守 ∞

F

食 塩 培 地 で 培 養 し た

Z .

rouxi i培 養 液 (100ml)か ら 、 遠 心 分 離 に よ り 細 胞 を 集 菌 し 、 冷 破 砕 液 [8ml; 0.5M食塩、 10mM  EDTAを 含 む 0.2M

ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 (pH7.5)J に 懸 濁 し た 。 懸 濁 液 に 8gの 酸 洗 浄 ガ ラ ス ビ ー ズ ( 直 径0.45"‑'0.50mm)、 O.l%(v/v)ジ エ チ ル ピ ロ カ ー ボ ネ ー

ト (DEPC)、 4mlの フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム ・ イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル (25:24:1，v/v)を加え、 ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー を 用 い て 、 5分 間 激

し く 撹 は ん し た 。 遠 心 分 離 (1600xg、 5分 間 ) 後 、 最 上 層 ( 水 相 ) を 採 取 し た 。 得 ら れ た 水 相 は 中 間 相 が 認 め ら れ な く な る ま で フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム ・ イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル 抽 出 を 繰 り 返 し 行 っ た 。 得 ら れ た 水 相 は ク ロ ロ ホ ル ム ・ イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル (24:1，v/v)抽 出 を 行 っ た 。 最 終 的 に 得 ら れ た 水 相 に 含 ま れ る RNAは エ タ ノ ー ル 沈 澱 に よ り 回 収 し た 。 エ タ ノ ー ル 沈 澱 の 状 態 で ‑8 5⁰Cで 使 用 時 ま で 保 存 し た 。 上 記 の 条 件 で 全 細 胞 か ら 2"‑'4mgの 全RNAが 得 ら れ た 。 得 ら れ た 全

RNAは 以 下 に 述 べ る 変 性 ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ る 25Sリ ボ ソ ー ム RNA(3.4Kb)量 と 18S リ ボ ソ ー ム RNA(1.7Kb)量 の 比 較 か ら 分 解 さ れ て い な い RNAであった。

調 製 し た 全RNA(15μg)を50%(v/v)フ ォ ル ム ア ミ ド 2 . 15 Mフ ォ ル ム ア ル デ ヒ ド を 含 む 0.5x MOPS [5 x MOPSは40mM酢 酸 ナ ト リ ウ ム 、 5mM  E DT Aを 含 む O.lM MOPS緩 衝 液 (pH7.0)で あ る ] 緩 衝 液 に 溶 解 し 、 65⁰C、

5分 間 加 熱 し 、 次 い で 急 冷 し 、 RNAを 変 性 さ せ た 。 RNA溶 液 に 色 素 液 を 加えた後、 フ ォ ル ム ア ル デ ヒ ド 変 性 ア ガ ロ ー ス ゲ ル [2 . 2Mフ ォ ル ム

ア ル デ ヒ ド を 含 む 1

x 

M OP S緩 衝 液 を 用 い て 調 製 し た は(w/v)ア ガ ロ ー ス ゲ ル ] に 供 し 、 1 x M OP S緩 衝 液 中 で 電 気 泳 動 し た 。 20x SSCを 用 い て 常 法 (156 ) に 従 い ゲ ル か ら RNAを ニ ト ロ セ ル ロ ー ス フ ィ ル タ ー に 移 し、 フ ィ ル タ ー は 80⁰Cで4時 間 加 熱 さ れ た 。 RNAを 結 合 し た フ ィ ル タ

185 

ー は ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 溶 液 [2%(w/v)プ ロ ッ キ ン グ 試 薬 、

o  . 

1 

%(w/v) 

N ‑

ラ ウ コ イ ル サ ル コ シ ン 、 0.02%(w/v)  SDSを 含 む 5X SSCJ に 浸し、 680Cで2時 間 保 温 後 、 50ng/mlのdigoxigeninで ラ ベ ル し た プ ロ ー プ を 含 む ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 溶 液 中 で 68⁰Cで 一 晩 保 温 し た 。

ハ イ ブ リ ダ イ ズ し た フ ィ ル タ ー はO.l%(w/v) SDSを 含 む2X SS C、 680C で 二 度 洗 浄 し 、 次 い でO.l%(w/v) SDSを 含 む O.lxSSC、 680Cで 二 度 洗 浄 し た 。 以 下 の 免 疫 的 検 出 は 8 ・2 ・3 で 述 べ た 方 法 に 従 い 行 っ た 。

8 ・ 2 ・ 8 細 胞 膜 タ ン パ ク 質 の SDSポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動

OM 食塩培地で培養した~. ~ erevisia eと

Z .

rouxi i細胞、 2M食 塩 培 地 で 培 養 し た 2 . . rouxi i細 胞 か ら 7 ・2 ・5で 述 べ た 方 法 に 従

い 細 胞 膜 を 調 製 し た 。 60μgの タ ン パ ク 質 を 含 む 細 胞 膜 試 料 を 4 ・2 6で 述 べ た 方 法 に 従 い SDS‑ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル [7.5%(w/v)J を 用 い て 電 気 泳 動 し た 。

8 ・3 結 果

8 ・3 ・ 1

Z .  

rouxi iプ ロ ト ン ATPase遺 伝 子 ク ロ ー ン の 単 離

~. ~ erevisiaeの 細 胞 膜 プ ロ ト ンATPase遺伝子(盟主よ)は既に抗酵 母 プ ロ ト ン ATPase抗 体 を 用 い て λgtl1発 現 ラ イ ブ ラ リ ー を ス ク リ ー ニ ン グ す る こ と に よ り ク ロ ー ン 化 さ れ て い る (124)0 2..  rouxi iの 細 胞 膜 プ ロ ト ン ATPase遺 伝 子 を 単 離 す る た め に 、 _{~. ~} erevisia eプ ロ

トンATPase遺 伝 子 の DNAと2.. rouxi i染 色 体 ラ イ ブ ラ リ ー の DNAとの ク ロ ス ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 う こ と に し た 。 プ ロ ー プ と し て

E

^旦旦RI断 片 (855 bp)を 用 い た が 、 _{その断片は~. ~} erevisia eプ ロ ト

186 

ンATPaseの コ ー デ ィ ン グ 領 域 を 含 み 、 ま た 種 々 の ATPaseに お い て 保 存 さ れ て い る 10領 域 の 中6領 域 を 含 ん で い る も の で あ る 。

̲S̲.  ̲Q erevisiae及 び

z . .

rouxi i高 分 子 量DNAをHindIII、 K̲]̲旦I、

E

旦旦RIで切断し、 S.  c erevisia eプ ロ ト ンATPaseDNAの

E

旦̲QRI断 片 を プ ロ ー プ と し て サ ザ ン 分 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 を 示 し た 図 5 2の よ う に、

z . .  

rouxi iの 幾 つ か の DNA断 片 が そ の プ ロ ー プ と ハ イ プ リ ダ イ ズ したが、

z .  

rouxi iのDNA断 片 か ら 生 じ る 発 色 の 程 度 は ̲ S ̲ . c erev i‑ .u̲主主の DNA断 片 の 発 色 よ り 弱 か っ た 。 この差は̲S̲. c erevisia e と

z . .  

rouxi iの プ ロ ト ン ATPase遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 部 分 的 な 差 異 を 反

映 し て い る と 推 測 し た 。 EcoRI断 片 は 両 酵 母 に お い て ほ ぼ 同 じ 長 さ で あったが、 ̲S̲.  ̲Q erevisia eの 場 合 と 比 べ て

z . .

^{rouxi iのHi旦dIII断 片}

の 長 さ は 幾 分 長 く 、

E

旦

n

I断 片 の 長 さ は 著 し く 短 か っ た 。 ̲S̲. c̲erev i‑ siaeの プ ロ ト ン ATPase遺 伝 子 の コ ー デ ィ ン グ 領 域 は Hi旦dIII断 片 中 に 存 在 し て お り 、

Z .

rouxi iにおいて.s. c erevisia eの プ ロ ー プ と ハ イ ブ リ ダ イ ズ す る 旦

i

旦dIII断 片 の 長 さ が . s.cerevisiaeのHindIII断 片 よ り も 長 か っ た の で 、

Z .  

rouxi iの プ ロ ト ン ATPaseの 遺 伝 子 も

E

よ旦d III断 片 中 に 存 在 す る で あ ろ う と 推 定 し た 。 そ こ で 、

z . .

rouxi iの 染 色 体 ( 高 分 子 量 ) DNAのHi旦dIII断片をE̲.♀♀よよベクターの Charomid

9‑36ベ ク タ ー に 挿 入 し た 。

z . .  

rouxi i DNAのHi旦dIII断 片 (3か ら 6 Kbp)を 挿 入 し た Charomid 9‑ 36ベ ク タ ー で 形 質 転 換 し た 5x 10⁴個 の E̲.旦旦よよコロニーを、 前 述 の S.  c erevisiea g E̲旦旦RIプ ロ ー プ を 用 い た コ ロ ニ ー ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り ス ク リ ー ニ ン グ し た 。 結 果 的 に 、 45個 の ポ ジ テ ィ プ ク ロ ー ン が 得 ら れ た 。 そ の 中 か ら 最 も 強 く 反 応 し た 2つ の ク ロ ー ン (Z1612、 Z3551)を 選 び 出 し 、 各 ク ロ ー ン か ら プ ラ ス ミ ド DNAを 調 製 し

187 

司咽町

Kbp 

A 

9.4・ 6.6・

4.4・

22..30・. 

0.56・

Kbp B 

9.4・ 6.6・

4.4・

2.3・

2.0・

0.56・

a  b  c  d  e  f 9  h 

a  b  c  d  e  f  9  h  ¥ 

i 

k 

188 

Fig.  52.  Southern B10t Ana1ysis of Genomic DNAs of Saccharomy‑

主主主 cerevisiae and Zygosaccharomyces rouxii Ce11s and  C10ned Zygosaccharomyces rouxii PMAl Gene. 

A， The genomic DNAs extracted from ~. ~erevisia~ cells  (2μg)  and 'l..辺思iicells  (4.6μg) were digested with various re‑ striction enzymes.  Hybridization was  carried out using the  EcoR1  fragment  (855bp)  from ~. ~erevisia~ PMAl gene as  a  probe. 

Lanes a‑d， ~. ~erevisiag genomic DNA digested with HindIII，  EcoR1， KQn1， and Pst1， respective1y;  1anes e‑j， 

Z .

担 些ii genomic DNA digested with HindIII，匙旦R1，邑11，KQn1， BamHI，  and Pst1， respectively. 

B， The genomic DNAs extracted from ~. ~erevisia~ cells (1μg)  and 

Z .

盟 旦iicells (1μg) and the DNAs  iso1ated from charo‑ mid 9‑36  clones containing 'l..辺些iiPMAl gene (1μg) .  Hybridization was carried out using EcoR1  fr認mentfrom S.  cerevisiag PMAl gene. 

Lanes a， e and  i， a clone  (Z1612)  DNA;  lanes b， f and j， a  clone  (Z3551)  DNA;  lanes c， g and k， ~. ~erevisia~ genomic  DNA;  lanes d， h and  1， 'l..辺監iigenomic DNA;  1anes a‑d， DNA  digested with 出旦dIII; 1anes e‑h， wi th匙旦R1; 1anes  i‑1， with 

K m ! I .  

The size (in Kbp)  and positions of HindIlI‑c1eaved Lambda DNA  marker are  indicated.  The position of uncut charomid 9‑36  c10ne DNA is  indicated by arrow. 

189 

挿 入 し た Hi旦dITI断 片 を 回 収 し た 。 そ の 断 片 の 制 限 酵 素 地 図 を 作 製 し た。 図 5 1にZ3551ク ロ ー ン の 地 図 を 示 し た 。 Z1612ク ロ ー ン の 地 図 はZ1612 Hi旦dIIIDNA中 に Xh旦I部 位 が 存 在 し た こ と 、 PV旦II部 位 の 数 が 異 な っ て い た こ と 以 外 は 調 べ た 制 限 酵 素 に つ い て 同 じ で あ っ た 。 制 限 酵 素 部 位 の 異 な る ク ロ ー ン が 存 在 す る こ と 、

E

主1IとBamHI消 化 し た 染 色 体DNAの サ ザ ン 分 析 で 二 本 の バ ン ド を 示 し た こ と ( 図 5 2 )は、

z .  

^rouxi i細 胞 に は 少 な く と も 二 つ 以 上 の プ ロ ト ンATPase遺 伝 子 が 存 在 す る こ と を 示 唆 し て い る 。

8 . 3 ・ 2

Z .  

rouxi iプ ロ ト ン ATPase遺 伝 子 の 塩 基 配 列 と そ れ か ら 推 定 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列

ク ロ ー ン ニ ン グ し た

Z .

rouxi i DNAのHi旦dIII断 片 ( 約 6 Kbp)中 の

E

^旦旦RI断 片 と

E

^旦旦I断 片 が

s .

^̲Q erevisia ~ [旦旦RIプ ロ ー プ と ハ イ ブ リ ダ イ ズ し た の で ( 図 5 2 )、 上 記Hi旦dIII断 片 の

E

♀̲QRI及 び

E

旦旦I部 位 周 辺 を 図 5 1に 示 し た ス ト ラ テ ジ ー に 従 い 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 そ の 結 果 を 図 5 3に示した。 そ の 配 列 に は 一 つ の 大 き な オ ー プ ン リ ー デ ィ

ン グ フ レ ー ム が 存 在 し た 。 さ ら に 、 上 流‑143 bpの 位 置 に 共 通 TATA配 列 (TATAAAA)が 見 い だ さ れ 、 終 止 コ ド ン か ら 下 流 180 bpに ポ リ ア デ ニ レ ー シ ョ ン 部 位 様 配 列 (AATAA)が 見 い だ さ れ た 。 そ の フ レ ー ム は メ チ オ ニ ン を 含 め て 920個 の ア ミ ノ 酸 を コ ー ド し て お り 、 本 遺 伝 子 ( 以 下 、

Z .  

ro ux i 

i 

1:旦主

i

遺 伝 子 と 略 す る が 、 後 述 す る よ う に

s .

cerevisiae  の プ ロ ト ンATPaseのPMA1に 非 常 に 類 似 す る こ と に よ る ) か ら 推 定 さ れ る タ ン パ ク 質 の 分 子 量 は 、 100，060で あ っ た 。

s .

c erevisiaeの PMA1遺 伝 子 の コ ー ド す る プ ロ ト ン ATPaseは918個 の ア ミ ノ 酸 か ら な り 、 推 定 分 子 量 は 99，532(124)、

s .

^̲Q erevisia eの も う 一 種 の PMA2遺 伝 子

190 

‑111  ̲1・ ^‑111 ー141 ‑llI  .121  TCDACOA TOOTCA TCOACQ T04 TOTCC4陶 咽 I m );TOC1CT.4

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1010  1020  10)0  1040  10・. .・，o 1010  10・o 10'0  110・

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Fig. 53. 

191 

句咽町

Fig.  53.  Nucleotide Sequence of Zygosaccharomyces盟 些iiPlasma  Membrane ATPase Gene and the Deduced Amino Acid Se‑ quence. 

TATA box， initiation codon， stop codon， and polyadenylation site  were boxed.  The amino acid sequences that are homologous to  the other plasma membrane ATPases were underlined.  The peptide  motifs that participate with ATPase functions were double‑under‑ lined.  The transmembrane regions were broken‑underlined. 

192 

司 .

由 来 の プ ロ ト ン ATPaseは947個 の ア ミ ノ 酸 か ら な る 分 子 量 102，157 ( 154 、)

S .  

2_旦旦~プロトン ATPase は 919 アミノ酸、 分 子 量99，765 ( 16 1 )、目. c rass aプ ロ ト ンATPaseは920ア ミ ノ 酸 、 分 子 量99，886で あ り (162 ) 、 こ れ ら は 互 い に 非 常 に 類 似 し て い た 。 特に、

z .  

I旦旦‑

xiよPM主

1

遺 伝 子 の 塩 基 配 列 は

S .

.Q erevisia e 盟主

i

と凹̲A1遺伝子に 対 し て そ れ ぞ れ 、 82%と75%の 相 同 性 を 示 し 、 ア ミ ノ 酸 配 列 は 83%と 80%の 相 向 性 を 示 し た 。 し か し な が ら 、 3'あ る い は 5'フ ラ ン キ ン グ 領 域 の 塩 基 配 列 は 相 向 性 は 認 め ら れ な か っ た 。 但 し 、 3'フ ラ ン キ ン グ 領 域 で

S .

.Q erevisiag E.旦A2遺 伝 子 に お い て CACAの 反 復 配 列 が 存 在 す

る が (154 、)

Z .

rouxi i P旦A1遺 伝 子 の 同 領 域 に 同 配 列 が 見 い だ さ れ た

(  S .  

.Qerevisiag E . 旦 A 1 遺 伝 子 で は 塩 基 配 列 が 発 表 さ れ て い な い ) 。

また、~. .Q erevisia eと

Z .

rouxi i遺 伝 子 の ア ミ ノ 酸 配 列 に お い て N末 端 領 域 (N末 か ら 約 60ア ミ ノ 酸 ) で は 著 し い 差 異 が 認 め ら れ た 。

特 に

S .

.Q erevisia g ~旦主1 と E旦企2 遺伝子に由来するタンパク質の N 末 端 領 域 は セ リ ン に 富 む が 、

Z .

rouxi 

i 

PM主

i

遺 伝 子 の タ ン パ ク 質 で は Gluに 富 ん で い た 。

8 ・3 ・3 他 種 の 細 胞 膜 プ ロ ト ンATPaseと の ア ミ ノ 酸 配 列 比 較 Serranoら(124，152，153)及 び Hagerら (1 62 ) は そ れ ぞ れ S. cere‑

v isia e プロトン ATPase(~旦位)と N. c rass aプ ロ ト ン ATPase遺 伝 子 から推定されるアミノ酸配列をラット S~rcoplasmic  reticulumの カ ル シ ウ ム イ オ ン 依 存 性ATPase(149)、 羊 腎 臓 の ナ ト リ ム ・ カ リ ウ ム イ オ ン 依 存 性ATPase(150)、 大 腸 菌 カ リ ウ ム イ オ ン 依 存 性ATPaseの ア ミ ノ 酸 配 列 (15 1 )と比較し、 非 常 に 相 向 性 の 高 い 領 域 が 存 在 し そ れ ら の 領 域 は い ろ い ろ な ATPaseに お い て よ く 保 存 さ れ て い る こ と を 示 し

193 

司司『

た。 そこで、

Z .  

rouxi 

i 

E̲盟主

i

遺 伝 子 か ら 推 定 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 か ら、 そ れ ら の 領 域 の 相 当 部 分 を 図 5 4に示した。 上 述 の

l i .

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l

と

E

旦主1)(124，154)、

l i .  

:Q̲旦旦̲Q̲gプロト ンATPae(161)と

N .

 c̲rass aプ ロ ト ン ATPaseの 配 列 (162 ) を 比 較 の た め に 示 し た ( 図 54)0 Z.  rouxi iプ ロ ト ン ATPaseの そ れ ら の 領 域 は 他 種 の 酵 母 及 び 糸 状 菌 の 細 胞 膜 プ ロ ト ン ATPaseと 非 常 に 類 似 し て いた。 こ れ ら の 結 果 は 遺 伝 子 の 面 か ら も

Z .

rouxi iのATPaseは プ ロ

トン ATPaseで あ る こ と を 証 明 し て い る 。

図 5 5に

s .

^c erevisia e PMA1と Z. ro ux i 

i 

E.且丘

i

遺 伝 子 か ら 推 定 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 KytoとDoolittle(163)に よ り 示 さ れ た 各 ア ミ ノ 酸 に つ い て の パ ラ メ ー タ ー を 用 い て 前 後 15ア ミ ノ 酸 の ウ イ ン ド ー に つ い て タ ン パ ク 質 の 疎 水 度 を 計 算 し た 結 果 を 示 し た 。 両 タ ン パ ク 質 の 疎 水 性 プ ロ フ ィ ル は 非 常 に 類 似 し て い た 。 また、

  i l

.旦旦主主一 v isia ~ E.旦il遺 伝 子 か ら 推 定 さ れ るATPaseの ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、

l i .  

c erevisa eの プ ロ ト ンATPaseが 10個 の transmembrane領 域 を 持 つ こ と が 示 さ れ た ( 図 5 5 ) (124)0 

Z .  

rouxi 

i  ̲ 旦 p A

よ か ら 推 定 さ れ る ATP‑

aseの ア ミ ノ 酸 配 列 は そ れ ら の 領 域 と 高 い 相 向 性 を 示 し た 。 図 56に

l i .  

c̲erevisiaeプ ロ ト ン ATPases(E.主主1と

E

旦主1)(124，154)、

l i .  

12旦旦

h

旦 プ ロ ト ン ATPase(161)、目. c rass aプ ロ ト ンATPase(162)の ア ミ ノ 酸 配 列 の 相 向 性 の 比 較 を 示 し て い る が 、 特 に 、 領 域v、 vi、 viiに 著 し い 相 向 性 が 認 め ら れ る 。

Z .

rouxi iと

l i .

 c̲erevisia~(PMA1) の

ATP-aseで、 こ れ ら の 領 域 の ア ミ ノ 酸 の 変 化 は 主 に ロ イ シ ン 、 イ ソ ロ イ シ ン、 パ リ ン の 間 で 起 こ っ て い る こ と が 認 め ら れ た ( 約 50%)。 こ の こ と は

Z .

rouxi iの プ ロ ト ン ATPaseタ ン パ ク 質 も 膜 を 突 き 抜 け た 膜 タ ン パ ク 質 で あ る こ と を 示 し て い る 。

194 

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Amino Acid Homology between the Conserved Sequences in  Various Kinds of ATPases and Zygosaccharomyces rouxii  Plasma Membrane ATPases . 

. v.crJSSJ 

Fig.  54. 

The corresponding sequences of  four kinds of plasma membrane  proton‑ATPase from yeast and fungus cells were shown. 

Residues identical to  one of 

Z .

辺 監iiplasma membrane proton‑ ATPase were boxed. 

195 

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Fig.  55.  Hydrophobicity Profiles of  Plasma Membrane ATPases from Zygosacchar0‑

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ドキュメント内 酵母細胞の耐塩性に関する研究 (ページ 77-124)