酵母細胞の耐塩性に関する研究

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

酵母細胞の耐塩性に関する研究

渡部, 保夫

https://doi.org/10.11501/3059408

出版情報：Kyushu University, 1991, 博士（農学）, 論文博士 バージョン：

権利関係：

第 5章

酵 母 細 胞 の 易 熱 性 抗 原 タ ン パ ク 質TLAaと TLAbの ス ト レ ス に 対 す る 応 答

5・1 緒 言

第 4章 で 述 べ た よ う に 、 酵 母 細 胞 の 易 熱 性 抗 原 タ ン パ ク 質TLAa及 びTLAbは そ れ ぞ れ 解 糖 系 酵 素 エ ノ ラ ー ゼ 、 グ リ セ ル ア ル デ ヒ ド ー3‑燐 酸 脱 水 素 酵 素 (GAPDH)と 同 一 タ ン パ ク 質 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 両 解 糖 系 酵 素 は 熱 シ ョ ッ ク に よ り 誘 導 さ れ る 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質

(HSP)で あ る こ と が 報 告 さ れ て お り (84，111)、 い ろ い ろ な ス ト レ ス に よ り 誘 導 さ れ る た め 、 広 義 に ス ト レ ス タ ン パ ク 質 と 呼 ば れ て い る 。 また、 T LAa (エノラーゼ、 HSP48) が二つ、 TLAb (GAPDH) が 三 つ の イ ソ タ ン パ ク 質 か ら な る こ と が 報 告 さ れ て い る (99，100)。 耐 塩 性 機 構 を 論 じ る の に 、 こ れ ら ス ト レ ス タ ン パ ク 質 の 追 究 を 避 け で は 通 れ

な い と 考 え ら れ た 。

本 章 で は

S .

 c̲erevisiaeの 弱 耐 塩 性 の 菌 株 を 用 い て 、 各 種 ス ト レ ス に よ っ て TLAa ( エ ノ ラ ー ゼ ) と TLAb (GAPDH) が ど の よ う に 変 化 す る か を 検 討 し た 。 当 研 究 室 で は 抗TLAa血 清 ( 抗 エ ノ ラ ー ゼ 血 清 ) 及 び 抗TLAb血 清 ( 抗 GAPDH血 清 ) を 所 有 し て い る の で 、 こ れ ら の 変 化 を 検 討 す る こ と が で き た 。 そ の 結 果 、 熱 シ ョ ッ ク に よ る 変 化 は 確 認 で

き な か っ た が 、 食 塩 シ ョ ッ ク 、 エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 、 グ ル コ ー ス 飢 餓、 非 発 酵 性 炭 素 源 を 用 い た 培 養 な ど でTLA a、 TLAbの イ ソ タ ン パ ク 質 量 が 変 化 す る こ と を 認 め た 。 そ れ ら の 結 果 は

S .

 c̲erevisiaeの 弱 耐 塩 性 菌 株 を 用 い て 得 ら れ た も の で あ る が 、 解 糖 系 酵 素 の 発 現 が 培 地 食 塩 濃 度 に よ り 変 化 す る こ と を 示 し て お り 、 耐 塩 性 酵 母 の 耐 塩 性

109 

に お い て も 解 糖 系 酵 素 の 発 現 調 節 が 重 要 で あ ろ う こ と を 推 測 さ せ るo

な お 、 本 章 の 大 部 分 は 既 に 学 会 誌 に 報 告 し た (80，81)。

5 ・2 実 験 方 法

5・2 ・1 使 用 菌 株 及 び 使 用 培 地

S.  cerevisiae  X‑2180‑1B 株 (也

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1

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よ) を 用 い た 。 基 本 培 地 と し て 、 l%(w/v)酵 母 エ キ ス 、 2%(w/v)ポ リ ペ プ トン、 2%(w/v)グ ル コ ー ス か ら 成 る YEPD培 地 を 使 用 し た 。 同 酵 母 は

2%(w/v)寒 天 を 含 むYEPD培 地 か ら 成 る 斜 面 寒 天 培 地 上 で4⁰Cで 保 存 し

︒た

5・2 ・2 培 養 方 法

S.  c erevisiae保 存 細 胞 を 5mlのYEPD培 地 に 接 種 し 、 30⁰ C二 日 間 静 置 培 養 し た 。 こ の 前 培 養 液 を 100mlのYEPD培 地 を 含 む 坂 口 フ ラ ス コ に 移 植 し 30⁰Cで 振 と う (100回 / 分 ) 培 養 し た 。

非 発 酵 性 炭 素 源 を 用 い た 培 養 は l%(w/v)酵 母 エ キ ス 、 2%(w/v)ボリ ペ プ ト ン か ら 成 るYEP培 地 に3%(v/v)エ タ ノ ー ル 、 4%(w/v)グ リ セ ロ ー ル、 4%(w/v)乳 酸 ナ ト リ ウ ム を そ れ ぞ れ 添 加 し た 培 地 で 行 っ た 。

熱 シ ョ ッ ク 処 理 は 酵 母 細 胞 を YEPD培 地 中 23⁰Cで 対 数 期 中 期 ま で 培 養 後 、 培 養 温 度 を 36⁰Cに シ フ ト ア ッ プ し 、 さ ら に 培 養 を 続 け 、 適 当 な 時 間 で 細 胞 を 遠 心 分 離 に よ り 回 収 し た 。

化 学 薬 剤 の 効 果 に 関 す る 実 験 は 以 下 の よ う に 行 っ た 。 終 濃 度0.5M

及 び 1.OMに な る よ う に 食 塩(NaCl)を 、 終 濃 度 0.5M及 び 1.0Mに な る よ う に ソ ル ピ ト ー ル を 、 終 濃 度O.lmM及 び 0.5mMに な る よ う に ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム (NaN3)を、 終 濃 度2μg/mlお よ び4μg/mlに な る よ う に ツ ニ

カ マ イ シ ン を 、 終 濃 度0.25mg/ml及 び0.5mg/mlに な る よ う に 2ーデオキ シ グ ル コ ー ス を 添 加 し た YEPD培 地 に 上 記 の 酵 母 前 培 養 液 を 添 加 し 、 対 数 期 中 期 ま で 培 養 し 細 胞 を 回 収 し た 。

エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 処 理 及 び 食 塩 シ ョ ッ ク 処 理 はYEPD培 地 を 用 い

30⁰ Cで 対 数 期 中 期 ま で 培 養 後 、 培 地 に 終 濃 度 10%(v/v)に 成 る よ う に

100%エ タ ノ ー ル を 、 終 濃 度 1.0Mに な る よ う に 食 塩 を 添 加 し 、 培 養 を 続 け 、 適 当 な 時 間 で 細 胞 を 回 収 し た 。

グ ル コ ー ス 飢 餓 処 理 は 酵 母 細 胞 を YEPD培 地 中 30⁰Cで 対 数 期 中 期 ま で培養後、 細 胞 を 無 菌 的 に 遠 心 分 離 に よ り 回 収 し 、 グ ル コ ー ス を 含

ま な いYEP培 地 で 培 養 を 続 け 、 適 当 な 時 間 で 細 胞 を 回 収 し た 。 培 養 中 の 酵 母 の 生 育 度 は 培 養 液 の 濁 度 を 660nmの 吸 光 度 で 表 し た 。

5 ・2 ・3 TLAa及 びTLAbの イ ソ タ ン パ ク 質 量 の 測 定

い ろ い ろ な 条 件 で 処 理 し た 一 定 量 の 細 胞 ( 約2x 1 0⁹細 胞 ) を 遠 心 分 離 に よ り 回 収 し 、 O. 5m 1の TBS[0.15M食 塩 を 含 む 10mMト リ ス ー 塩 酸 緩 衝 液 (pH 7.4)J に懸濁後、 0.5gの ガ ラ ス ビ ー ズ ( 直 径0.45か ら

o

.50  mm) を 加 え 、 適 時 冷 却 し な が ら 10分 間 ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー を 用 い

て 激 し く 振 と う し た 。 得 ら れ た 破 砕 液 を 遠 心 分 離 (10，000xg、 10分 間)し、 上 清 を 得 た 。 一 定 量 の タ ン パ ク 質 (TLAa:30"‑'40μg、 TLAb

:約 50μg) を 含 む 試 料 を 未 変 性 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル に 付 加 し 、 電 気 泳 動 し 、 タ ン パ ク 質 の 全 荷 電 の 差 に 基 づ い て TLAaを 二 つ の イ ソ

タ ン パ ク 質 に 、 TLAbを 三 つ の イ ソ タ ン パ ク 質 に 分 離 し た 。 こ の 電 気 泳 動 は 7.5%(w/v)ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ス ラ プ ゲ ル を 用 い て 、 Davisの 方 法 に 従 っ て 行 っ た ( 以 降 、 ND‑PAGEと 記 述 す る ) (112)。 電 気 泳 動 後、 ゲ ル を は(w/v) SDSを 含 む 62.5mMト リ ス 一 塩 酸 緩 衝 液 (pH 6.8)中

111 

で 室 温 で 15分 間 振 と う 後 、 ゲ ル 中 の タ ン パ ク 質 を 第 4章 で 述 べ た よ う に ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 電 気 泳 動 的 に 転 写 し た 。 シ ー ト 上 の

T L A a

及 び

TL A  b

の 各 イ ソ タ ン パ ク 質 は 、 そ れ ぞ れ 抗

T L A a

血清、 抗

T L A b

血 清 を 用 い て 第 4章 で 述 べ た よ う に 酵 素 免 疫 学 的 に 検 出 し た 。

5 . 2 ・4 タ ン パ ク 質 の 定 重

タ ン パ ク 質 の 測 定 法 は 第 4章 で 述 べ た 。

5 . 3  結 果

5・3・ 1

T L A a

イ ソ タ ン パ ク 質 量 に 及 ぼ す 生 育 条 件 の 効 果

T L A a

、 酵 母 エ ノ ラ ー ゼ 、 HSP48は、 二 つ の イ ソ タ ン パ ク 質 か ら な る こ と が 既 に 報 告 さ れ て る

( 9 9

^，

1 0 0 )

。 本 実 験 で は 、 そ れ ら の

T L A a

^のイ

ソ タ ン パ ク 質 の 検 出 は タ ン パ ク 質 試 料 を ND‑PAGEに よ り 分 離 し 、 タ ン パ ク 質 を SDS化 後 、 電 気 泳 動 的 に ゲ ル か ら ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 し 、 抗

T L A a

血 清 を 用 い た 酵 素 免 疫 学 的 検 出 法 で 行 っ た 。 各 イ ソ タ ン パ ク 質 を

T L A a ‑ 1

及 び

T L A a ‑ 2

と 名 付 け た ( 図 3 3 )。

( a)熱 シ ョ ッ ク 細 胞 : 熱 シ ョ ッ ク 細 胞 の 生 育 度 を 図 3 4 ‑Aに 示 し た 。 試 験 期 間 中 酵 母 は 良 好 に 生 育 し た 。 こ の と き 、 細 胞 破 砕 液 の T 

L A  a

の 両 イ ソ タ ン パ ク 質 量 は 熱 シ ョ ッ ク に よ り 影 響 さ れ な か っ た

(図

33

、 レ ー ン

a

か ら

d

)。 こ の こ と は 、

T  L A a  

( エ ノ ラ ー ゼ ) は 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 (HSP)で は な い こ と を 示 し て い る 。

(  b )

定 常 期 細 胞 :

T L A a ‑ 1

量 が 対 数 期 中 期 の 細 胞 よ り も 定 常 期 の 細 胞 で 増 加 し た ( 図 3 3、 レ ー ン aとe)。

( c)非 発 酵 性 炭 素 源 で 培 養 し た 細 胞 : エ タ ノ ー ル 、 グ リ セ ロ ー ル 、 乳 酸 を 用 い て 培 養 し た 酵 母 細 胞 の 生 育 度 を 図 3 4 ‑Bに示した。

I TLAa‑1 

TLAa・2

a 

b 

c 

_d 

e 

Fig.  33.  Immunoblotting of Isoproteins of TLAa in Heat‑shocked  Cells and in  Cells at Stationary Phase. 

Lanes a‑d， isoproteins  in  cells heat‑shocked for 0， 0.5， 1， and  2 hr;  lane e， in  cells at  stationary phase. 

34.5""'37.5μg of proteins were put on  per lane. 

113 

3% Ethano

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(continued)  Fig.  34. 

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Cullivatlon tlme (h) 

Effects of Various Conditions on Growth of Saccharomyces盟主主

1 ‑

siae X‑2180‑1B Cells.  Fig.  34. 

A， two cell  cultures in YEPD medium were  incubated at  23⁰C for 8h.  Each  culture was  incubated at  23⁰C or  36⁰C. 

B， cells were incubated at  30⁰C in YEP medium containing 2%(w/v)  glucose，  3%(v/v)  ethanol， 4%(v/v) glycerol or  4%(v/v)  lactate. 

C， cells were incubated at  30⁰C in YEPD medium containing 0.5M or  1M  NaCl.  D， cells were incubated at  30⁰C in YEPD medium containing O.Ol%(w/v)， 0.025 

%(w/v)， or 0.05%(w/v)  2‑deoxyglucose. 

E， four cell  cultures  in  YEPD medium were  incubated at  30⁰C for 6h.  Tunicamycin was  added to  each culture to  be  0.5μg/m ，l 2.0μg/ml， or  4.0μg/ml， respectively， and then their cultures were  incubated at 30^oC.  F.  cells were incubated at  30⁰C in YEPD medium containing 0.5M， 1M， or  1.5M 

sorbi tol. 

G， cells  cultivated  in  YEPD medium at  30⁰C for 8h  were harvested， and the  half was  incubated at  30⁰C in  YEPD medium containing 1M NaCl. 

H， cells  cultivated in YEPD medium at 30⁰C for 8h  were harvested， and the  half was  incubated at  30⁰C in  YEPD medium containing 10%(v/v)  ethanol.  1.  cells  cultivated  in  YEPD medium at  30⁰C for  6h  were harvested， and the 

half was  incubated at  30⁰C in  YEPD medium without glucose. 

115 

炭 素 源 と し て グ ル コ ー ス を 用 い て 培 養 し た と き 酵 母 細 胞 の 主 要 TLAa イ ソ タ ン パ ク 質 は TLAa‑2で あ っ た ( 図 3 5、 レ ー ン a) が 、 炭 素 源 と

してエタノール、 グリセロール、 乳 酸 を 用 い た と き 主 要 イ ソ タ ン パ クは TLA a‑1に変わった。 このとき、 TLAa‑2は ほ と ん ど 検 出 さ れ な か っ た ( 図 3 5、 レ ー ン bか ら d)。

( d)薬 剤 を 添 加 し た 培 地 で 培 養 し た 細 胞 : 添 加 剤 と し て 食 塩 、

2‑デ オ キ シ グ ル コ ー ス 、 ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム 、 ツ ニ カ マ イ シ ン 、 ソル ビ ト ー ル を 用 い た 。 こ れ ら を 培 地 に 添 加 し た と き の 酵 母 細 胞 の 生 育 度 を 図

34  ‑ C

から

F

に示した。 こ れ ら の 薬 剤 を 添 加 し た 培 地 で の 酵 母 細 胞 の 生 育 は 薬 剤 濃 度 に 依 存 し て 阻 害 さ れ た 。 ここで、 第一章では、

S.  c erevisia e 0‑11‑4株 細 胞 が 1M食 塩 培 地 で ほ と ん ど ( 無 食 塩 培 地 の 10%程 度 ) 生 育 で き な か っ た と 述 べ た が 、 本 章 の 実 験 で 使 用 し た

S.  c erevisia e X‑2180‑1B株 細 胞 は 1M食 塩 培 地 で も 無 食 塩 培 地 の 場 合 の 30%程 度 の 生 育 を 示 し た 。 耐 塩 性 酵 母

Z . r .

ouxi iに比べれば、

非 耐 塩 性 で あ る が 、

Q .  

 c̲erevisiae酵 母 に お い て も 菌 株 の 違 い に よ り 食 塩 に 対 す る 感 受 性 が 異 な る よ う で あ る 。 こ れ ら の 薬 剤 を 添 加 し た 培 地 で 対 数 期 中 期 ま で 培 養 し た 酵 母 細 胞 の TLAaイ ソ タ ン パ ク 質 の 変 化 を 図 3 5 に 示 し た 。 培 地 に 食 塩 (1 M) (レーン f) と 2ー デ オ キ シ グ ル コ ー ス (0.025mg/ml) (レーン k) を 添 加 し た と き 、 TLAa‑1量 が 増 加 した。 しかしながら、 ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム ( レ ー ン gとh)、 ツ ニ カ マ イ シ ン ( レ ー ン iとj)、 ソ ル ピ ト ー ル ( レ ー ン mか ら 0) の 添 加 で は ほ と ん ど 変 化 し な か っ た 。

( e)食 塩 シ ョ ッ ク 細 胞 : 対 数 期 中 期 ま で 培 養 し た 酵 母 細 胞 に 終 濃 度 1Mに 成 る よ う に 食 塩 を 添 加 し た 場 合 の 酵 母 の 生 育 度 を 図 3 4 ‑G 

に 示 し た 。 食 塩 シ ョ ッ ク を 受 け た 酵 母 細 胞 の 生 育 は 著 し く 阻 害 さ れ

116 

TLAa‑1 

TLAa・2

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た 。 食 塩 シ ョ ッ ク 処 理 後 の 細 胞 中 の

T L A a

イ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 36 ‑A (レーン eか ら i) 示 し た 。 食 塩 シ ョ ッ ク 後 、 4時 間 以 降 で

T  L A  a ‑ 1

量 が 増 加 し 、

T L A a ‑ 2

量 が 減 少 し た 。

( f)エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 細 胞 : 対 数 期 中 期 ま で 培 養 し た 細 胞 に 終 濃 度

1 0 %

に 成 る よ う に エ タ ノ ー ル を 添 加 し た 場 合 の 酵 母 の 生 育 度 を 図 3 4 ‑Hに示した。 エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク に よ り 酵 母 の 生 育 は 抑 制 さ れ た 。 エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 細 胞 中 の

T L A a

イ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 3 6 ‑B (レーン aか ら d) に 示 し た 。 エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 後 、 5時 間 で

TL A  a ‑ 1

量 が 増 加 し 、

T L A a ‑ 2

量 が わ ず か に 減 少 し た 。

( g)グ ル コ ー ス 飢 餓 細 胞 : 対 数 期 中 期 ま で 培 養 し た 細 胞 を グ ル コ ー ス を 含 ま な い 培 地 に 移 植 し 、 培 養 し た 場 合 の 酵 母 を 生 育 度 を 図

3 4 ‑1に 示 し た 。 グ ル コ ー ス 飢 餓 に よ り 酵 母 の 生 育 は 抑 制 さ れ た 。 グ ル コ ー ス 飢 餓 細 胞 中 の

T L A a

イ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 3

6  ‑ A  

(レーン

a

か ら

d )

に 示 し た 。 グ ル コ ー ス 除 去 後

1 0

時間後、

T L A a ‑ 1

が 増加し、

T L A a ‑ 2

が 減 少 し た 。

上 述 の

T L A a

に つ い て 得 ら れ た 結 果 を 表

X

に ま と め た 。

5

・3 ・2

T L A b

イ ソ タ ン パ ク 質 量 に 及 ぼ す 生 育 条 件 の 効 果

T L A b

が 三 つ の 異 性 型 を 持 つ こ と は 既 に 報 告 さ れ て い る が

( 9 9 )

、 そ の 検 出 方 法 は か な り 複 雑 で あ っ た 。 上 述 の

T L A a

と 同 様 の 方 法 を 用 い 、 抗

T L A b

血 清 を 用 い て

T L A b

の 三 つ の イ ソ タ ン パ ク 質 を 酵 素 免 疫 的 に 検 出 し た 。 各 イ ソ タ ン パ ク 質 を そ れ ぞ れ

TL A  b ‑1

^、

T L A b ‑ 2

^、

T L A b ‑ 3

^と名

付 け た ( 図 3

7 

) 。 栄 養 増 殖 し て い る 酵 母 細 胞 で は

T L A b ‑ 3

が 多 量 に 存 在 し て お り 、

T L A b ‑ 1

^と

T L A b ‑ 2

は マ イ ナ ー で あ っ た 。 こ の こ と は

T  L A  b ‑3

が

T L A b ( G A P D H )

の 構 成 的 タ ン パ ク 質 で あ る こ と を 示 唆 し て い る 。

118 

A 

TLAa・1

TLAa‑2 

a  b  c  d  e  f  9  h 

B 

TLAa・1

TLAa・2

a  ^b  c  d 

Fig.  36.  Immunoblottirrg of Isoproteins of TLAa from Glucose‑ starved， NaCl‑shocked， and Ethanol‑shocked Cells.  A， glucose‑starved and NaCl‑shocked cells:  lanes a‑d， isoproteins 

in  glucose‑starved cells for 0， 2， 4， and  10  hr;  lanes e‑i，iso‑ proteins  in  NaCl‑shocked cells for 0， 2， 4， 12， and 24  hr;  B， ethanol‑shocked cells:  lanes a‑d， isoproteins in  ethanol‑

shocked cells for 0， 1， 2， and 5 hr. 

119 

Table X.  Effect of Various Growth Conditions on Expression of Iso‑ proteins of TLAa in  Saccharomyces cerevisiae Cells. 

Conditions  Expression level  TLAa‑l  TLAa‑2 

Additives: NaCl 

2‑deoxyglucose  NaN3 

Tunicamycin  Sorbitol  Carbon sources:  Ethanol 

Glycerol  Lactate 

ホ ー ホ l A

￨

ー←

V l

←V l l v

Shocks:  Heat  NaCl  Ethanol  Stationary phase  Glucose starvation 

ホ ー 小

lホl

小ー

↓ 

¥道

By  comparing with the expression  in  cells grown in  YEPD medium，  the  level was indicated by the  following. 

↑，  increase 

‑，  unchange 

↓，  decrease 

¥斗， slight decrease 

120 

TLAT 

‑ 1  

•

Fig.  37.  Immunoblotting of Isoproteins of TLAb in Heat‑shocked  Cells and in Cells at Stationary Phase. 

Lanes a‑d， isoproteins  in  cells heat‑shocked for 0， 0.5， 1， and  2 hr;  lane e， in  cells at  stationary phase. 

121 

( a)熱 シ ョ ッ ク 細 胞 : 酵 母 細 胞 の TLAbの イ ソ タ ン パ ク 質 量 は 、 対 照 細 胞 の TLAbイ ソ タ ン パ ク 質 量 ( 図 3 7、 レ ー ン a) と比較して、

ほ と ん ど 変 化 し な か っ た ( 図 3 7、 レ ー ン bか ら d)。最近、 GAPDHが 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 の 一 つ で あ る こ と が 提 唱 さ れ た (111 )が、 これ ら の 結 果 は TLAa(GAPDH)も TLAaと 同 様 に HSPで は な い こ と を 示 唆 し て いる。

(b)定 常 期 細 胞 : TLAb‑1、 TLAb‑2が 明 ら か に 増 加 し た ( 図 3 7、

レ ー ン e)。

( c)非 発 酵 性 炭 素 源 で 培 養 し た 細 胞 : 酵 母 細 胞 を 炭 素 源 と し て エタノール、 グ リ セ ロ ー ル 、 乳 酸 を 含 む 培 地 で 培 養 し た と き の TLAb イ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 3 8  (レーン bから d)に示した。 TLAb

‑2量 が 明 ら か に 増 加 し 、 TLAb‑1が わ ず か に 検 出 さ れ た 。 し か し な が ら、 TLAb‑3は ほ と ん ど 変 化 し な か っ た 。

( d)薬 剤 を 添 加 し た 培 地 で 培 養 し た 細 胞 : 使 用 し た 薬 剤 は TLAa の 場 合 と 同 じ で 、 薬 剤 を 添 加 し た 培 地 で 対 数 期 中 期 ま で 培 養 し た 細 胞 の TLA bイ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 3 8に示した。 O.5Mと 1M食 塩 で ( レ ー ン eとf)、 O.5mgjml  2‑デ オ キ シ グ ル コ ー ス で ( レ ー ン 1)、

o  . 

^{5 M， 1 M， 1. 5} Mソ ル ピ ト ー ル で ( レ ー ン mか ら 0) TLAb‑2及 びTLAb‑1 が 検 出 さ れ た 。

( e)食 塩 シ ョ ッ ク 細 胞 : 食 塩 シ ョ ッ ク 細 胞 中 の TLAbイ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 3 9  (レーン jから n) に 示 し た 。 処 理 後4時 間 で T LA b‑2が検出され、 処 理 後 12時 間 以 降 で TLAb‑2に 加 え て TLAb‑1も 増 加した。

( f)エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 細 胞 : エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 細 胞 中 の TLAbイ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 39  (レーン fか ら i)に示した。

122 

TLAb 

4

・

e a q ‑

‑

c 

d

， ・ ^g 

^{h  k} 

8  b 

m  n 

0  の

NF

Fig.  38.  Immunoblotting of  Isoproteins  of  TLAb  in  Cells  Grown Under Various  Growth Conditions. 

Lane  a， isoproteins  in  ce11s  grown  in  YEPD;  1ane  b， in  3%(v/v)  ethano1;  1ane  c，  in  4%(w/v)  glycero1;  1ane  d， in  4%(w/v)  1actate;  1anes  e and  f， in  0.5  and  1.0M  NaC1;  1anes  g and  h， in  0.1  and  0.5mM  NaN3;  1anes  i and j， in  2 and  4μg/m1  tunicamycin;  1anes  k and  1， in  0.25  and  0.5mg/m1  2‑deoxyg1ucose;  1anes  m‑o， in  0.5， 1.0， 1.5M  sorbitol. 

8  b 

c 

d  f 

9 

h  k  m  n  ^寸NF TLAb 

4

・

内

aq u

F ig.39.I IEiE 11110blott ingof I soproteinsof TLAb from Glucose‑starved ，Ethanol‑ shocked， and NaCl‑shocked Cells. 

噌E ta ‑

u 円 しn  

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FL LUnu 

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﹄坐 山n J

n ︐

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Ju‑n・Ja 

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‑ ‑ a  

11

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﹄坐・︐Fム

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︐ ハUJu

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FD  

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一 ︑

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︐ nし︐円

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1ibA σbρu︐ nud

斗

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‑ 可ム FD

︐

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‑ ム 胃lム

・ 司 よ 司

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﹄ 一

一P?4︐門u

n d ρ U   QU

・‑ 廿民

sec o﹂nunu

n a

‑ h u  

na

‑‑

cu

 

TL  

処理後、 5時 間 で わ ず か に TLAb‑2及 び TLAb‑1が 検 出 さ れ た 。

( g)グ ル コ ー ス 飢 餓 細 胞 : グ ル コ ー ス 飢 餓 細 胞 中 の TLA bイ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 を 図 3 9  (レーン aか ら e) に 示 し た 。 期 待 に 反 し て、 TLA bの 変 化 は 小 さ く 、 飢 餓 後 24時 間 で TLAb‑2が わ ず か に 検 出 さ れた。

上 述 の TLAbに つ い て 得 ら れ た 結 果 を 表 X I にまとめた。

一般に、 TLAbイ ソ タ ン パ ク 質 の 変 化 は TLA aイ ソ タ ン パ ク 質 の 変 化 と 比 べ て 小 さ い 。 し か し な が ら 、 定 常 期 及 び 食 塩 シ ョ ッ ク 細 胞 で は 明 瞭 な イ ソ タ ン パ ク 質 の 変 化 が 確 認 で き た 。

5・4 考 察

T LA a ( エ ノ ラ ー ゼ ) は 二 つ 、 TLAb  (GAPDH) は 三 つ の イ ソ タ ン パ ク 質 か ら な っ て い る (99)。従って、 い ろ い ろ な シ ョ ッ ク に よ り 引 き 起

こ さ れ る TLAaと TLAbに お け る イ ソ タ ン パ ク 質 の 量 的 変 化 を 検 討 し た 。 本 実 験 で は 、 タ ン パ ク 質 を ND‑PAGEで分離後、 タ ン パ ク 質 を SDS化し、

ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 し 、 抗 血 清 を 用 い て 酵 素 免 疫 学 的 に 検 出 す る 方 法 を 用 い た 。 一 定 量 の 試 料 タ ン パ ク 質 を 用 い た 場 合 で も 、 発 色 の 程 度 は 実 験 毎 に 幾 分 異 な り 、 TLAa. TLAb全 量 を 比 較 す る こ と は 方 法 論 的 に 無 理 で あ る が 、 あ る 程 度 の イ ソ タ ン パ ク 質 の 増 減 を 検 討

す る こ と は 可 能 で あ っ た 。

酵 母 エ ノ ラ ー ゼ が 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質HSP48で あ る こ と (84)、 ま た 酵 母GAPDHが 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 HSP35で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る の で (111 )、 TLAa ( エ ノ ラ ー ゼ ) 及 び TLAb (GAPDH) 量 が 熱 シ ョ ッ ク に よ り ど の よ う に 変 化 す る か を 追 試 し た 。 本 実 験 で はTLAa (エ ノ ラ ー ゼ ) 及 びTL A b (GA P D H ) が 熱 シ ョ ッ ク に よ り 誘 導 さ れ る こ と は

125 

Table X I . Effect of Various Growth Conditions on  Expression of  Iso‑ proteins of TLAb in Saccharomyces cerevisiae Cells. 

Conditions 

TLAb‑l 

Expression  level 

TLAb‑3  TLAb‑2 

Additives:  NaCl 

2‑deoxyglucose 

N

aN3 

Tunicamycin  Sorbitol  Carbon sources:  Ethanol 

Glycerol  Lactate 

/列

/メ

ノ メ ノ メ

Shocks:  Heat  NaCl  Ethanol  Stationary phase  Glucose starvation 

→ ノ

→

↑ 

ホl A l A l A l

→

→

→ /  

By  comparing with the expression  in  cells grown in  YEPD medium，  the  level was  indicated by the  following. 

↑，  increase 

ノ ，

slight  increase 

126 

一， unchange 

確 認 で き な か っ た 。 従 っ て 、 筆 者 も エ ノ ラ ー ゼ (

T L A a )

は 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 の グ ル ー プ に は 属 さ な い と 結 論 し た が 、 現 在 で は エ ノ ラ ー ゼ は 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 で は な い と す る の が 趨 勢 に な り つ つ ある。 また、

G A P D H

も 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 で は な い と 考 え ら れ る が 、

X  e n o p u s   l a e v i   s

庇 の

G A P D H

に お い て

G A P D H

を 高 レ ベ ル 発 現 し て い る 細 胞 で は 熱 シ ョ ッ ク の 効 果 が 小 さ く な る と す る 報 告 が あ る の で (

1 1 3  

、) 酵 母 エ ノ ラ ー ゼ ・

G A P D H

が 熱 シ ョ ッ ク に よ り 誘 導 さ れ る

HS P

で は な い

と 結 論 す る の は ま だ 時 期 尚 早 か も 知 れ な い 。

次に、 定常期、 非 発 酵 性 炭 素 源 で の 培 養 、 食 塩 や 2‑デ オ キ シ グ ル コ ー ス 存 在 下 で の 培 養 、 エ タ ノ ー ル シ ョ ッ ク 、 食 塩 シ ョ ッ ク 、 グ ル コ ー ス 飢 餓 な ど の い ろ い ろ な 処 理 に よ り

TL A  a 

( エ ノ ラ ー ゼ ) と

T L A b

(  G A P D H )

の イ ソ タ ン パ ク 質 量 が 変 化 す る こ と を 認 め た 。 これは、 イ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 は あ る 条 件 で 発 現 し て い な い 遺 伝 子 が 別 の 条 件 で は 発 現 さ れ る と い う こ と を 示 し て お り 、 両 タ ン パ ク 質 遺 伝 子 発 現 の 調 節 機 構 に 興 味 が 持 た れ る 。

検 討 し た い ろ い ろ な ス ト レ ス を 与 え た 中 で 、 特 に 培 地 に 食 塩 を 添 加 し た 場 合 や 食 塩 ス ト レ ス ( シ ョ ッ ク ) を 与 え た 場 合 に 得 ら れ た 結 果は、 本 論 文 の 主 題 で あ る 酵 母 の 耐 塩 性 機 構 に 関 連 し て い る と 考 察 さ れ た 。 即 ち 、 培 地 に 1M食 塩 を 添 加 し た と き 、 酵 母 細 胞 の 生 育 は 悪 い ( 図 3 4 

‑ C )

が 、 得 ら れ た 細 胞 の

T L A a ‑ 1

量が増加し、

T L A a ‑ 2

量 が 減 少 し ( 図 3

5

、 レ ー ン f、)、

T L A b ‑ 2

量 が わ ず か で は あ る が 増 加 し

た ( 図 3 8、 レ ー ン f)。 さ ら に 、 食 塩 を 含 ま な い 培 地 で 対 数 期 中 期 ま で 培 養 後 、 培 地 に 終 濃 度 1Mに な る よ う に 食 塩 を 添 加 し 食 塩 ス ト レ ス を 与 え る と 酵 母 細 胞 の 生 育 は ほ ぼ 抑 制 さ れ て い た ( 図

34  ‑ G )

。 こ の 食 塩 ス ト レ ス を 与 え た 細 胞 で は 、

TL A  a  ‑ 1

量 が 添 加 後

4 ‑ 1 2

時 間 で

127 

著 し く 増 加 し 、 TLAa‑2量 が 減 少 し た ( 図 36、 レ ー ン eから i) 。 ま た、 TLAbで は TLAb‑1及 び TLAb‑2が 増 加 し た ( 図 39、 レ ー ン jから n)

。他方、 同 モ ル 濃 度 の ソ ル ビ ト ー ル を 培 地 に 添 加 し 培 地 の 浸 透 圧 を 高 め た 場 合 、 上 記 の TLAaお よ び TLAbイ ソ タ ン パ ク 質 の 変 化 は ほ と ん

ど 観 察 さ れ な か っ た ( 図 3 5、 レ ー ン mか ら o及 び 図 3 8、 レ ー ン mか らo) 。 従 っ て 、 上 記 の 食 塩 ス ト レ ス に よ り 誘 導 さ れ る TLA a及 び TLA bイ ソ タ ン パ ク 質 の 変 化 は 浸 透 圧 の 変 化 と い う よ り は む し ろ 食 塩 自 体 の 影 響 で あ る こ と を 示 し て い る 。 一 般 に 、 熱 シ ョ ッ ク に よ る HSPの 誘 導 は 短 時 間 ( 一 時 間 程 度 ) で 起 こ る と 言 わ れ て い る が (114 )、本実験 の 食 塩 ス ト レ ス に よ る エ ノ ラ ー ゼ 及 びGAPDHの 変 化 を 引 き 起 こ す に は 比較的長時間のストレスに曝す必要があった。~. c erevisia e酵 母 は 耐 塩 性 酵 母 に は 分 類 さ れ て い な い が 、 ~. c erevisiaeの 食 塩 ス ト レ ス に よ る 変 化 は 酵 母 の 耐 塩 性 機 構 を 解 明 す る 上 で 重 要 な 示 唆 を 与 え る と 推 察 さ れ た 。 そ こ で 、 次 の 二 点 、 に つ い て さ ら に 考 察 す る 。

第 一 は 食 塩 ス ト レ ス と 同 様 の 変 化 が グ ル コ ー ス 飢 餓 実 験 に お い て も 観 察 さ れ た こ と で あ る ( 図 3 6 ‑A、 レ ー ン aか ら d及 び 図 3 9、 レ ー ン aか ら e) 。 細 胞 は グ ル コ ー ス 飢 餓 に な る と 乏 し い 炭 素 源 を よ り 効 率 よ く 利 用 し 、 エ ネ ル ギ ー を 獲 得 し な け れ ば な ら な い と 考 え ら れ

る。従って、 グ ル コ ー ス 飢 餓 状 態 で 観 察 さ れ た TLAa ( エ ノ ラ ー ゼ ) 及 び TLAb (GAPDH) の 変 化 は エ ネ ル ギ ー 欠 乏 に 適 応 し た 変 化 と 捉 え

る こ と が で き る 。 耐 塩 性 酵 母

z .

^rouxi iに お い て 高 濃 度 食 塩 培 地 で は 生 存 維 持 の た め に は グ ル コ ー ス な ど の 炭 素 源 が 必 須 で あ る こ と も 明 ら か に さ れ て い る (1 9 ) 。 こ れ は

Z .

^rouxi i酵 母 が 高 濃 度 の 食 塩 を 含 む 環 境 で 生 存 す る た め に よ り 多 く の エ ネ ル ギ ー を 必 要 と し て い る

こ と を 意 味 し て い る の で あ ろ う 。 エ ネ ル ギ ー 飢 餓 と 食 塩 ス ト レ ス に

128 

お い て TLAa ( エ ノ ラ ー ゼ ) お よ び TLAb (GAPDH) イ ソ タ ン パ ク 質 量 の 変 化 が 類 似 し て い る こ と は 、 食 塩 ス ト レ ス 対 し て 酵 母 が 適 応 す る と

V 

き、 エ ネ ル ギ 一 生 産 に 関 連 し て 解 糖 系 の 調 節 が 重 要 で あ る こ と を 暗 示 し て い る と 考 え ら れ る 。

第 二 は 食 塩 ス ト レ ス に よ り 誘 導 さ れ た TLA aと TLAbイ ソ タ ン パ ク 質 (TLAa‑1、 TLAb‑2あ る い は TLAb‑1) が 非 発 酵 性 炭 素 源 を 用 い て 培 養 し た 酵 母 細 胞 で 見 い だ さ れ た こ と で あ る ( 図 3 5、 レ ー ン bか ら d及 び 図 3 8、 レ ー ン bか ら d)。即ち、 グ ル コ ー ス で 培 養 し た 細 胞 は 主

にTLAa‑2と TLAb‑3を含むが、 非 発 酵 性 炭 素 源 で 培 養 し た 細 胞 で は TLAa‑1  ( エ ノ ラ ー ゼ 1)であり、 ま た TLAb‑2が 検 出 さ れ た 。 非 発 酵 性 炭 素 源 を 用 い て 培 養 し た 場 合 、 解 糖 系 は 糖 新 生 方 向 に 傾 い て い る と 考 え ら れ る の で 、 こ れ ら の 結 果 は そ の よ う な 条 件 下 で は エ ノ ラ ー ゼ 及 び GAPDHの ア イ ソ ザ イ ム の 発 現 が 変 化 す る こ と を 示 唆 し て い る 。

S.  c erevsiae  X‑2180‑1B 株 は は (1 Mに 近 い ) 食 塩 培 地 で 培 養 し た と き 、 細 胞 内 に グ リ セ ロ ー ル が 蓄 積 し 、 細 胞 内 外 の 浸 透 圧 を 調 節 し て い る こ と も 報 告 さ れ (115 )、また O.7M食 塩 培 地 で 培 養 し た と き 、 グリ セ ロ ー ル 生 産 酵 素 の 一 つ で あ る snー グ リ セ ロ ー ル ‑3‑燐 酸 脱 水 素 酵 素

(図 14 参 照 ) の 活 性 が 増 大 す る こ と が 報 告 さ れ て い る (116，117)。

しかし、 こ の グ リ セ ロ ー ル ‑3‑燐 酸 脱 水 素 酵 素 は 食 塩 ス ト レ ス ( 浸 透 圧 ス ト レ ス ) に よ っ て 誘 導 さ れ る が 、 熱 シ ョ ッ ク に よ っ て は 誘 導 さ れ な い と し て い る 。 こ の グ リ セ ロ ー ル ー3‑燐 酸 脱 水 素 酵 素 の 誘 導 と 食 塩 ス ト レ ス ・ 熱 シ ョ ッ ク の 関 係 がTLAaお よ び TLAbの イ ソ タ ン パ ク 質 の 食 塩 ス ト レ ス と 熱 シ ョ ッ ク の 関 係 と 類 似 し て い る こ と は 興 味 が 持 た れ る 。 本 実 験 の エ ノ ラ ー ゼ と GAPDHの ア イ ソ ザ イ ム の 変 化 は ソ ル ピ

ト ー ル 添 加 ( 浸 透 圧 上 昇 ) に よ っ て は 変 化 せ ず 、 食 塩 の 添 加 に よ り

129 

変 化 す る 特 異 性 を 示 し た が 、 本 実 験 で 見 い だ し た ̲ S ̲ . ̲Q erevisiae細 胞 の 食 塩 ス ト レ ス に よ る エ ノ ラ ー ゼ と GAPDHの ア イ ソ ザ イ ム の 変 化 は 食 塩 添 加 に よ っ て 上 昇 し た 培 地 浸 透 圧 に 対 し て 細 胞 内 部 の 浸 透 圧 を 調 節 す る た め に グ リ セ ロ ー ル 生 成 の 方 向 に 解 糖 系 の 流 れ を 調 節 し て い る と 推 察 し て い る 。 言 い 換 え れ ば 、 ̲ S ̲ . ̲Qerevisiae細 胞 に お い て 食 塩 ス ト レ ス よ っ て 変 化 す る エ ノ ラ ー ゼ と GAPDHの ア イ ソ ザ イ ム の 発 現 調 節 機 構 は 浸 透 圧 調 節 剤 グ リ セ ロ ー ル の 生 成 ( 耐 浸 透 圧 性 ) と 関 連 し て い る と 考 え ら れ 、 興 味 が 持 た れ る 。 食 塩 ス ト レ ス と グ リ セ ロ ー ル 生 成 と 関 連 し て 耐 塩 性 酵 母

z .

^{rouxi i (118)や} Debaryomyces h anseni i細 胞 (119 ) に お い て も グ リ セ ロ ー ル ‑3‑燐 酸 脱 水 素 酵 素 活 性 が 食 塩 に よ っ て 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て お り 、

Z .  

rouxi i細 胞 に お い て も 解 糖 系 と グ リ セ ロ ー ル 生 成 と の 関 連 し た 制 御 が 考 え ら れ る 。 ただ、 S.  c erevisia e細 胞 は 耐 塩 性 酵 母 と は 異 な り 生 成 し た グ リ セ ロ ー ル の 大 部 分 を 培 地 に 漏 出 し て し ま う と 言 わ れ て お り (120 )、グリ セ ロ ー ル の 細 胞 内 蓄 積 機 構 も 耐 塩 性 機 構 に と っ て 重 要 で あ る と 考 え

ら れ る て い る (121 。)

酵 母 の エ ノ ラ ー ゼ とGAPDHは こ れ ま で 得 ら れ た 結 果 か ら 食 塩 シ ョ ック、 グ ル コ ー ス 飢 餓 に よ り 各 々 の ア イ ソ ザ イ ム の 発 現 が 変 化 す る が 、 熱 シ ョ ッ ク で は 変 化 し な い と 考 え ら れ る 。 マ ウ ス BALB/c3T3細 胞 で はHSP70及 び グ ル コ ー ス 制 御 タ ン パ ク 質 GRP78・GRP95で 、 食 塩 シ ョ ッ ク と グ ル コ ー ス 飢 餓 に お い て 異 な っ た 制 御 を 遺 伝 子 の 転 写 レ ベ ル で 受 け て い る こ と も 示 さ れ て い る (122 )。即ち、 熱 シ ョ ッ ク に よ り 誘 導 さ れ る HSP70の 一 つ の イ ソ タ ン パ ク 質 は 食 塩 シ ョ ッ ク に よ り 誘 導 さ れ る が グ ル コ ー ス 飢 餓 に よ っ て は 誘 導 さ れ な い 、 また GRP78と GRP95 は 食 塩 シ ョ ッ ク と グ ル コ ー ス 飢 餓 に よ っ て は 誘 導 さ れ る が 、 熱 シ ヨ

130 

ッ ク に よ っ て は 誘 導 さ れ な い 。 こ の こ と か ら 明 ら か な よ う に 、 いろ い ろ な ス ト レ ス タ ン パ ク 質 は そ れ ぞ れ ス ト レ ス に 特 異 的 に 発 現 が 制

御 さ れ て い る よ う で あ る 。 また、 酵 母 の エ ノ ラ ー ゼ と

G A P D H

の 発 現 制 御 を 遺 伝 子 の 転 写 レ ベ ル で 検 討 す る こ と も 今 後 、 必 要 で あ ろ う 。

本実験の~. ̲Q 

e r e v i s i a  e

細 胞 に お い て 得 ら れ た 結 果 が そ の ま ま 耐 塩 性 酵 母

Z . r o u x i  i

細 胞 に 適 用 で き る と は 言 え な い で あ ろ う 。 本 実 験 で 用 い た こ つ の 抗 血 清 は

Z . r o u x i   i

細 胞 の エ ノ ラ ー ゼ 及 び

G A P D H

と 反 応 し な か っ た の で 、

Z .   r o u x i   i

細 胞 を 用 い て 実 験 で き な か っ た 。 今後、

Z .   r o u x i   i

細 胞 の エ ノ ラ ー ゼ 及 び

G A P D H

に 対 す る 抗 血 清 を 調 製

し、 本 実 験 と 同 様 の 検 討 を 行 う こ と が 重 要 と 考 え ら れ る 。

5 ・5 小 括

酵母~. ̲Q 

e r e v i s i a e

の エ ノ ラ ー ゼ と

G A P D H

は 共 に 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 で あ り 、 一 般 的 な ス ト レ ス タ ン パ ク 質 で あ る と 言 わ れ て き た 。 本 章 で は 両 酵 素 タ ン パ ク 質 の 抗 血 清 を 用 い 、 イ ム ノ プ ロ ッ ト 法 に 従

い、 両 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 に 対 す る 熱 シ ョ ッ ク を 含 め た い ろ い ろ な ス ト レ ス の 影 響 を 検 討 し た 。 エ ノ ラ ー ゼ ・

G A P D H

の 発 現 は 共 に 熱 シ ョ ッ ク に よ り 影 響 さ れ な か っ た 。 また、

T  L A  a 

( エ ノ ラ ー ゼ ) と

T L A b

(  G A P D H )

の 絶 対 量 の 変 化 を 検 討 す る こ と は 困 難 で あ っ た が 、 い ろ い ろ な ス ト レ ス に よ り

T L A a

と

T L A b

の そ れ ぞ れ の イ ソ タ ン パ ク 質 量 に 変 化 が 認 め ら れ る こ と を 明 ら か に し 、 こ れ ら の 変 化 か ら 酵 母 の 耐 塩 性

に つ い て 考 察 し た 。

まず、

T L A a  

( エ ノ ラ ー ゼ ) と

T L A b(  G A P D H )

について、 定 常 期 細 胞 や グ ル コ ー ス 飢 餓 細 胞 で は 、 グ ル コ ー ス 存 在 下 で 栄 養 増 殖 し て い る 細 胞 と 比 べ て 、 異 な る イ ソ タ ン パ ク 質 ( ア イ ソ ザ イ ム ) の 存 在 を 確

131 

認した。 また、 食 塩 ス ト レ ス を 与 え た 細 胞 に お い て 同 様 の 変 化 を 認 めた。 こ の 食 塩 ス ト レ ス に よ る

T L A a

と

T L A b

の 変 化 は ソ ル ピ ト ー ル に よ り 浸 透 圧 を 上 昇 さ せ た 場 合 で は 認 め ら れ な か っ た の で 、 食 塩 に 特 異 的 な 現 象 で あ る と 推 察 し た 。 ま た 、 酵 母 細 胞 が 食 塩 ス ト レ ス に 対 応 す る た め に 必 要 な エ ネ ル ギ ー の 供 給 と 関 連 し て 解 糖 系 酵 素 の 発 現

を 調 節 し て い る と 推 察 し た 。

次に、 食 塩 ス ト レ ス を 与 え た 酵 母 細 胞 に お い て 認 め ら れ た

T L A a

( エ ノ ラ ー ゼ ) や

T L A b(GAPDH)

の 変 化 が グ リ セ ロ ー ル と エ タ ノ ー ル な ど の 非 発 酵 性 炭 素 源 を 用 い て 培 養 し た 酵 母 細 胞 に お い て も 認 め ら れ た 。 非 発 酵 性 炭 素 源 を 用 い て 培 養 し た と き 、 解 糖 系 は 糖 生 成 に 傾 い て い る と 考 え ら れ た 。 また、 ~. g erevisiae細 胞 は 1M程 度 の 食 塩 存 在 下 で は 生 育 可 能 で あ り 、 食 塩 を 含 む 培 地 で 生 育 し た 細 胞 で は 細 胞 内 に グ リ セ ロ ー ル を 蓄 積 し 細 胞 内 外 の 浸 透 圧 を 調 節 し て お り 、 既 報 の グ リ セ ロ ー ル 生 成 酵 素 で あ る グ リ セ ロ ー ル ‑3‑燐 酸 脱 水 素 酵 素 活 性 の 上 昇 と 考 え 合 わ せ 、 食 塩 ス ト レ ス 条 件 下 で は 酵 母 は グ リ セ ロ ー ル 生 成 の 方 向 に 解 糖 系 を 調 節 す る 可 能 性 が あ る こ と を 指 摘 し た 。

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第 6章

耐 塩 性 酵 母 Zygosaccharomyces  rouxi iの 生 育 に 及 ぼ す 薬 剤 の 効 果

6 ・1 緒 言

耐 塩 性 酵 母

Z .

rouxi iは 高 濃 度 の 食 塩 が 存 在 す る 環 境 下 で 生 育 す る た め に 特 殊 な 生 理 機 能 を 獲 得 し て い る と 考 え ら れ る 。 耐 塩 性 酵 母 は 高 濃 度 食 塩 存 在 下 で さ え 細 胞 内 ナ ト リ ウ ム イ オ ン 濃 度 を 低 く 抑 え 、 細 胞 内 外 で 高 い 濃 度 勾 配 を 形 成 し て い る (38，39)。 こ れ は 耐 塩 性 酵 母 の 細 胞 内 酵 素 が 高 濃 度 食 塩 に 対 し て 稀 に し か 抵 抗 性 を 示 さ ず 、 一 般 的 に 感 受 性 で あ る の で 細 胞 内 ナ ト リ ウ ム 濃 度 を 低 く 抑 え る 必 要 が あ る の で あ ろ う 。

一 般 的 に 、 動 物 細 胞 に お い て も 細 胞 内 外 で ナ ト リ ウ ム イ オ ン 濃 度 勾 配 が 生 じ て い る (43)。 こ の 勾 配 は 細 胞 膜 に 存 在 す る ナ ト リ ウ ム ・ カ リ ウ ム イ オ ン 依 存 性ATPaseに よ り 形 成 さ れ る (123 ) 。 酵 母 細 胞 ( 例 えば、

. s .  

~ erevisia eや Schizosaccharomyce e :Q̲旦旦.h̲g)の細胞膜に 存 在 す る ATPaseは ナ ト リ ウ ム ・ カ リ ウ ム イ オ ン 依 存 性 で は な く 、

マ

グ ネ シ ウ ム イ オ ン 依 存 性 の プ ロ ト ンATPaseで あ る (10‑12)。 酵 母 細 胞 では、 炭 素 源 、 や 窒 素 源 な ど の 栄 養 素 は 細 胞 内 外 で 生 じ た プ ロ ト ン 勾 配 に 依 存 し た シ ン ボ ー ト 系 に よ り 取 り 込 ま れ る と 言 わ れ て い る (15 ， 

16)。 従 っ て 、 酵 母 細 胞 に お け る プ ロ ト ン 勾 配 や さ ら に そ の プ ロ ト ン 勾 配 を 形 成 す る プ ロ ト ン ATPaseは 酵 母 の 生 育 に と っ て 必 須 で あ る

( 124)。 そ こ で 耐 塩 性 酵 母 の 細 胞 膜 に は ナ ト リ ウ ム ・ カ リ ウ ム イ オ ン 依 存 性ATPaseは 存 在 せ ず 、 耐 塩 性 酵 母 の 生 育 に と っ て も 細 胞 膜 プ ロ

トン ATPaseが 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と 推 測 さ れ る の で 、 耐 塩 性

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酵 母 の 高 濃 度 食 塩 環 境 下 で の 生 育 と プ ロ ト ン 勾 配 及 び プ ロ ト ン ATP‑ aseと の 関 連 性 を 想 定 し 、 プ ロ ト ン 勾 配 及 び プ ロ ト ン ATPaseに 対 し て 影 響 を 及 ぼ す と 考 え ら れ る 薬 剤 存 在 下 で の 耐 塩 性 酵 母 Z̲. rouxi i の 生 育 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 高 濃 度 食 塩 培 地 で の Z̲.rouxi i の 生 育

に と っ て プ ロ ト ン 勾 配 が 重 要 で あ る こ と を 示 唆 す る 結 果 を 得 た 。

6 ・2 実 験 方 法

6 ・2 ・ 1 使 用 菌 株 及 び 使 用 培 地

Z̲.  rouxi i ATCC42981 株 ( 野 生 型 ) を 使 用 し た 。 使 用 培 地 (YM培 地 ) 及 び 酵 母 株 の 保 存 は 第 1章 で 述 べ た 。 YM培 地 に 終 濃 度 OMか ら 3M

に な る よ う に 食 塩 を 、 O%(w/v)か ら 50%(w/v)に な る よ う に ソ ル ピ ト ー ル を 添 加 後 、 1N塩 酸 を 用 い て pHを調節した。 ま た 、 緩 衝 化YM培 地 の pHは McIlvaine緩 衝 液 ( ク エ ン 酸 ‑ 燐 酸 ー ナ ト リ ウ ム 広 域 緩 衝 液 ) を 1/2容量加え、 O.lN水 酸 化 ナ ト リ ウ ム あ る い は O.lN塩 酸 を 用 い て 所 定 の 値 に 調 節 し た 。 ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム ( シ グ マ 社 製 ) と オ ル ソ パ ナ ジ

ン 酸 ナ ト リ ウ ム ( シ グ マ 社 製 、 以 下 パ ナ ジ ン 酸 と 略 ) は そ れ ぞ れ 10 mMと 100mMの 水 溶 液 と し 、 フ ィ ル タ ー 鴻 過 し 保 存 溶 液 と し た 。 カ ル ボ ニ ル シ ア ニ ド ‑m‑ク ロ ロ フ ェ ニ ル ヒ ド ラ ゾ ン ( シ グ マ 社 製 、 以 下 CCCP と略)は、 25mMア ル コ ー ル 溶 液 と し そ の ま ま 使 用 し た 。 各 種 濃 度 の 食 塩 あ る い は ソ ル ビ ト ー ル を 含 む 培 地 に 上 記 の 薬 剤 を 添 加 し 、 試 験 用YM培 地 を 作 製 し た 。

6 ・2 ・2 ・ 培 養 方 法

YM斜 面 培 地 上 で 保 存 し た Z̲. rouxi i 細 胞 を 5mlの YM培 地 に 接 種 し 30⁰Cで 二 日 間 静 置 培 養 し た 。 前 培 養 液 を 100mlの 試 験 用 YM培 地 に 接 種

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