博士（医学） 柳 紘子 学位論文題名

     博士（医学）   柳   紘子 学位論文題名

頭頚部扁平上皮癌におけるシグナル伝達アダプター分子     CRKL の機能に関する研究

学位論文内容の要旨

【 背 景 と 日 的 】 頭 頸 部 悪 性 腫 瘍 は 、 口 腔 、 咽 頭 、 喉 頭 、 鼻 副 鼻 腔 、 唾 液 腺 、 甲 状 腺 な ど を 含 み 、 最 も 頻 度 の 高 い 組 織 型 は 扁 平 上 皮 癌 で あ る 。 多 く は 局 所 再 発 、 リ ン パ 節 転 移 、 遠 隔 転 移 を お こ し 、 そ の 予 後 は 不 良 で あ り 、 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 の 発 癌 に 関 与 す る 分 子 機 構 を 解 明 し 、 新 規 治 療 薬 の 発 見 を す る こ と は い ま だ 重 要 で あ る 。 一 方 シ グ ナ ル 伝 達 ア ダ プ タ ー 分 子CRK (CT10 regulator of kinase)は 、 様 々 な ヒ ト 悪 性 腫 瘍 に お い て 悪 性 化 に 関 与 す る 重 要 な 分 子 で あ る こ と が す で に 知 ら れ て い る 。CRK‑like (CRKL)は 、CRKの 血 球 系 細 胞 優 位 の 相 同 体 で あ り 、 慢 性 骨 髄 性 白 血 病 に お い てBCR‑ABLチ ロ シ ン キ ナ ー ゼ に よ ル リ ン 酸 化 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 し か し 、 そ の 非 血 球 系 腫 瘍 に お け る 役 割 は い ま だ 明 ら か に さ れ て い な い 。 本 研 究 に お い て は 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 に お け るCRKLの 腫 瘍 悪 性 化 に 関 す る 役 割 を 検 討 し た 。

【 材 料 と 方 法 】 北 海 道 大 学 病 院 耳 鼻 咽 喉 科 に て2000年 か ら2005年 に 手 術 さ れ た 舌 癌35 症 例 に お い て 、CRKLお よ びCRKの 発 現 と 、 臨 床 デ ー タ と の 相 関 を 評 価 し た 。 免 疫 組 織 染 色 を 評 価 す る た め に 、 染 色 強 度 を0か ら3ま で の4段 階 評 価(negative:ニ0，weak=l， moderate=2，strong=3)と し 、0‑1をlow level、2‑3をhigh levelと し た 。 陽 性 細 胞 率 は0 か ら3ま で4段 階 評 価(0％=0，1‑25％=1，26‑50％=2，>50％=3)と し た 。 染 色 強 度 と 陽 性 細 胞 率 の 合 計 をtotal score (0‑6)と し 、 染 色 強 度0‑1ま た はtotal score 0‑3をlow level、total score 4‑6をhigh levelと 解 釈 し た 。 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 と し てHSC‑2、HSC‑3、HSC‑4、 Ca9‑22、OSC20お よ びSASを 使 用 し た 。 タ ン パ ク の 発 現 を 、 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 を 用 い て 解 析 し 、 次 にCRKLま た はCRKと 標 的 分 子 の 結 合 の 有 無 に つ い て 免 疫 沈 降 法 で 確 認 し た 。HSC‑3ま た はHSC‑4細 胞 株 に お い て 、 レ ン チ ウ イ ル ス を 用 い たRNAinterference (RNAi)に よ り 、 CRKL、CRKIIま た はCRKI/IIが 恒 常 的 に ノ ッ ク ダ ウ ン さ れ た 細 胞 株 (CRKLi1019，CRKLi1064，CRKLi1205，CRKIIi847，CRKI/IIi550)を 作 成 し た 。 表 現 型 を 評 価 す る た め に 、 細 胞 運 動 能 、 細 胞 接 着 能 、 細 胞 増 殖 能 、 螢 光 免 疫 染 色 に よ る 細 胞 接 着 斑 お よ び ヌ ー ド マ ウ ス を 用 い た 血VI VOで 腫 瘍 形 成 能 の 検 討 を 行 っ た 。 ま た 、 増 殖 関 連 因 子 の り ン 酸 化 と 、 プ ル ダ ウ ン ア ッ セ イ を 用 い た 活 性 化 型Ras、Rapl、Raclの 解 析 を 行 っ た 。 さ ら に 、CRKL、CRKIIま た はCRKI/IIノ ッ ク ダ ウ ン に お け る 細 胞 増 殖 能 お よ び 細 胞 接 着 能 と 、CRKIIノ ッ ク ダ ウ ン に お け る 活 性 化 型Raplの 解 析 を 行 っ た 。

【 結 果 】1） 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 組 織 で は 正 常 舌 組 織 と 比 べ てCRKLお よ ぴCRKの 高 発 現 を 認 め た 。CRKL・ CRKの 染 色 強 度 お よ びtotal scoreは 、 臨 床 病 期 ・T分 類 ・ リ ン パ 節 転 移 ・ 生 存 率 な ど の 臨 床 デ ー タ と は 相 関 し な か っ た 。2）6つ の 頭 頚 部 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 に お い て 、 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に てCRKL、CRKお よ ぴ そ の 関 連 分 子 の 発 現 を 認 め た 。 特 に 、HSC‑3、HSC‑4細 胞 株 に お い て 、C3GとDOCK180の 発 現 の 増 加 が み ら れ た 。3冫 免 疫 沈 降 法 に て 、CRKLとC3Gお よ ぴp130Cas、CRKとp130Casの 結 合 を 認 め た 。 し か し 、 CRKLとDOCK180、 CRKと C3Gお よ び DOCK180と の 結 合 は み ら れ な か っ た 。4） CRKL ノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞(HSC‑3，HSC‑4)は 、I型 コ ラ ー ゲ ン お よ び フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン に 対 し て 有

‑ 307−

意 な接着能の減少がみられたものの、ポリエルリジンに対しては変化を認めなかった。ま た 螢光免疫染色法にて、上記細胞外基質に対して接着後にパキシリンを観察したところ、

い ず れに おい ても

CRKL

ノッ クダ ウン細胞では細 胞接着斑形成の減少を認めた。5）プル ダ ウ ンアッセイにて 、CRKLノックダウン細胞において活性化型Raplの減少が みられた。

以 上 のこ とか ら、

CRKL

はC3G‑Raplを 介し たイ ンテ グリ ン依 存性細胞接着を 制御してい る と 考えられた。ま た血清刺激下のプルダウンアッセイにおいては、Raclで は活性化型 は 認 めら れず 、Rasで は活 性化 型 は認められるものの、コントロールとCRKLノックダウ ン に おい ては 差が 認め られ なか った 。6）

 HSC‑3

、

HSC‑4

細 胞株のCRKLノッ クダウン細 胞 に おいて、細胞運 動能、増殖能の低下を認めた。7）ヌードマウスの皮下にHSC‑3細胞 株 を 注入したところ 、CRKLノックダウン細胞ではコントロールと比ベ、腫瘍 形成能の低 下 を 認め た。

8

）

 CRKII

、

CRKI/II

お よび

CRKL

ノッ クダ ウン において、ほば 同程度に細 胞 増 殖 能 の 低 下 を 認 め た 。

9

） 細 胞外 基質 に対 し、

CRKII

と比 べて

CRKL

ノッ クダ ウン 細 胞 にお いて 接着 能の 低下 を認 めた。10) CRKIIノックダウン細胞における

Rapl

のプル ダ ウ ンア ッセ イに おい て、 コン トロールと比べ てCRKIIノックダウンにおい ては、活性 化 型Raplの変化を認めなかった。

【 考 察】

CRK

は、 免疫 組織 染色 に て様 々な 癌や 肉腫 で過 剰発 現し、さらにCRKノックダ ウ ン により細胞接着 、運動、増殖および血函VOの造腫瘍能を含めた複数の癌 化に関わる 機 能 が低 下す るこ とが 報告 され ている。本研究 は、CRKLもCRKと同様に、細 胞運動能、

接 着能、増殖能および由wvoの 造腫瘍能を制御していることを明らかにした。実際、CRKL は ー つ のSH2と ニつ のSH3ドメ イン を持 ち、

CRKII

と高 い配 列類 似性 を持 った め、 機能 と いう点においても類似している可能性が考えられる。一 方、免疫沈降では、HSC‑3細胞 で は

C3G

の 優 勢 な 結 合 タ ン パ ク は 、CRKでは なく

CRKL

であ るこ とが わか った 。こ れら の 結 果 から 、CRKと

CRKL

の機 能的 優 位性 は、 組織 によ りま たは 細胞 によ り異 なる こと が 想 定 され た。

CRKL

とCRKの 遺伝 子 座は 完全 に異 なっ てお り、 遺伝 子レ ベル では 、頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 の 癌 化 に お い て は

CRKL

が よ り 重 要 で あ る の か も し れ な ぃ 。

  C3G

はRaplの グア ニン ヌク レオ チ ド交 換因 子(GEF)であ り、

CRK

を 通し て活 性化 され る ことが報告されている。またRaplはインテグリン依存性 細胞接着に寄与しており、C3G 依 存 性 のRapl活 性化 は細 胞接 着、 細胞 播種 を制 御し てい る。 本 研究 では 、CRKLと

C3G

の 結 合が 認め られ 、CRKLノ ック ダウ ンで は活 性化 型Raplが 減少し、細胞接 着・細胞増 殖 も 低 下 し て い る こ と か ら 、 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 に お い て は 、 イ ン テ グ リ ン

‑p130Cas.CRKL‑C3G‑Rapl

シ グナ ル経 路が 細胞 接着 を通 して 細胞増殖に重要 な役割を果 た し て い る と 考 え ら れ た 。 対 照 的 に 、

DOCK180

は

Rac

の

GEF

で 、

CRK

に よ り 活 性 化 さ れ ることが報告されているが、プルダウンアッセイにおいて活性化型Raclは認められず、

免 疫 沈 降 に て

DOCK180

と

CRKL

、

CRK

の 結 合 は 認 め ら れ な か っ た 。こ れら より 、HSC‑3 細 胞 に おい ては 、CRKLに 関連 する 癌化 の機 能に はDOCK180は直 接関 連し なぃ こと が示 さ れた。

【結 論】

CRKL

は細 胞増 殖能 、運動能、接着能およびin vivo造腫瘍能に関与し、特に 細 胞接着においては、C3G‑Rapl経路を介してインテグリン依存性に細胞接着を制御して い ると 考え られ た。 一方 、CRKはCRKLと 同様 に細 胞増 殖能 を 制御 する もの の、 細胞接 着 に お い て は

CRKL

の ほ う が優 位で ある と思 われ た。 本 研究 の結 果か ら、

CRKL

は扁 平上 皮癌における抗癌剤の新規タ ーゲットになりえる。今後は、CRKLの細胞増殖、接着、 運 動などに関連するシグナル経路をさらに詳細に解析し、薬剤スクリーニングにより頭頸部 扁平 上皮 癌に 対す るCRKLに 関 連す るシ グナ ルを 特異 的に阻害する新規治療薬の開発 が 期待される。

―308ー

学位論文審査の要旨 主査 副査

副査 副査

教授 教授 教授 准教授

大 場 雄 介 福 田    諭 佐 邊 壽 孝 濱 田 淳 一

学 位 論 文 題 名

頭頸部扁平上皮癌におけるシグナル伝達アダプター分子     CRKL の機能に関する研究

  

頭頸部扁平上皮癌の進行期の予後は不良であり、人が生きる上で重要な機能が集中する 部位に発生する腫瘍という特異性から、外科的切除にも限界がある。また扁平上皮癌に対 する有効な化学療法、分子標的治療薬は限られているため、頭頸部扁平上皮癌の発癌や悪 性化に関与する分子機構を解明し、新規治療法を開発することは本疾患に立ち向かう上で 重要な課題である。一方、シグナル伝達アダプター分子CRK (CT10 regulator of kinase)は、

様々なヒト悪性腫瘍の悪性化に関与する重 要な分子であることが知られている。CRKファ ミリーには血球系細胞での発現が有意なCRKの相同体であるCRK‑Iike (CRKL)があり、慢 性骨 髄性 白血 病細 胞において

BCR‑ABL

チロシンリン酸化キナーゼの 基質となるなど血球 系での機能が注目されているが、非血球系腫瘍での役割はいまだ明らかにされていない。

本 研 究 に お い て は 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 の 悪 性 化 に お け る

CRKL

の 役 割 を 検 討 し た 。

  

発 表者 は、 ヒト 頭頸 部扁 平 上皮 癌組 織に おい てCRKLお よび

CRK

が 高発 現し、かっそ れらの高発現群では有意差はないものの粗生存率が低い傾向にあることを示した。また、

CRKL

が細胞増殖能、運動能、インテグリン 依存性接着能およびin vivo造腫瘍能を制御し てい るこ とを 明ら かに した 。 免疫 沈降 では

CRKL

がC3Gおよびp130c と結合しているこ と、 さら に

CRKL

ノ ック ダウ ン によ って 細胞 接着依存性Rapl活性化 が抑制されることか ら、インテグリン‑p130Cas‑CRKL‑C3G‑Raplシグナル経路が細胞接着を制御することを明 らかにした。以上から、頭頸部扁平上皮癌 においてCRKLは腫瘍の悪性化に重要な役割を 持つ可能性があると考えられた。

  

発表後、副査の福田教授から、進行期の頭頸部扁平上皮癌では治療成績が低いため、そ の悪性化に関わる研究が重要であるとのコメントがあった。また、用いた頭頸部扁平上皮

―309−

癌 組 織 の 亜 部 位 お よ び 治 療 の 統 一 性 に つ い て 、 免 疫 染 色 に お い て 核 ・ 細 胞 質 の 両 方 が 染 色 さ れ て い る 点 に 関 し て も 質 問 が あ っ た 。 さ ら に 、CRKLが 予 後 因 子 、 治 療 標 的 分 子 の ど ち ら と 考 え て い る の か と い う 質 問 と 、 免 疫 染 色 と 臨 床 デ ー タ に つ い て 有 意 差 を 認 め な か っ た に も か か わ ら ず 新 規 治 療 標 的 と な り う る と 断 言 し て よ い も の か と の コ メ ン 卜 が あ っ た 。 次 に 副 査 の 佐 邊 教 授 か ら 、 CRKLお よ びCRKの 発 現 プ ロ フ ァ イ ル に つ い て 質 問 が あ っ た 。 ま た 本 研 究 の 出 口 は 何 か 、 ， 生 存 率 に 差 が な い の に 本 研 究 を 継 続 す る の は 何 故 か 、 現 在 は 一 因 子 で 癌 を 治 療 す る こ と は 困 難 で 複 数 の 因 子 が 絡 む も の で あ る と 考 え ら れ 、 本 研 究 で は CRKLの 一 因 子 に つ い て 検 討 し て い る が 、 本 研 究 の 最 終 目 標 は 何 か 、 な ど 現 在 の 癌 研 究 に 対 す る 基 本 的 な 考 え 方 や 姿 勢 に つ い て の 意 見 が あ っ た 。 続 い て 副 査 の 濱 田 准 教 授 か ら は 、 正 常 組 織 に お け るCRKLお よ びCRKの 発 現 パ タ ー ン の 違 い ・ 機 能 の 違 い に つ い て 、 免 疫 染 色 で り ン 酸 化CRKLの 染 色 性 に つ い て も 検 討 し た か と い う 質 問 と と も に 、 リ ン 酸 化 CRKLだ け の 発 現 と 生 存 率 を 検 討 し た ら 生 存 率 に 差 が で る の で は な い か と の コ メ ン ト が あ っ た 。 ま た 、CRKL陽 性 か つCRIく 陽 性 症 例 の 粗 生 存 率 に つ い て の 質 問 とCRKLお よ びCRIく の 細 胞 内 で の 局 在 と 核 内 で の 機 能 に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 最 後 に 主 査 の 大 場 教 授 か ら 、 イ ン テ グ リ ン‑CRKL‑C3G‑Raplが 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 に お け る メ イ ン の シ グ ナ ル 伝 達 経 路 で あ る と 考 え て も よ い か と い う 質 問 が あ り 、 そ の 上 でC3G、Rapl、CRKの ホ モ 欠 失 マ ウ ス の 表 現 形 に 関 す る 質 問 が あ っ た 。 さ ら に そ れ ら ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス の 表 現 形 に 基 づ ぃ て 、 CRKの 機 能 を 抑 制 す る よ う な 治 療 法 の 是 非 に 関 す る 議 論 が な さ れ た 。 ま た 、 正 常 と 違 う 癌 細 胞 特 異 的 な シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が あ り 、 そ の よ う な 違 い を 治 療 標 的 と し て 研 究 対 象 と し て は ど う か な ど 、 研 究 に 対 す る 考 え 方 に つ い て 意 見 が あ っ た 。 発 表 者 は い ず れ の 質 問 に 対 し て も 自 身 が 持 つ 予 備 的 デ ー タ や 過 去 の 文 献 を 引 用 し つ つ 適 切 に 回 答 し 、 ま た 提 起 さ れ た コ メ ン ト や 意 見 に 対 し て も 真 摯 に 議 論 し た 。

  こ の 論 文 は 、 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 に お い てCRKLが 悪 性 化 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と を 示 し て お り 、 今 後 の 頭 頸 部 扁 平 上 皮 癌 の 予 後 因 子 、 治 療 方 針 決 定 要 素 、 あ る い は 新 規 治 療 標 的 探 索 の 基 盤 に な る も の と 期 待 さ れ る 。

  審 査 員 一 同 は こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 、 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

―310―