効果を検討しところエストロ ヴン存在下で抑制作用が認められ，11‑6とエストロゲンシグナルのクロ スト ーク の存在 が確 認された。さらに，MCF‑7
細胞及び293T
細胞を用 いたレボータージーンアッセイにおいてエストロゲンによるSTAT3転写 活性 抑制 作用が 観察 され，エストロゲンがER
を介してSTAT3
活性を抑 制す ると 考えら れた 。さらに，共沈実験からER
と活性型STAT3
の会合 が認められた。3
． TGF‑pシグナル伝達系とエストロゲンシグナル伝達系のク口ストークTGF‑p
は細胞増殖抑制，免疫抑制，アポトーシス誘導等の作用を有す る増殖因子であり，そのレセプター型キナーゼの活性化により転写因子Smad
が核 移行し ，標 的遺伝子の発現を誘導する。また，TGF‑p
は細胞 外マトリックスの産生促進やマトリックス分解酵素阻害因子の産生を介 して細胞外マトリックスの蓄積を誘導し，組織修復や恒常性の維持に寄 与することが知られており，その過剰状態は動脈硬化や腎線維症等の組 織の線維化を伴う疾患の要因となると考えられる。女性における糸球体 硬化の進行遅延はエストロゲンによるTGF‑p依存性遺伝子の発現抑制が 関与すると考えられ，両シグナルのクロストークが示唆されていた。ヒ ト腎メサンギウム細胞においてTGF‑p
刺激により誘導されるI型コラー ゲン遺伝子発現へのエストロゲンの効果を検討したところェストロゲン 存在下で抑制作用が認められ，TGF‑p
とエストロゲンシグナルのクロス トー クの 存在が 確認 された 。さ らに，MCF‑7
細胞 や活性 型TGFレセプ ターを導入した293T細胞を用いたレポータージーンアッセイにおいてエ ストロゲンによるSmad
転写活性抑制作用が観察され，エストロゲンがER
を介してSmad
活性を抑制すると考えられた。さらに，共沈実験より 活 性 型ER
とSmad3
の会 合 が 認 め ら れ ，ER
がSmad3
の コ フ ん クタ ーと して機能することが示唆された。また，種々の欠失変異型Smad3を用い た 実 験 か らSmad3
のC
末 側 のMH2
ド メ イ ンがTGF‑p
シ グ ナ ル とエ スト ロゲンシグナルの双方向のクロストークにおいて必須であることが明ら かとなった。4
．11‑6
シ グ ナ ル 伝 達 系 とTGF‑p
シ グ ナ ル 伝 達 系の ク ロ ス ト ー ク炎症期の血中11‑6の上昇は肝細胞において種々の急性期夕ンバクを誘 導するが，
TGF‑p
はこれに対して正負に作用することが知られている。近年，神経上皮細胞において
LIF
シグナルとTGF‑pスーパーファミリー に属するBMP‑2
のシグナルのクロストークが認められ，各々のシグナル 伝 達 分 子 であ るSTAT3
とSmadl
がp300
を 介 し て 複合 体 の 形 成す るこ とが 明ら かにな った 。そこで，ヒト肝癌細胞株Hep3B
を用いて11‑6
とTGF‑6
シグナルのクロストークをレボータージーンアヅセイで検討した とこ ろ11‑6
刺激 によ って誘 導さ れるSTAT3
の 活性 化はTGF‑p
存在下で 増強され，11‑6
とTGF‑p
シグナルのクロストークの存在が確認された。さ ら に 、
TGF‑B
に よ るSmad3
を 介 し たSTAT3
活 性 の増 強 はp300
の 過 剰 発 現 に よっ て 上 昇 し ， 共 沈実 験 よ りSTAT3
はp300
を 介 してSmad3
と結合することが明らかとなった。サイトカイン，増殖因子及びステロイドホルモンの作用は前立腺癌，
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乳 癌， 骨粗鬆 症及 び糸 球体 硬化症 等の 疾患 の発症 や進行に複雑に影響し 合いながら深く関与しており，本研究で確立した各種シグナル伝達系の再 構 築系 やそれ らを 用い るこ とによ り得 られ た知見 は今後のシグナル伝達 分 子を 標的に した 種々 の治 療薬の 開発 に極 めて有 用であると考えられる
この ように 山本 哲也 は精 力的に クロ スト ークの メカニズム解析を行い
，多、くの成果を挙げた。これらの業績は山本哲也に博士f薬学）の学位授 与に十分値し，推薦するものである。
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