博 士 （ 農 学 ） 辻 本 弥 生
学 位 論 文 題 名
夕バコモザイクウイルスの増殖が抑制される シロイヌナズナt07n2‑ ヱ変異株の研究
―アの坦冶，TOM2B遺伝子の同定を通して一
学位論文内容の要旨
ウイルスは作物や動物にとってきわめて重要 な病原体となるー方，生命現象を解析す るモデルとして格好の材料である．ウイルスの 増殖過程において宿主因子はウイルス側 の因 子と 協調 して 重要 な役 割を 担う と 考えられている，しかし、ウ イルスの増殖に関 与する宿主因子の同定例は少なく，同定された 因子に関してもウイルス増殖への関与に ついての情報はまだ不十分である，
我々 の研 究室 では ，シ ロイ ヌナ ズナ を 用いた遺伝学的アプローチに より，ウイルスと し て の 性 格 付 け が 進 ん で い る プ ラ ス 鎖RNAウイ ルス であ るタ バコ モザ イク ウ イル ス
（TMV） の 増殖 に関 与す る宿 主因 子の 同定 が試 み られ てき た，TMVはシ ロイ ヌ ナズ ナ (Col―0） に全 身感 染す るこ とか ら， シロ イヌナズナはTMVの増殖に 必須な宿主因子を 全て持っていると考えられる．
速中 性子 線を 変異 源と し， タバ コモ ザ イクウイルス(TMV)の増殖効率が低下するYS241 変異 株が 単離 され た． 遺伝 解析 によ りYS241変異株の形質は核ゲノム上の劣性1因子に よっ て支 配さ れていることが明らかとな り，tom2‑1 (tobamovirus multiplication 2‑
！）変異と名付けられた．tom2‑1変異は細胞内 でTMV RNAの増殖を抑制する ．また，TMV とは分類学上異なるウイルス群に分類されるウ イルス（カブクリンクルウイルス，キュ ウリ モザ イク ウイ ルス およ びカ ブ黄 斑 モザ イク ウイ ルス ）の 増殖 にはtom2ーj変異は 顕著な影響を与えなかった．一方，TMV―Cgと近縁なTMV−Lについては，YS241変異株(M3 世代 ）を 戻し 交雑 した 変異 株の 中に ， 増殖が抑えられるもの(Bl―113株）と抑えられ ない もの(Bl‑234株 ）が 混在 する こと が明 らか にな った ．こ のこ と から，もともとの YS241変 異 株(M3世 代 ） に はtom2‑1変 異 に 加 え てTMV―Lの 増 殖 に 影響 を与 え るモ デ イフ ァイ アー が存 在し てい たこ とが 示 唆された．遺伝解析により，TMV―Lの増殖に影 響を 与え るモ ディ ファ イア ーが 優性1因子 によって支配され，TMV―Cgの増殖にも影響 を与えることが明らかとなった．このモディフ ァイアーはttml (Lom .two modifier！）
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と名付けられた．t tml変異をもたなぃtom2‑1変異株であるBlー113株ではTMV―Lおよ びTMVーCgの増殖が抑制されるが，とtml変異を持つtom2ーJ変異株であるBl―234株で はTMV―Lの増殖は野生型株と同様で，TMV−Cgの増殖はBl―113株と野生型株の中間であ った，速中性子線はDNAの欠失・逆位・転座による変異を誘発すると報告されているこ とから，原因遺伝子の単離にあたり，ク口モソームウォーキングとPCRを利用したゲ ノミックサブ卜ラクション法であるRepresentational difference analysis（RDA） を併用した．RDAにより，野生型株には存在するがBl―113株には存在しないDNA断片 (RDAフラグメント）が増幅し，Bl‑113株の染色体が欠失を起こしていることが示唆 された．そこでサザン解析により欠失領域を調べたところ，欠失は約20 kbpに及ぶこ とが明らかとなった．さらにBlー234株ではそのうちの約18 kbpの領域が転座してい ることが明らかとなった．欠失領域を含む領域を互いにオーバーラップするクローン 化DNA断片でカバーし，それらをBl―113株に導入し，TMVの増殖低下形質を相補する領 域の同定をおこなった，その結果，Blー113株においてTMVの増殖を野生型レベルに回復 させる領域および.Bl―234株レベルに回復させる領域をそれぞれ得た，これらの断片上 には各一っずつの転写単位が存在し，それぞれをTOM2A，TOM2Bと名付けた．Bl―234株で はTOM2A遺伝 子 は 欠損 し てお り，TOM2B遺伝子 は転座し ていた．Bl―113株では TOM2A，TOM2B両遺伝子が欠損していた，っまり，TOM2A，TOM2B遺伝子の同時欠損により TMV増殖抑制形質が強くなるということが明らかになった．TOM2A遺伝子は281アミノ 酸からなる4回膜貫通型タンパク質と予想される産物を，また，TOM2B遺伝子は122ア ミノ酸からなる小さな塩基性タンパク質をコードしていた．本研究ではさらに3種類 のTOM2Aホモログをシロイヌナズナから単離した．TOM2A遺伝子およびTOM2B遺伝子 のTMV増殖における機能および本来の植物体におけるの機能は現在のところ不明であ るが，TOM2A遺伝子のTMV増殖における機能についてはそれを示唆するいくっかの結 果を総合し考察した．
学位論文審査の要旨 主査 助教授 石川雅之 副 査 教 授 内 藤 哲 副 査 教 授 伴 戸 久 徳
学 位 論 文 題 名
夕 / ヾコモザイクウイルスの増殖が抑制される シロイヌナズナt071/12‑ ヱ変異株の研究
‑ TOM2A，TOM2B遺 伝 子 の 同 定 を 通 し て ー
ウイルスゲノムの複製は、ウイルスにコードされた因子とともに多くの宿主 因子に依存する。しかし、ウイルス増殖に関与する宿主因子に関する知見は未 だ少なく、その増殖機構を理解する上で大きな障害となっている。本研究では、
シロイヌナズナを用いた遺伝学的アプロ―チにより、タバコモザイクウイルス (TMV)の増殖に関与する宿主因子の同定を行った。まず、速中性子線を変異 源とし 、TMVの増 殖効率が低 下するYS241変異株が単離された。遺伝解析に よりYS241変異株の 形質は核ゲ ノム上の劣性1因子によって支配されている ことが明らかとなり、tom2‐7(tobamovirus multiplication 2‑l)変異と名付 けられ た。tom2―7変異は細胞 内でTMV RNAの増殖を抑制した。詳細な遺伝 解 析に よ りYS241変 異株 に はtom2―7変異 に 加え てTMVの増 殖を正に制 御 するモ ディファイ ア‑ ttm7が存在することも示唆された。本研究では、こ れらの変異の原因遺伝子の同定が行われた。本論文の内容は以下のように要約 される。
1、YS241株 に お け る 染 色 体 転 座 ： 速 中 性 子 線 はDNAの欠 失 ・逆 位 ・転 座による変異を誘発すると報告されていることから、クロモソ―ムウォーキン グとPCRを利用したゲノミックサブトラクション法であるRepresentational
difference analysis (RDA)を併用した解析を行った。RDAにより、野生型株 に は存 在 する がtom2ー7株には存在 しないDNA断片(RDAフラグ メント）が 増幅し、tom2―7株の染色体が欠失を起こしていることが示唆された。そこで サザン解析により欠失領域を調ぺたところ、欠失はRDAフラグメントを含む 約20 kbpの領 域に及ぶこ とが明らか となった。 さらにtom2−7ttm7株では そ の う ち の 約18 kbpの 領 域 が 転 座 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。
2、TMVの 増殖 に 関与 す る遺 伝子の 同定：欠失 領域を合む 領域を互い にオ ー バ―ラッブ するクロー ン化DNA断片でカバ ―し、それ らをtom2‑7株に導 入 し、TMVの増殖低下形質を相補する領域の同定をおこなった。その結果、
tom2‑7株 に お い てTMVの 増 殖 を 野 生 型 レ ベ ル に 回 復 さ せ る領 域 およ び tom2‐7ttm7株レベルに回復させる領域をそれぞれ得た。これらの領域には 各―っずつの転写単位が存在し、それぞれを7．〇M2A，T〇＾イ2Bと名付けた。
t〇m2‐7Ctm7株では7，〇M．2A遺伝子は欠損しており、7りM．2B遺伝子は転座し ていた。C〇m2‐7株では7−〇M12A，71〇M28両遺伝子が欠損していた。つまり、
7りA佗4，7・〇M．28遺伝子の同時欠損によりTMV増殖抑制形質が強くなるという こ とが明らか になった。7，〇M2A遺伝子は281アミノ酸からなる4回膜貫通 型タンバク質と予想される産物を、また、7・〇M2B遺伝子は122アミノ酸から なる小さな塩基性タンパク質をコードしていた。
以上、本論文により当該変異株のゲノムに起きた事象の大部分が解明され、
2つの新規宿主遺伝子がTMVの増殖に関与することが示された。これは、TMV の複製機構を解明する上で重要であると同時に、TMV増殖の人為的コントロ ールの基礎となりうる重要な発見である。また、放射線による変異に関する新 規な知見も得られた。よって審査員一同は、辻本弥生が博士（農学）の学位を 受けるに十分な資格を有するものと認めた。
