ヒト血漿中に見出されたNa^+，K^+-ATPase活性化因子の精製および生化学的特性

原 著

〔酷麟。5欝，鞘〕

ヒト血漿中に見出されたNa＋， K＋一ATPase活性化因子の

精製および生化学的特性

東京女子医科大学 生化学教室（主任：降矢 榮教授） イ トウ エイ コ 伊 東 栄 子 （受付 平成2年8月20日）

Purification and Biochemical Characterization of Na＋， K：＋・ATPase

Activator in Huma．n Blood Plasma Eiko ITO

Department of Biochemistry（Director：Prof． Kei FURIYA）

Tokyo Women’s Medical College

Na＋， K＋一ATPase activity of erythrocyte membrane was increased in patients with alcoholic liver

dysfunction． In order to find a clue to the cause of accelerated Na＋， K＋一ATPase activity， the effect of

plasma on the enzyme activity of erythrocyte niembranes was assayed， Na＋， K＋一ATPase activities in normal erythrocyte membranes and dog kidney were increased when normal or patients’plasma was added to Na＋， K＋一ATPase assay mixture． Patients’plasma was more effective to increase the activity than normal ones． Therefore， existence of the ATPase activator was suspected in patients’plasma as well as normal plasma．

To identify the activator of Na＋， K＋一ATPase， biochemical properties of the activator were studied． The activator in plasma was fairly stable to heating and acidic environment and was purified by

column chromatography．

The approximate molecular weight of this activator was determined as 58 Kd by gel filtra‡ion method， however， it was 28 Kd on SDS−polyacrylamide gel electrophoresis． Enhancement of Na＋， K＋一ATPase activity by the purified activator was suppressed by anti・28 Kd protein antibody， indicating that 28 Kd protein is the activator． Molecular weight of the activator was shown to be 59 Kd by PAGE without SDS． It is suggested that the activatqr consists of two subunits of 28 Kd， and subunit interaction is held by hydrogen bond（s）． The activator fraction had also prot601ytic activity， and its activation of Na＋， K＋一ATPase activity was suppressed by protease inhibitors．

From the above observations， I propose that Na＋， K＋一ATPase molecule was activated through

restricted proteolytic hydrolysis by the protease activity of the activator in blood plasma． In the case of

the patient with alcoholic hepatitis， the increased protease activity of plasma activator could be a cause of elevated Na＋， K＋一ATPase of the erythrocyte membranes．

緒 言 降矢ら1）は，アルコール性肝炎患者の赤血球膜 Na＋／K＋一transporting ATPase（EC，3．6．1．37； Na＋， K＋一ATPase）の比活性が，正常人にくらべ 有意に高いことを報告している．また，アルコー ルを長期間摂取した動物では，対照と比較し，骨 格筋2），赤血球3＞∼5），脳3）6），肝臓5）7）の細胞膜Na＋，

K＋一ATPaseの比活性が，増加しているという報

告が数多くある．

この長期アルコール摂取により上昇した

Na＋， K＋一ATPase活性の原因に対して2つの仮 説がある． 1048

第1は，アルコールにより膜脂質組成に変化が

起こり膜の抵抗性は減少し，Naイオンの透過性

が上昇する．その結果，細胞内のNaイオンの汲み

出しのため，Na＋， K＋一ATPaseの数が増加す

る2）∼4＞6＞7）．

第2の仮説は，アルコールによる膜脂質組成の

変化により脂質一タンパク質の相互作用に障害が

起こる．膜貫通タンパク質であるNa＋， K＋一

ATPaseのカイネテック特性に変化が生じ， ATP

加水分解とイオンの汲み出しが十分共役できなく なり，そのためNa＋， K＋一ATPase活性が上昇す る5）． ところで，Finottiらはインシュリン依存性糖尿 病患者の血漿には，赤血球膜のNa＋， K＋一ATPase

を活性化させる因子が存在し8），セリンプロテ

ア一同インヒビターによりNa＋， K＋一ATPaseの 活性化を抑制できたことや，trypsinなどを用いて 活性化を誘導できたことから，この活性化因子を セリンプロテア一個であると報告している9）．し かし彼らは，血漿中にその活性化因子が存在する ことを示唆したのみであり，その因子を特定して いない．この他には，血漿中に存在するNa＋，

K＋一ATPase活性化因子を示唆した報告は見当ら

ない． 今回著者は，アルコール性肝炎：患者および正常 人の血漿を用い，Na＋， K＋一ATPaseを活性化させ る因子は，血漿中に存在する耐熱性タンパク質で あることを見出した．さらにこの活性化因子は， プロテアーゼであることを示す知見も得られた。

したがって，前述の2つの説の他に，アルコール

性肝炎患者の赤血球膜に見られる転進した

Na＋， K＋一ATPase活性の原因の一つとして，血漿 中に存在するプロテアーゼ作用の関与が示唆され たので報告する．

実験試料および方法

1．試料 活性化因子の精製およびその生化学的特性を調 べるために，本学消化器内科入院アルコール性肝 炎患者よりヘパリン採血し，3，000rpm 7分遠心 し，血漿を得た．Na＋， K＋一ATPase活性測定のた め，沈殿した赤血球からbuffy coatを注意深く除 去し，Hanahanら10）の方法を用い赤血球膜を調製 した．対照として正常人（本学職員）より同様に 採血し，赤血球膜と血漿を得た．得られた試料は いずれも分注し，一80℃に保存，使用直前に融解す ることにより，凍結融解の繰り返しを避けた． 2．Na＋， K＋・ATPase活性測定 中尾ら11）の方法に準じた．すなわち，A液（30 mM ATP pH 7．2）とB液（40mM imidozole・ HCI buffer pH 7．2，280mM NaCl，281nM KCI，

10mM MgC12，1mM EDTA）とを1：5の割合

に混合し，基質液とした．基質液0．3mlと水または

0．5mMウァバイン0．1mlを混和した後，赤血球

膜あるいは犬釘由来のNa＋， K＋一ATPase（Sigma 社）0．1mlを加え，反応を開始した．37℃30分間質 置し，15％TCA O．2ml添加することにより反応

を停止した．生成した無機リン酸はFiske−

SubbaRow12）法により測定し，30分あたりに遊離

した無機リン酸をもってATPase活性とした．

ATPase総活性とウアバイン非感受性ATPase

活性（Mg2＋依存性ATPase）との差を，ウァバイ ン感受性Na＋， K＋一ATPase活性として算出した． 3．血漿添加実験 血漿中に存在するNa＋， K＋一ATPase活性化因 子の化学的な性質を調べるために，血漿を以下の 条件で処理した． 1）透析 40倍容の40mM imidazole−histidine buffer， pH 7．1を透析外液として，血漿を透析膜（三光純薬8／

32）に入れ18時間透析し，生じた沈殿物を遠心

（3，000rPln 10分）除去し，上清を透析血漿とした． 2）加熱処理血漿 透析血漿に5倍容の40mM imidazole−histidine buffer， pH 7．1を加え，十分混和した後， TAIYO ドライバスを用いて100℃15分間，加熱した．冷却 後，サクマ遠心器M−160を用いて10，000rpm 15分 間遠心し，上清を加熱血漿とした． 3）アセトン処理

血漿1mlに20mlの冷アセトンを加え4℃5分

静置した．生じた沈殿物をガラスフィルターを用 い吸引，濾過し，さらに冷アセトン，冷エーテル

を用い洗浄した．この沈殿物を5mlの40mM

一1049一

imidazole−histidine buffer， pH 7．1で融解し，ア セトン血漿とした．

4）過塩素酸（PCA）処理

血漿を40mM imidazole−histidine buffer， pH

7．1で5倍希釈し，同量の0．66N PCAを加えた

後，10，000rpm 15分間遠心し，沈殿物と上清を得 た．40mM ilnidazole−histidine buffer， pH 7．1を

用いて，溶解した沈殿物と上清をそれぞれ2M

KHCO3で中和した後，生じた塩を遠心（3，000rpm 15分）除去した．さらに，この上清をあらかじめ 40mM imidazole−histidine buffer， pH 7，1で平衡 化させたSephadex G−25を用いて脱塩したもの を，PCA処理血漿とした． 以上，さまざまに処理された血漿0．11nlを， Na＋， K＋一ATPase活性測定系に添加し，全量0．6 mlで反応させ，活性化効果を調べた． 4．活性化因子の精製 1）部分的精製

加熱処理血漿をあらかじめ30mM Tris・HCl

buffer， pH 7．8，0．1M NaClで平衡化させた Sephacryl S−200カラム（3×94cln）に通し計画分 についてNa＋， K＋一ATPase活性化，およびプロテ アーゼ活性を測定した．活性化画分（Fig，2）を， 再度Sephacryl S−200カラムに通したものを部分 的に精製した活性化因子とした．またゲル濾過用 マーカー（ファルマシア製）を用い活性化因子の 分子量を算出した． 2）精製 部分的に精製した活性化因子にはアルブミンの 混入が認められたので，三段階のカラムクロマト グラフィーにより精製した．まずTravisら13）の 方法を用いBlue−Sepharose CL−6Bにより加熱処 理血漿からアルブミンを除去した．次に，1501nM Tris・HCI buffer， pH 7．8で平衡化させたDEAE−

Toyopal 650s（3×28cm）を用い，150∼300mM

Tris・HCI buffer， pH 7．8の直線濃度勾配により 溶出したのち，300mM，500mM Tris・HCI buffer， pH 7．8で段階的に溶出した． DEAE−Toyopalか

ら溶出した活性化因子をふくむ画分をPM−10膜

（アミコン社）を用いて濃縮し，Sephacryl S−200 カラムに通し活性化画分を得た．

さらにSDS一ポリアクリルアミドゲル電気泳動

（SDS−PAGE）を行い， prestained MW marker （Bio−Rad製）を指標とし28Kd部分のゲルを切り

出し，抽出（マックスイールドGP蛋白回収器ア

トー社），セントリコン（アミコン社）により濃縮 した． 5．活性化因子の抗体作製 4．2）により精製した活性化因子を，Freundの

complete adjuvantとともに隔週1回ウサギの背

部皮下に注射した．6週後に静脈採血し，抗血清

を得た．DEAE−Toyopal，さらにSephacryl S−200 カラムを用いIgG画分を精製した． 6。プロテアーゼ活性測定 Siegelmanら14）の方法に準じた． p−toluene sulfonyl−L−arginine methylester（Tos−Arg−OMe） を基質液として用いた． 7．プロテアーゼインヒビター添加実験

Trypsin inhibitor， aprotinin， antithrombin III

は，それぞれ10μg／ml，0．5mg／ml，1U／mlに蒸留 水で調製後，透析血漿の入っているNa＋， K＋一

ATPase活性化の測定系に0．1ml添加した．37℃

2分preincubationした後，シグマ印璽犬腎由来

のNa＋， K＋一ATPaseを加え，反応開始した． 8．活性化因子のself・digestion（自己消化）に

対するdiisopropymuorophosphate（DFP）の作

用 4．2）により精製した活性化因子にアジ化ナトリ ウムを終濃度が0．05％になるように加え，37℃10 日間温置した．この間，一部を分取し，Na＋， K＋一

ATPase活性化作用の測定およびSDS一ポリアク

リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）分析の試

料とした．さらにDFPの効果を調べるためDFP

を加え（終濃度1mM），5日間温置後，一部を分取 し，SDS−PAGE分析を行った．

9．SDS一ポリアクリルアミドゲル電気泳動

（SDS・PAGE）

7．5∼20％のグラディエントゲルを用い，

Laemmli15）の方法で行った．タンパク質の染色は クマシーブリリアントブルーR−250による． 10．タンパク質測定 Lowry16）法で測定した。 一1050一

実験結果 Table 1は正常人とアルコール性肝炎患者（以 下「患者」と略す）の赤血球膜Na＋， K＋・ATPase 活性を示した．患者赤血球膜Na＋， K＋一ATPase活

性は，正常人に比較し約3倍の高値を示した．正

常人の赤血球膜を用い，透析血漿をNa＋， K＋一

ATPase活性測定系に添加すると，正常人，患者

血漿，ともに上昇し，おのおの9％，29％上昇し

た（Table 2）．しかし， Na＋， K＋一ATPaseの比活

性が元来高い患者赤血球膜に透析血漿を添加して も，それ以上の活性化は起こらなかった．また犬 腎由来の市販Na＋， K＋一ATPaseを用いた場合，正 常人赤血球膜と同様の結果を得たので，以下の活

Table l Na＋， K＋一ATPase activity of red blood

cell rnembrane

Na＋， K＋一ATPase activity（mean±SD）

@ μmol Pi／mg Prot．／h

Normal 0．266±0，042 （n二9） Patient 0．821±0．482＊（11二7） ＊p〈0．005vs． norma1（Studenfs t−test） 性化測定の酵素源として犬腎由来のNa＋， K＋一

ATPaseを用いた．

Table 1とTable 2の結果から，患者ぽかりで なく正常人の血漿中にもNa＋， K＋一ATPase活性 化因子の存在が示唆され，以下の実験を試みた． 1．血漿中に存在する活性化因子の生化学的特 性 Fig．1は，正常人血漿に種々の処理を施し，こ れらを犬腎由来Na＋， K＋一ATPaseに添加し，活性

化効果を調べたものである．透析血漿では40mM

imidazole−histidine buffer， pH 7．1による50倍希

Table 2 Activation of normal membrane Na＋， K＋一ATPase by normal and patients dialyzed

plasma

Addition Na＋，K＋一ATPase activity（mean±SD） ﾊmol Pi／ml membrane／30’

None iNormal membrane） bontrol plasma @ （n；6） oatients plasma @ （n＝4） 0．414 （10G％） O．451±0．037（108，9％） O．535±0．052（129．2％） （％_d。 孟 葺、。

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20ミ1、。Q、15。 、12ら 、ρ 、15 The grade of d響紅5tlon

Fig．1 Effect of normal plasma on dog kidney Na＋， K＋一ATPase activity

⑤ odialyzed plasma，△一一一△aceton treated plasma，○一一一一一一〇heat treat− ed plasma，×…一一一×sup， of PCA treated plasma．

Table 3 Effects of heat treated plasma on Na', K'-ATPase activity

Addition Na', K'-ATPaseactivity_{(o/oincrease)} Normalcontrol (DogkidneyATPaseactivity) o

Sup.ofheattreatedplasma (100#1) 34.8 PCAprecipitate(a) (50"1) (100#1) 25.0 31,6 PCAsupernatant(b) (100#1) 8.7

(a) 1.5ml supernatant of heat treated normal plasma (about lmg!ml protein) was mixed with 1.5ml O.66N PCA, centrifuged to separate precipitate and supernatant. Ppt. was neutralized with 2M KHC03 and desalted by phadex G-25 column. After desaltation, volume was adjusted to 1.5ml (O.17 mglml protein).

(b) Sup. was made in the same way as (a). Protein concentration of (b) is O.05

mglml.

O. Iml sample was mixed with substrate and reaction was started by the addition of O.Iml (20"g protein) of dog kidney Na', K'･ATPase. Basal dog kidney Na", K'-ATPase activity was O.404#mol Pi120"g protien130min.

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Frectlon No.

fig. 2 Chromatogram of heat treated plasma by Sephacry1 S-200 gel filtration and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

(A) Elution profile : The sample containing about 5mg of protein was applied onto a column. Absorbance at 280nm. O ; Tos-Arg-OMe-degrading activity. e ; %increase in Na', K'-ATPase activity. The arrows indicate molecular weight markers with 67Kd, 43Kd, 25Kd and 13.7Kd.

(B) SDS-polyacrylamide gel electrophoretic patterns: Lane 1; molecular

weight marker, Lane 2; trypsin inhibitor, Lane 3; human albumin, Lane 4; plasma, Lane 5;heat treated plasrna, Lane 6; fraction No. 35, Lane 7;fraction No. 50. 1052 -=

=

E N r

o

e E 6 E

-Q , 1 l 1 , 6

釈で最大活性を得，約23％であった．加熱処理血 漿の場合，むしろ透析血漿より高く，約30％以上 の活性化を示した．アセトン処理を行った後にも，

活性化効果が認められた．しかしPCA処理血漿

の上清には，活性化効果は認められなかった，加

熱処理血漿にPCAを加え，生じた沈殿物には

Na＋， K＋一ATPase活性化作用が見られた（Table 3）． 2．活性化因子の精製 Fig，2はSephacryl S・200を充填したカラムに 加熱処理血漿を添加し，その溶出パターンを示し たものである．No．50画分に活性化因子が溶出さ れ，その分子量は約58Kdであった． Fig．2Bはそ

のSDS−PAGEによる分析結果であり，電気泳動

法では分子量28Kdと同定された．2一メルカプト エタノール（2・ME）により還元しても変わらな かった．

この分子量の矛盾は，28Kdタンパクの分子形

態によるものとも考えられ，耐熱性という点から IgGの1ight chainの可能性が考えられた．そこ で，部分的に精製した活性化因子と加熱処理血漿

MW

94Kd⇒ 67 ■0 43 ⇒ 30 ⇒ 20．1の 14．4⇒ ｛A）

が

蝋瞬蔽

轡筆

1㌔．＿＿

醐

噸山山い （B｝

prot●曇n 8n電1一入 pro塗●ln ontl−7㌧

Hg．3Westem blot analysis of heat、treated

plasma and No．50 fraction obtained by ge1丘1tra−

tlon

Heat treated plasma（A）and No．50 fraction of Fig．2（B）were electrophoresed on 7．5∼20％ gradient SDS・polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose． Nitrocellulose strips were either stained with amid black （center）or immunoblot with anti一λantibody followed by peroxidase−conjugated anti・（humanλ） antibody

（right）． MW markers are shown in the left．

につきSDS−PAGEを行い，ウェスターンプロッ

トを行って，抗κ，抗λ抗体との反応を調べた． Fig．3には抗λ抗体との結果のみを示した．加 熱処理血漿にはκ，λ鎖の存在が認められたが，部 分的に精製した活性化因子にはκ，λ鎖の存在が 認められず，28回目タンパク質は，免疫グロブリン のlight chainではないことが確認された．

Fig．4は， Blue−Sepharose CL−6B， DEAE・ Toyopa1650s， Sephacryl S・200カラムクロマトグ ラフィーを用いた一連の精製品を示し，（c）は電気

泳動による分析結果である．28Kdの下に1本ま

たは2本のタンパクのバンドが見られた．このバ ンドの出現は，Sephacryl S・200カラムを用いて，

前述のNo．50画分を再クロマトグラフィーを

行っても，同様に認められた． 三段階の男ラムクロマトグラフィーを用いて， 精製した活性化因子のNa＋， K＋・ATPase活性化 に対する濃度依存性を調べた（Fig．5）．反応溶液 0．6mlに対し，7μgまでは直線性を示した， 3．活性化因子の抗体によるNa＋， K＋・ATPase 活性化の抑制作用

28KdタンパクをSDS・PAGE完了後のゲルよ

り抽出し，Freundのcomplete adjuvantととも

にウサギに注射し抗血清を得た．この抗血清は28

Kdタンパクとのみ反応することを確認した後

（Fig．6）， IgG画品にまで精製した．精製したウサ ギ抗体は30mM Tris・HC1， pH 7．8，0．1M NaC1 を用い，1．25mg／mlの濃度に調製後，希釈系列を 作製した．活性化因子（0．13mg／m1）0．1m1と先 の抗体0．1m1を4℃18時間反応させた後， Na＋， K＋・ATPase活性化測定系に添加した．ウサギ抗 体のみを測定系に添加しても活性化は認められた ので，抗体添加によるNa＋， K＋一ATPase活性化分 はブランクとして差し引いた．Fig．7に示すよう に添加IgG量の増加に伴い， Na＋， K＋・ATPase活

性化は阻害され，125μgの抗体により活性化の

53％が阻害された． 4．活性化因子のプロテアーゼ作用の検討 1）プロテアーゼ活性測定 Sephacryl S・200カラムクロマトグラフィーに より加熱処理血漿を分画し，それぞれの画分のプ 一1053一

O．5 o oo “ ｛ 0 善 § ｛A） Q 害 至 ぎ § ↓ 一 q 暑 嚢 置 毒 ↓ 80 02 0．1 0 め 創 く （B｝ 20 40 60 Fレ鴫電1㎝閥0。 20 40 60 拘・㎝on縄0． 80 ‘C⊃

擶一’．

30 卿．劃D一←28Kd

犠叢誌．趣

1 2 3 4

Fig．4 Puri丘cation of Na＋， K＋・ATPase activator

（A）After albumin was removed from heat treated plasma by Blue Sepharose CL6B column chromatography， the eluate was applied to a DEAE・Toyopa1650s

column． The bar indicates the fractions that were pooled．

（B）・Fractions containing Na＋， K＋・ATPase activator， obtained by DEAE・ Toyopa1650s co1㎝n chromatography， were concentrated by ultra丘1tration， The concentrate was then subj㏄ted to Sephacryl S・200 col㎝n chromatogra−

phy．

（C）SDS・polyacrylamide gel e1㏄trophoresis of the activator fractions during

puri丘cation steps． Lane 1；MW marker， Lane 2；sup． of heat treated plasma，

Lane 3；combined fraction obtained by DEAE・Toyopal 650s column chromato・ graphy（tube No，28∼32）， Lane 4；combined fraction obtained by gemltration

co1㎜n chromato∬apby（tube No．50∼51）．

ロテアーゼ活性を測定した（Fig．2）．プロテアー ゼ活性のピークとNa＋， K＋・ATPaseの活性化の ピークは一致した． 2）活性化因子のdigestion Fig．8は精製した活性化因子のself digestion

を行い，それをSDS・PAGEで分析し，同時に

Na＋， K＋・ATPase活性化に対する効果を調べた ものである．37℃温置2日後に，26Kdにタンパク

バンドが集積し，約15Kd部位に弱いタンパクの

パソドがあらたに出現した． Na＋， K＋・ATPase活性化は経時的に減少し，10 日後にはタンパクのバンドはほとんど消失し，活

性化も認められなくなった．このdigestionは

DFP（1mM）により抑制された（Fig．9）． 3）Na＋， K＋・ATPase活性化に対するプロテ アーゼイγヒビターの作用 一1054一

あ 葦 葺 ：1 ％ 40 30 20 10 ● ● Fig．5

dog kidney Na＋， K＋・ATPase activity

1 2 3 4 5 6 7

Actlり8量or⊂ug’量ub●，

Effect of dose of activator on activation of

嚢舞

縫瀦罐謙

．繋

ア ヘキドな ナ モ ド ナ ウ 一誌盤蒔 Fig．6 puri丘ed activator ㌻・／．。’一 b㍗b T ㌔ ， 病 F 、’C畷、漕’ ’∴頭∴’、亨 ’獄1・づ㌦ ’章 蝉’㌔募 ㌃㌦由㌃ 転，継ケ 、「 ザヒリガポせ じ し も か ア ド 2パJ lく鳳ご少 ごヅ ドセドズ

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％ 0 100 垂 置 2 3 ￡ セ 響 50 も 5 塁 著 。 ● ● _●

Characterization of rabbit antisera against

Heat treated plasma was electrophoresed on 7．5∼20％gradient SDS・PAGE and transferred to nitrocellulose membrane． Lane 1；protein was

stained with Amido black， Lane 2；nitroce11ulose strip was probed with antisera against puri丘ed activator as described in Fig．3．

診 Σ ち 3 ￡ を 垂 冨 馨 20 40 60

榔

80 100

Table 4は，活性化されたNa＋， K＋一ATPase活 性に対するプロテアーゼインヒビターによる抑制 作用を示したものである．透析血漿添加により活 性化された∠Na＋， K＋・ATPase活性を100％とす

ると，trypsin inhibitor， aprotinin， antithrombin

IIIは，いずれも活性化を抑制したが，このうち trypsin inhibitorは，約65％抑制し，最も効果的で

Fig・7 1mmunoprecipitation of puri丘ed activator with the rabbit antibody to human Na＋， K＋・ ATPase activator

Activator was preincubated with various concen−

trations of the antibody at 4℃over night．

50 40 30 20 η ⊂副 ⊂A，

，鞭藩

67 43 30 20．唱 鱈．4

鍵羅

0 2 5 10 00y● 0 2 4 6 8 10 D8ソ8

Fig．8 Self digestion of puri且ed activator incubat。 ed at 37℃

（A）SDS・polyacrylamide gel electrophoretic pat− tems of puri丘ed activator with self digestion．

Numbers on the bottom represent incubation

time in day．

（B）Influence of self digestion of purified

activator on activation of Na＋，K＋・ATPase activ．

ity．

MW

94Kd 67 43 30 20．1 14．4

瑠

難

・繍

Tab璽e 4 Effects of protease inhibitors on dog kid・ ney Na＋， K＋・ATPase activity in the presence of

dialyzed plasma

Addition Final Na＋， K＋・ATPase activity（％） concentration （mean±SD） None 100

．愚鋤麟簾瞬幽

Trypsin inhibitor （0．715μg／m1） （1．43μg／m1） 24，6±18．5（n；3） 17．3±16．6（n＝3） 1鱒雇：’ Aprotinin （1．43μg／m1） （14．3μg／m1） （71．4μg／m1） 76．7± 8．7《n＝6） 67．0±12．0（n＝3） 44，5±15，5（n＝2） 1 2 3 4 5 」一＿＿」 一 〇 5 day8 1ncuba輔on仙me

Fig．9 Effect of diisopropyl fiuorophosphate

（DFP）on self digestion of purified activator

Purified activator fractions incubated with or

without DFP were subjected to SDS・

polyacrylamide gel electrophoresis． The gel was stained with Coomassie blue． Lane 1；MW marker， Lane 2 and Lane 4；puri丘ed activator incubated at 37℃without lmM DFP， Lane 3 and Lane 5；puri丘ed activator incubated at 37℃with lmM DFP． Antithrombin In （0．286U／m且） （0．715U／m皇） 69．1 61．8 あった， 考 察 アルコール性肝炎患者の赤血球膜Na＋， K＋・

ATPaseの比活性は，正常人と比較し，約3倍高

値を示した（Table 1）．正常人の赤血球膜Na＋， K＋・ATPaseと犬腎由来のNa＋， K＋・ATPaseの 活性は，正常人および患者血漿の添加により，と もに増加したが，患者血漿の方が強い活性化作用 を示した（Table 2）．このことからNa＋， K＋・

ATPase活性化因子は，血漿中に存在することが

明らかとなった． 1．活性化因子の生化学的特性 血漿を透析，加熱，アセトン処理しても，活性 化作用が認められたことから（Fig．1），活性化因

子は分子量約10Kd以上で，かなり熱に対して安

定なタンパク質であると考えられた．PCA処理し た上清には活性化作用はなく（Fig．1），その沈殿

物を中和し脱塩すると活性化が示され（Table

3），酸に対してもかなり安定なタンパク質である

Dog kidney Na＋， K＋・ATPase avtivity was determined in the presence of O．lml of dialyzed plasma（1／5丘nal dllu− tion；about 14．8mg proteins）， in the absence（none）and in the presence of 50μ1and 100μlof trypsin inhibitor（0・1 mg／ml）；1μ1，10μ1 and 50μ10f aprotinin（1mg／m1）；40μl and lOOμ且of antithrombin III（5U／ml）． Basa且dog kidney Na＋，K＋一日目Pase activity：0．049μmol Pi／20μg protein／30

min． と考えられた． 活性化因子は熱安定性を示すことから，その精 製の出発材料として加熱処理血漿を用いた．しか

し活性化因子を精製して，高純度の状態にする

と，一20℃で凍結後，融解により，その活性化作用 は速やかに失なわれた．そのため実験に際しては， 精製した活性化因子の保存を0℃1週間とした． 以上のことから，活性化因子の熱や酸に対する 安定性は，血漿中に存在する他のタンパクによっ て保たれている，と推定される． 2．活性化因子の精製 加熱処理血漿からSephacryl S・200を用い，活 性化因子を精製すると，分子量は約58Kdであり，

SDS・PAGEによる測定結果からは28Kdであっ

た（Fig，2）．ゲル濾過法により溶出速度から求め た分子量58Kd，電気泳動法による移動度から求め た場合，28Kdということから，その分子形状は直 方体と考えられ，さらに耐熱性タンパクというこ とから，免疫グロブリン1ight chainの可能性が考 えられた．しかし抗κ抗体や抗λ抗体とは反応せ ず，この可能性は否定された（Fig．3）．

SDSを使用しない電気泳動法17）によりみかけ

の分子量は59Kdを示し， SDS・PAGEで28Kdと

一1056一

同定されるタンパクは，水素結合などの弱い結合

により結合し，二量体の58Kdとして血漿中に存

在していると推測される． Na＋， K＋一ATPase活性化に対し，精製した活性 化画分（Fig．4b）は濃度依存性を示した（Fig．5）． さらに，28Kdタンパクの抗体（Fig．6）と反応さ せると，Na＋， K＋一ATPase活性化は濃度依存的に 抑制された（Fig．7）．すなわちFig．5とFig．7か ら，28Kdタンパク質はNa＋， K＋一ATPase活性化 因子であることが明らかになった． 3．活性化因子のプロテアーゼ作用

精製度の上昇に伴い28Kdタンパクバンドの下

に，27Kd，26Kdのタンパクが出現した（Fig．4C）．

精製した活性化因子を37℃に確報すると，2日後

には28と27Kdタンパク・ミンドは消失し，あらた

に15Kdに相当する部分に弱いタンパクバンドが

あらわれた（Fig。8A）．同時に， Na＋， K＋一ATPase

活性化作用も減少した（Fig．8B）．温置によるバ

ンドの消失は，DFP添加によって抑制された

（Fig．9）． Fig．2は， Na＋， K＋一ATPaseを活性化

する当分とプロテアーゼ活性画法が，一致するこ

とを示す．

以上の結果は，精製したNa＋， K＋一ATPase活性 化因子に爽任しているプロテアーゼによってもた

らされたとも考えられる．

しかしTable 4は， trypsin inhibitorなどのプ ロテアーゼインヒビターが活性化を抑制すること を示したことから，活性化因子そのものがプロテ アーゼである可能性が示唆された． 不活性化型の酵素がプロテアーゼによって活性 化することは，血液凝固反応や消化酵素の分泌発 現機構において，よく知られている．しかし低い 活性の酵素が，プロテアーゼによってより活性化 するという報告は少ない．

カルモデュリンによりCa2＋一ATPaseの活性は

数倍高まり，このカルモデュリンによる活性化は， 可逆的であることが知られている．Wangら18）は，

内在性カルパインもCa2＋一ATPaseを活性化させ

るが，カルパインによる作用は不可逆的であると 報告している．

Kimら19）は， pyridoxine−5−P oxidaseをキモト

リプシソ処理すると，pyridoxine−5−P oxidaseは 限定分解され，活性化されることを報告している． 正常入の赤血球膜には血漿によるNa＋， K＋一

ATPase活性化が見られたが，患者の赤血球膜に

は認められなかったことから，赤血球膜Na＋， K＋一ATPaseに対する血漿プロテアーゼの作用も 不可逆的なものと推測される． 結 論 今回著者は，血漿よりNa＋， K＋一ATPaseを活性 化させる因子を精製し，その単量体の分子量は約

28Kdのタンパク質であることを同定した．さら

に，活性化因子がプロテアーゼであることを示唆 した．

正常人と比較して，3倍も高いアルコール性肝

炎患者の赤血球膜のNa＋， K＋一ATPase活性は，血 漿中に存在するプロテアーゼのみによるものとは 考えられない．なぜなら血漿添加による活性化は， 最高でも50％を占めるにすぎないからである． したがってこの論文は，アルコール摂取により Na＋， K＋ATPase分子の誘導が起こるという説 や，Na＋， K＋一ATPaseのカイネティック特性の変 化が生じるという説を否定するものではない．

しかし，血漿に存在するプロテアーゼがアル

コール性肝炎患者にみられる増加したNa＋， K＋一

ATPase活性の原因の一つとして考えられ，プロ

テアーゼによるNa＋， K＋一ATPaseの分子修飾に より本酵素が活性化するという可能性を示唆する ものである． 稿を終えるにあたり，ご指導ご校閲賜った降矢焚 教授に，心より感謝申し上げます．また測定に直接協 力してくださった秋山まゆみ先生をはじめ，ご助言ご 協力をいただいた本教室の三盛生方，化学教室の堀川 博朗講師に厚く御礼申しあげます．また試料をご提供 下さいました消化器内科学教室の小幡裕教授に御礼 申し上げます． なお，本論文の要旨は等15回国際臨床病理学会，第 62回目本生化学会大会において報告した． 文 献 1）降矢 焚，黒川きみえ，大田由己子：ヒト赤血球 膜の分子筋効果の異常．医学と生物 109： 315−320， 1984 一1057一

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