橋 本 研 二 ， 山 本 浩 司

アンドロゲンレセプター・金コロイド法 による電子顕微鏡学的研究

奈良県立医科大学第 2 解剖学教室

中 山 正 成 ， 奥 田 喜 一 ， 別 府 謙 一

橋 本 研 二 ， 山 本 浩 司

ELECTRON MICROSCOPIC STUDY O N   COLLOIDAL GOLD  LABELED ANDROGEN RECEPTOR 

MASANARI NAKAYAMA ，  YOSHIKAZU OKUDA ，  KEN‑ICHI BEPPU ， 

KENJI HASHIMOTO and HIROSHI Y  AMAMOTO  T h e  2nd D e p a r t m e n t  0 1  Anatomy ，  Nara M e d i c a l  U n i v e r s i t y  

R e c e i v e d 乱 ! f a y2 9 ，  1 9 8 9  

Summary:  The t r a n s f o r m e d  t y p e  androgen r e c e p t o r  was i s o l a t e d  from r a t  t e s t i s  w i t h   a  d i h y d r o t e s t o s t e r o n e  S e p h a r o s e  a f f i n i t y  c o l u m n .   I t s  p h y s i o l o g i c a l  c h a r a c t e r s  were c o n ‑ f i r m e d  t o  r e t a i n  an androgen b i n d i r i g  and a  DNA b i n d i n g  a c t i v i t y  by b i o c h e m i c a l  and  h i s t o c h e m i c a l  s t u d i e s .   The m o l e c u l a r  w e i g h t  o f  t h i s  androgen r e c e p t o r  had a b o u t  6 8 ， 0 0 0   d a l t o n s  w i t h  g e l  chromatography ，  and was c o n f i r m e d  t o  c o n s i s t  o f  a  monomer w i t h  6 5 ， 0 0 0   d a l t o n s  by SDS‑P  AGE a n a l y s i s .   I n  an e l e c t r o n  m i c r o s c o p i c  s t u d y  w i t h  r a t  t e s t i s  u s i n g   c o l l o i d a l  g o l d  l a b e l e d  androgen r e c e p t o r ，  from s p e r m a t o g o n i a  t o   round s p e r m a t i d s  and  S e r t o l i  c e l l s ，  t h e y  had a  b i n d i n g  a c t i v i t y  a g a i n s t  t h e  androgen r e c e p t o r  i n  t h e i r  c e l l  n u c l e i ，  s o  t h e  androgen hormones may p l a y  an i m p o r t a n t  r o l e  n o t  o n l y  i n  S e r t o l i  c e l l s  b u t  a l s o  i n   s p e r m a t o g e n i c  c e l l  l i n e s .  

Index Term 自

androgen r e c e p t o r ，  c o l l o i d a l  g o l d  method ，  e l e c t r o n  m i c r o s c o p i c  s t u d y  

緒

ヨ

n u c l e a r  m a t r i x ' ) 等が考えられているが，最近マウス乳 癌ウイノレス (MMTV) の研究

では DNA 自身が a c c 巴 p ‑

アンドロゲンの生理学的機能は多種多様で，その一つ t o r  s i t e s であるという報告がある.しかしアクセプター として精子形成に皐丸性アンドロゲンが重要な働きをし 部位については現在のところ不明な点が多く残されてい ている.このアンドロゲンの発現作用は他のステロイド る。この論文は c o l l a i d a l ‑ g o l d 標識した活性型の t r a n s

ホノレモンと同様の機作で行われていると考えられている f o r m e da n d r o g e n  r e c e p t o r を用いて， a c c e p t o r  s i t 巴号が エストロゲン等の最近の研究刊こよれば，核内にある非 DNA であることを組織化学的に示唆した研究結果を報 活性のレセプターに拡散により核内に入ってきたステロ 告する.

イドホルモンが結合し，複合体を形成して活性化される(1)材料と方法 この活性化された複合体がクロマチン上のアクセプター ( a )   材料

部位に結合して標的細胞特異的な遺伝子発現を行うと考 W i s t e r  r a t   (オス) 2 5 0  g はオリエンタノレ酵母紛(大阪〕

えられている.このアクセプタ一部位の仮説として n o n ‑ より， t e s t o s t e r o n e は S i g m a ， 5 a ‑ d i h y d r o t e s t o s t 巴 r o n ・ 巴

h i s t o n 巴 p r o t 巴 i n

， D N A ' ) ，  D N A ‑ p r o t e i n   c o m p l e x ，  BSA は Makorc h e m i c a l  C o 目 ( I s r a e ] ) より求めた.

( 3 1 6 )   中 山 正 成 ( 他 4 名 〉

( b ) 方法 指標として測定した.

( 1 ) テストステロンレセプターの単離 (  2  )  Androgen r 巴 c e p t o r の物理化学的性質 ( 1 ‑a)  c y t o s o l の単離 ( 2 ‑ a ) 電気泳動法

レセプターは Chang ( 1 9 7 6 ) 6 ) らの方法に基づいて若干 電気泳動は Laemmli( 1 9 8 2 ) 7 ) らの方法で行い，ラウリ 修飾した方法で単離した.方法は W i s t e rr a t の精巣を ノレ硫酸ナトリウムを含む 1 2%  P o l y a c r y l a m i d e  ‑ 5 0  m M   T r i s ‑HCl ，  1 . 5  mMβ‑meracaptoethanol ，  2 0  %  0 . 2 5  %  B i s a c r y l a m i d 巴ゲノレで BPB がゲノレ下端に来る g l y c e r i n ，  5  m M   phenylm 巴 t h y l s u l f o n y lf l u o r i d  (PMSF)  まで泳動を行った.ゲノレは 5% Coomassi b r i l l i a n t  b l u 巴

(pH 7 .4)で Wahringb l e n d e r を用いてホモゲナイズ

7 . 5 % 酢 酸 ‑20% エタノーノレで、染色した.分子量マ し ， 1 0 5 ， 000X g  6 0 分 ， 2  ' c で超遠心して c y t o s o l 分画 一カーは P h o s p h o r y l a s 巴 b(M. W.=97.500) ，  b o v i n e   を得た serumalbumin (M. W.=68 ， 0 0 0 ) ，  o v a l b u m i n  ( M .  W. 

( 1 ‑ b )   DEAE‑ セノレロースグロマトグラフィー =45 ， 0 0 0 ) ，  t r y p s i n   i n h i b i t o r   ( M .  W ェ 3 0 ， 5 0 0 ) ， c y t o

DEAE 【セノレロース ( D E ‑ 5 2 ) (Whatman C o . ) を蒸留 chrome c  (M. W ニ 1 2 ， 5 0 0 ) を用いた.

水で十分洗浄した後，活性化した DEAE‑ セノレローノレを く 3) 電子顕微鏡学的研究 5 0  m M  T r i s

HCl ， 1 . 5  m M  EDTA ，  1 . 5  m M  β

( 3 ‑ a ) 固定，包埋

m e r c a p t o e t h a n o l ，  5  m M   PMSF (pH 7 . 4 )   (TEM) に ラットの精巣，肝臓，小腸の 2mm

の細片塊を 2 . 5% 

平衡化した. C y t o s o l 分画をカラムに吸着させ， TEM 緩 g l u t a r a l d 巴 hyde‑4% p a r a f o r m a l d e h y d 巴を含む O.lM 衝液で溶出液の OD2 8 0 が 0 付近になるまで十分洗浄後 p h o s p h a t eb u f f e r ( p H  7 . 4 ) で 4 ' c ，  2 時間固定し， 0 . 2 5   Rec 巴 p t o r 分画を 0 . 3M KCl を含む TEM 緩衝液 (pH M  s u c r o s 巴 で十分洗浄した後 LR w h i t e  (London  7 . 4 ) で溶出した Chemica I . ) で 6 0 ' C ， 2 4 時間重合させ，超薄切片を作成

( 1 ‑ c )   5  a ‑ d i h y d r o t e s t o s t 巴 r o n e 結合アフィニティー し使用時まで 4 ' c で保存した.

カラムクロマトグラフィー ( 3 ‑ b )  Androg 巴 nr e c e p t o r  w i t h  c o l l o i d a l ‑ g o l d  (ARG)  CNBr 活性化 S e p h r o s 巴 ‑ 4 B(Pharmacia C o . ) を 1mM の作成.

日 C l で洗浄し， 0 . 5  M N  a C l ‑ O .  5  M sodium b i c a r b o n a t 巴 1 7  n m c o l l o i d a l ‑ g o l d は Roth らく 1 9 8 7 ) 8 ) の方法によ (pH 8 . 6 ) に再懸濁した.これに 1mg/ml になるように り作成した. c o l l o i d a l ‑ g o l d 溶液 1ml (pH 5 . 3 ) に 5μg 5  a  ‑ d i h y d r o t e s t o s t 巴 r o n 巴 ・ BSA を加え， 3 7 ' C ，  2 時間反 の t r a n s f o r m e dandrogen r e c e p t o r を加え 3 分後 5%

応させた.反応後1. 0M エタノーノレアミンで余剰の反応 p o l y e t h y l e n e  g l y c o l   非 ( 2 0 . 0 0 0 ) を 20μl 加え，安定化さ 基をブロックし，さらに1. 0 M 酢酸緩衝液 (pH4.0) ， せ た . こ の 溶 液 を 0 . 0 5% p o l y 巴 t h y l e n eg l y c o l   伴 2 . 0  M NaCl で、ゲノレを洗浄した 2 0 ， 0 0 0 ) ， 5  % g l y c e r o l ，  0 . 0 1  % NaN

(PGN) に重層 5  a  ‑ d i h y d r o t e s t o s t 巴 r o n e :BSA 【 S e p h a r o s e4B カラム し，日立 RP65T ローターで， 2 4 ， 0 0 0  rpm ，  2  ' c ，  4 0 分 を 0 . 5M KCl を含む TEM 緩衝液 (pH7 . 4 ) で平衡化 間遠心し，ベレヅトを 2ml の PGN 溶液に再懸濁した.

し ， DEAE 溶出分画をカラムに吸着させた.同じ緩衝液 このコロイド金溶液を 10‑30 % の l i n e a rg r a d i e n t に で十分に洗浄後， 100μg/ml の t 巴 s t o s t 巴 r o n e を含む 重層し目立 RP40T ローターで 1 4 ， 0 0 0rpm ，  4  ' c ，  3 0 分 TEM 緩衝液に 4 ' c ，  6 時間ゲノレを再懸濁した.ゲル懸 間遠心し，均一粒子径のものを得た. DNas 巴 1 ‑ c o l l o i d a l 濁液を再度カラムに流し， R e c e p t o r 分画を回収した.こ g o l d の作成は B 巴 ndyan らの方法

に準じて作成した.

の分画を凍結乾燥にで濃縮した ( 3 ‑ C ) P o s t ‑ e m b e d d i n g 法

( 1 ‑ d )   G e l  f i l t r a t i o n   超薄切片を 0 . 0 1% T r i t o n   X

1 0 0

PBS(PH 7 . 4 ) で

SuperoseM12 ( 

間反応させた.反応後， 0 . 0 1   %  TritonX‑100‑PBS (pH  の 1 0 5 ， 0 0 0x g で超遠心後の c y t o s o l 分画を DEAE ー セ 7 . 4 ) で 5 分間 3 回洗浄後向倍率に希釈した ARG 溶液を ノレロースカラムに吸着させ， 0.3M KCl で Androgen 3 7 ' C ，  9 0 分間反応させた.これ以降は p o s t ‑ e m b 巴 d d i n g r e c e p t o r   を 含 む 分 画 を 溶 出 し た . こ の 分 画 を 5a

と同様に処理後， TEM にて観察した. トリプシン処理 d i h y d r o t e s t o s t e r o n e :  BSA

S 巴 p h a r o s e アフィニティー は 10μg/ml にトリプシン ( S i g m a ) を PBS(pH 7 . 2 )   カラムにより t e s t o s t 巴 r o n er 巴 c e p t o r を得た.のアフィ に溶解したものを用いて切片を前処理後同様に ARG 染 ニティー吸着分画を superose™12 により分画すると分 色を行った. 子量約 6 8K d a l t o n s の p 巴 ak と他は 5 ， 0 0 0d a l t o n s 以下

結 果 ^{で f r e 巴の t e s t o s t e r o n 巴と考えられる.}

この 2peak を SDS‑PAGE にかけると最初の peak (  1  )  Androgen r e c e p t o r の単離 の分子量は 6 5 ， 0 0 0d a l t o n s であったく F i g . 1).我々は

Androgen  r e c e p t o r は t e s t o s t 巴 r o n e よりも 5 a ‑ 6 5 ， 0 0 0   d a l t o n s の a n d r o g e n r e c 巴 p t o r を DEAE‑

d i h y d r o t e s t o s t e r o n e に特異的に結合口)することを利用 c e l l u l o s e と 5 a  ‑ d i h y d r o t e s t o s t e r o n 巴 a f f i n i t yg 巴 l にょ して i o n   exchange  chromatography  と a f f i n i t y   り精製することができた.

chromatography を用いて精製した.ラットの精巣から C  2  )  H i s t o l o g i c a l  s t u d y  

50 

17 

F i g .   1 .   SDS‑PAGE a n a l y s i s  o f  t h e  t r a n n f o r m e d  an

d r o g e n  r e c e p t o r .   Marker p r o t 巴 i n s C l ane  1 )   and p u r i f i e d  androg 巴 nr e c 巴 p t o rOane 2 ) .  

ラットの精巣より精製した Androgenr e c 巴 p t o r の細 胞成分への結合能を調べる目的で Androgenr e c e p t o r   を c o l l o i d a l ‑ g o l d で標識して p o s t e m b e d d i n gmethod  により染色を行った.用いた組織は標的組織であるラッ

トの精巣，肝臓，非標的組織である小腸等を用いた.

C o l l o i d a l ‑ g o l d  l a b e l e d  a n d r o g e n  r e c 巴 p t o r で精巣を染 色すると s e m i n a l t u b u l e s 内の s p e r m a t o g o n i a ， p r i ‑ mary s p e r m a t o c y t e  ( F i g .  2 a ) ，  r o u n d  s p 巴 r m a t i d( F i g .   2 b ) 等及び S e r t o l ic e l l   ( F i g . 2 c ) の核に特異的に染色 された.しかし l a t 巴 s p e r m a t i d( F i g .  2 d ) の核にはほと んど染色されなかった.又，細胞質にもほとんど金粒子 は認められなかった.肝臓の核も同様に強く染色された.

しかし非標的組織である小腸には核も細胞質も共に同程 度に染色され特異的な染色性は認められなかった.核内 での染色パターンはどの細胞を調べても向様で， pn‑

mary s p e r m a t o c y t e の p a c h y t e n es t a g e  ( F i g .  3 ) で示 す様に電子密度の高い cond 巴 n s e dc h r o m a t i n に少なく，

より電子密度の低い c h r o m a t i n 上に金粒子の分布が認 められた.次にこの 6 5 ， 0 0 0d a l t o n s の Androgenr e c e

p t o r が p r o t e i n に結合しているのか DNA に結合して いるのかを調べた.肝臓の超薄切片を t r y p s i n (10μg/ 

m J)処理後，同様に c o l l o i d a l ‑ g o l dl a b e l e d   a n d r o g e n   r e c e p t o r で染色するとそのパターンは全く変わらなか

った ( F i g . 4 ) .   さらに 1 7nm c o l l o i d a l ‑ g o l d   l a b e l e d  

DNase 1 で切片を染色後， 5  nm  c o l l o i d a l ‑ g o l d  l a b e l e d  

a n d r o g e n  r e c e p t o r で同一面で二重染色すると 5nm コ

ロイド金粒子はほとんど認められず， 17nm コロイド金

粒子のみであった ( F i g

5 ) . このことから 6 5 ， 0 0 0d a l t o n s  

の a n d r o g e nr e c 巴 p t o r は DNA に結合していることを示

した.

( 3 1 8 )   中 山 正 成 ( 他 4 名 〉

考 車

5冒ミ

今回ラットの精巣より t r a n s f o r m e dt y p e  andorogen  receptoT  を DEAE ー セ ル ロ ー ス と 5  a‑

d i h y d r o t e s t o s t e r o n 巴アフィニティーカラムの 2 ステッ プ法により精製し，その生物学的性状を組織化学的に検 討を行った.

ラットの精巣の c y t o s o l 分画(蛋白質として約1. 6  g r )   を DEAE セルロースで 0 . 3M KCl 溶出分画として得た.

この DEAE セノレロース溶出分画〔約 13.5mg) を 5a d i h y d r o t e s t o s t e r o n e アフィニティーカラに吸着させ，

過 剰 の t e s t o s t e r o n e を 加 え る こ と に よ り ， 5 a ‑ d i h y d r o t e s t o s t e r o n e に親和性を持つ蛋白質を回収した.

ゲノレ漏過後に得られた蛋白質は約 10μg 程度であった.

Chang

らは t r a n s f o r m e dandrogen r e c e p t o r を DEAE ーセノレロース， DNA セノレロース， t e s t o s t 巴 r o n e アフィニ ティーカラムにより精製を行っているが， t 巴 s t o s t e r o n e は従来の研究からは核内の種々の蛋白質へ結合すること が報告

されている.一方 d i h y d r o t e s t o s t e r o n 巴は核内 の一種類の蛋白質 ( a n d r o g 巴 nr 巴 c e p t o r ) へのみ親和性を 示すことが Wright ら(1 9 7 9 ) 叫により報告されている.

このことから d i h y d r o t e s t o s t e r o n e アフィニティーカラ ム を 用 い れ ば ， よ り 少 な い ス テ ッ プ で 特 異 的 に a n ‑ d r o g 巴 nr e c e p t o r を精製することができると考えられ，

今回この方法で効率よく t r a n s f o r m e dt y p e  andorogen  r e c 巴 p t o r を精製出来た. この t r a n s f o r m e d androgen  r e c 巴 p t o r にコロイド金標識を行い，細胞内のどの細胞に 親和性を示すかをラットの精巣，肝臓，小腸を用いて検 索を行った結果，精巣や肝臓のような標的臓器の細胞の 核の電子密度の低い領域，即ち転写活性の高い部位と考 えられている領域に特異的に染色を示し，小腸の様な非 標的臓器ではほとんど特異的に染色されなかった.この 結 果 は 阻 止 ogenr e c e p t o r が標的臓器の細胞の核内の特 定の領域を認識して結合していることを示しており，近 年，活性化された r e c e p t o r が核内のステロイドホノレモン 応答遺伝子の特定の DNA 領域へ結合することが報告

されており，今回示した c o l l o i d a l ‑ g o l d   l a b e l e d   an  d r o g e n  r e c e p t o r の核内分布の電顕像がこれに相当する 領域を示している可能性がある.これを支持する結果は コロイド金標識した DNase 1 と c o l l o i d a l ‑ g o l dl a b e l e d  

a n d r o g e n  r 巴 c e p t o r による同一面での二重染色の結果，

DNase  1 感受性部位とは異なる領域への結合とトリプ シン処理後の切片での実験結果から a n d r o g e nr e c e p t o r   が結合する相手は蛋白質ではなく DNA(DNA への結合 実験はここでは示していないが結合することを確認して ある〉へ結合することから， androgen r e c e p t o r はホノレ モン応答遺伝子に相当する DNA の近傍へ結合している と考えられる.

今回作製した t r a n s f o r m e dandorogen r e c e p t o r は以 上のことからアンドロゲンホルモン結合部位と DNA 結 合部位を持ったものであることが判明した.

お わ り に

本論文の要旨は第 9 3 回日本解剖学会総会(1 9 8 4 年 4 月，名古屋〉において発表した.

文 献

1 )   King ，  W. J .  and Greene ，  G .  L . :  Nature 3 0 7 :  7 4 5   7 4 7 ，  1 9 8 4  

2 )   Puca ，  G .  A . ，  S i c a ，  V. and Nola ，  E . :   P r o c .  Nat .   l A c a d .  S c i . 7 1  :  9 7 9 ‑ 9 8 3 ，  1 9 7 4 .  

3 )   K a l l o s ，  J . ，  Fasy ，  T .  M. ，  H o l l a n e r ，  V .  P .   and  B i ck ，  M. D . :  P r o c .  Nat   l . A c a d .  S c i .  7 5 :  4 8 9 6 ‑ 4 9 0 0 ， 

1 9 7 8 .  

4 )   Barrack ，  E .  R . ，  Hawkins ，  E .  F . ，  A l l e n ，  S .  L . ，  Hi c k s ，  L .  L .   and C o f f e y ，  D .  S . :   B i o c h e m .   B i o ‑ p h y s i c .  R e s .  Comm. 7 9 :  8 2 9 ‑ 8 3 6 ，  1 9 7 7 .  

5 )   S c h e i d e r e i t ，  C . ，  G e i ^{呂 田} e ， S . ，  Westphal ，  H .  M. and  Bento ，  M . :  Nature 3 0 4 :  7 4 9 ‑ 7 5 2 ，  1 9 8 3  

6 )   Chang ，  C .  H. ，  Rowly ，  D .  M. ，  L o h l ，  T .  J .   and  T i n d a l ，  D .  J . :   B i o c h e m i s t r y  2 1 :  4 1 0 2 ‑ 4 1 0 9 ，  1 9 8 2 .   7 )   Laemmli ，  V .   K . :  Nature 2 2 7 :  6 8 0 ‑ 6 8 5 ，  1 9 7 0 .   8 )   Roth ，  J . ，  Bendayan ，  M. and O r c i ，  L . :   ] .   H i s t o  

c h e m. Cytochem. 2 6 :  1 0 7 4 ‑ 1 0 8 1 ，  1 9 7 8 .  

9 )   Bendayan ，  M . :  ] .   H i s t o c h 巴 m .C y t o c h e m .  2 9  :  5 3 1  

‑ 5 4 1 ，  1 9 8 1 .  

1 0 )   Isoma ，  V. ，  Parvinen ，  M. ，  Janne ，  O .  A .   and  Bardin ，  C .  W.: E n d o c r i n o l o g y  1 1 6 :  1 3 2 ‑ 1 3 7 ，  1 9 8 5   1 1 )   Wright ，  W. and Frankel ，  A . ‑ I . :   E n d o c r i n o l o g y  

1 0 4 :  1 5 8 0 ‑ 1 5 8 7 ，  1 9 7 9

E x p l a n a t i o n  o f  f i g u r e s  

F i g . 2 .   P o s t

embeddingmethod by t h e  c o l l o i d a l  g o l d  l a b e l e d  a n d r o g e n  r 巴 c e p t o r .

( a ) .   P a c h y t e n e  s t a g e  i n  p r i m a r y  s p e r m a t o c y t e .   S 巴 xv e s i c l e  (SV) and n u c l e o l u s  ( N O ) .  

( b ) .   Round s p e r m a t i d .   ( c ) .   S e r t o l i  c e l l .  

( d ) .   L a t e  s p e r m a t i d .  

F i g .  3 .   P o s t ‑ e m b e d d i n g  method w i t h  c o l l o i d a l  g o l d  l a b e l e d  a n d r o g e n  r e c e p t o r .   The f i g u r e  was  p a c h y t e n e  s t a g e .  

F i g . 4 .   P o s t ‑ e m b e d d i n g  method w i t h  t r y p s i n  t r e a t m 巴 n t .

The s 巴 c t i o nwas t r e a t e d  w i t h  t r y p s i n  and t h e n  a s s a y e d  w i t h  c o l l o i d a l  l a b e l e d  a n d r o g e n   r e c e p t o r ，  i n  t h ^巴 p a c h y t e n e ns t a g e .  

F i g .  5 .   D o u b l e l y  s t a i n e d  p o s t

embeddingm e t h o d .  

The c o l l o i d a l  g o l d  07  nm ，  a r r o w h e a d )  l a b 巴 l e dDN  a s e  1  was a s s a y 巴 dand t h e n ，  on t h e  

same g r i d  s u r f a c e ，  t h e  c o l l o i d a l  g o l d   ( 5  nm ，  a r r o w )   l a b e l e d  a n d r o g 巴 nr e c e p t o r  was 

s t a i n e d .   Th 巴 f i g u r ewas p a c y t e n 巴 s t a g e .

( 3 2 0 )   中 山 正 成 〔 他 4 名 〉

F i g . 2 .  

Fig.2 

( 3 2 2 )   中 山 正 成 ( 他 4 名 〉

F i g . 3  

F i g . 4  

Fig.5