博 士 （ 薬 学 ） 森 俊 介
学位論文題名
アスコルビン酸欠乏によるモルモット肝チトクローム P 450 の分子種特異的 変動に関する研究
学位論文内容の要旨
体内に取り込まれた薬物を含む外来性化合物は、主に肝臓において解 毒化される。しかし中には代謝され、より毒性の強い物質に変化する場 合もある。従って、肝臓における外来性化合物の代謝は、薬効や毒性を 決定する重要な因子のーつである。これらの代謝に関与する中心的な酵 素としてチトクロームP450 （以下P450) が挙げられる。ヒトをはじめと して各種動物の肝には複数のP450 分子種が存在し、対応するアミノ酸 配列の相同性によりいくっかのフんミリーおよぴサブフんミリーに分類 され、「CYP 」として系統的に表記されている。
P450 の発現は薬物等の外来物質やステロイドホルモン等の内因物質ば かりでなく様々な栄養状態によっても変動する。著者はこれらの要因の 中 でも極めて身 近かに存在す る栄養素のー つであるアス コルビン酸 (As A) を取り上げ、その欠乏が P450 の発現におよぼす影響について研 究を進めた。
研究にはモデル動物としてヒトと同様に AsA 合成能を欠損しているモ 少モットを用いた。これまでの研究ではAsA 欠乏による肝薬物代謝酵素 活性や総P450 量の低下という現象面の変化にのみ焦点を絞ったものに すぎなかった。そこで、本研究ではこのような現象の分子論的な基盤、
すなわち、P450 の低下の詳細や個々のP450 分子種の含量の変動につい て検討し、以下のような結果を得た。
1 ）AsA 欠乏により全てのP450 分子種の含量が一様に低下するのでは
なく、P450 の分子種ごとに異なった変動パターンを示すことを明らか
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に し た 。 す な わ ち 、 CYP2B お よ ぴ CYP3A の含 量 は AsA 欠 乏 の 影 響 を 受 け な か っ た の に 対 し、 CYPIA1 お よ び CYPIA2 の 含 量 は AsA 欠 乏 に より顕著な低下を示すことを明らかにした。
2 ） AsA 欠 乏 に よ る CYPIA 分 子 種 (CYPIA1 、 CYPIA2) の 含 量 の 低 下 の原因は小胞体膜の脂質の過酸化を介したCYPIA 分子種の分解によ るものでないことを明らかにした。
3 ） AsA 欠 乏 に よ り CYPIA1 お よ ぴ CYPIA2 の mRNA 量 は 明 ら か に 低 下し 、 CYP2B の mRNA 量 は変 化しな かっ た。こ れら の結果 は、 対応 する蛋白質の含量の変化と良く一致した。すなわち、AsA 欠乏による各 P450 分子 種の 変動は mRNA レベル ですでに決定されていることが明ら か と な っ た 。ま た 、 異 な る 4 種 の モ ルモ ット CYP3A の cDNA クロ ーン (CYP3A14 、 CYP3A15 、 CYP3A17 、 GP‑14) を単離 、解 析する こと によ り 、モルモット肝ミクロゾーム中には複数のCYP3A 分子種が存在する こ とを明 らか にした 。さ らに、 個々の mRNA 量の変動を検討したとこ ろ 、 CYP3A14 お よ ぴ GP‑14 の mRNA 量 は AsA 欠 乏 の 影 響 を 受 け な か っ た の に 対 し 、 CYP3A15 お よ ぴ CYP3A17 の mRNA 量 は顕 著 な 低 下 を 示 し、同 じ CYP3A サ ブフん ミリ ーに属していてもAsA 欠乏によって個 々 の 分 子 種 が 異 な っ た 量 的 な 変 動 を 示 す こ と を 明ら か に し た 。 このように AsA 欠乏による P450 量の低下とぃう漠然とした現象は、
全てのP450 分子種の含量が一様に低下するとぃう単純なものではなく、
同じサプフんミリーに属する個々の分子種でさえ異なった変動パターン を示し、複雑に変化すこと、すなわち、 AsA 欠乏によって代謝の全体像 というものは、複雑に変化し、代謝に影響を受ける薬物と受けない薬物 があることを分子レベルで検討することにより初めて明らかにした。
近年、ヒトの栄養状態は改善したとぃわれるが、正常な機能を保つに は十分でない潜在性AsA 欠乏症のヒトがかなり存在するといわれている。
本研究で得られた結果が種を越えて当てはまるとするならば、AsA の潜 在的欠乏状態のヒトでも代謝の全体像とぃうものは、複雑に変化し、薬 物 の 薬 効 、 毒 性 に 大 き な 影 響 を 与 え る こ と が 予 想 さ れ る 。
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学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
ー 教 授 鎌 教 授 長 助 教 授 横 助 教 授 高
滝 哲 也 沢 滋 治 井 毅 橋 和 彦
学位論文題名
アスコルビン酸欠乏に よるモルモット肝チトクロー厶 P 450 の分子種特異的 変動に関する研究
申請 者は 、潜在性ピタミン欠乏症の中でも最もその状態にあるヒトが多い と 考え られ ているアスコルピン酸を取り挙げ、アスコルピン酸欠乏が薬物の 薬 効 や 毒 性 に 深 く 関 わ る チ ト ク ロ ー ムP450（ 以 下P450ま た はCYP) の 発 現 に お よ ぼ す 影 響 に つ い て 研 究 を 進め た 。P450は 肝 ミ クロ ゾー ムに 存 在し 、薬 物や毒物の解毒を行うが、がん原性物質の活性化を行い発癌との 関 係で 注目 を集めている酵素である。したがって、本酵素の量的な変動は薬 物 など の解 毒能だけでなく、がん原物質に対する発癌リスクにも影響をあた え る。 従来 の研 究で はアス コル ビン 酸欠 乏に よっ て総P450含量 なら ぴに肝 薬 物代 謝酵 素活性が低下するとぃう現象面の変化しか判明していなかった。
本 研究 では 、分子レペルでのアプローチ、すなわちアスコ少ビン酸欠乏によ るP450含 量 の 低 下 の 詳 細 や 個 々 のP450分子 種 の 含 量 の 変 動 につ いて 検討 した。以下に詳述するように、今までの研究から数段高度な研究成果を示し、
極めて高い研究成果であると評価される。
！ ）7冬 三 坐 竺 ン 酸 欠 乏 に よ る 薬 物 代 謝 醸 塞 萱 壁 の 低 下 の 原 因 先 ず、 アス コル ピン 酸欠 乏に よる 薬物 代謝 酵素 活性の 低下 は、 電子 伝達 酵 素 で あ るNADPH‑チ ト ク ロ ー ムP450還 元 酵 素 の 活 性 の 低下 に よ るも ので は な いこ とを 明ら かにした。さらにイムノプロット分析や酵素活性の測定を行 な った 結果 、ア スコ ルピ ン酸 欠乏 によ り各P450分子種 の含 量は 分子 種ご と に 異 な っ た 変 化 を 示 す こ と を 明 ら か に し た 。 す な わ ち 、CYP2Bお よ ぴ CYP3Aの 含 量 は 、 ア ス コ ルピ ン 酸 欠乏 の影 響を ほとん ど受 けな かっ たの に 対 し 、CYPIA1お よ ぴCYPIA2の 含 量 は ア ス コ ル ピ ン 酸 欠乏 に よ り明 らか に
低 下 す る こ と を 示 し た 。 肝 ミ ク ロ ゾ ー ムに お け るP450含 量 の低 下と 共に 薬物代謝酵素活性の低下も認められたが、その低下の程度は用いた基質によっ て異なっていた。
釜7墨 呈)11Vン 酸 欠 乏 時 に お け る 薬 物 代 謝 酵 素 活 性 の 低 下 と 脂質 過 酸 化 ア スコ ルピ ン酸欠乏状態にあるモルモットの肝において脂質過酸化が顕著 に 上 昇 し て いる こ と 、 ま たNADPH依 存的 なラ ット 肝ミ クロ ゾー ムの 脂質 過 酸化 を誘 発さ せる と特 異的なP450分子 種の 含量 のみ が減 少す るこ とに 着目 し 、 ア ス コ ルピ ン 酸 欠 乏 に よ るCYPIA分 子種 の含 量の 低下 が小 胞体 膜の 脂 質 過 酸 化 に 起因 す るCYPIA分 子 種 の 分 解 によ る か 否 か 、 面vitroお よび 血 vy0の 両 面 か ら 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 ア スコ ル ピ ン 酸 欠 乏 によ るCYPlA分 子 種 の 含 量 の低 下 の 原 因 は 脂 質過 酸化 を介 したCYPlA分子 種の 分解 によ る もの でな いこ とを 明ら かにし た。 すな わち 、面W的において脂質過酸化を促 進 す る とCYPlAの 含 量 の 低 下が 認め られ たが 、モ ルモ ット にア スコ ルビ ン 酸欠 乏食 とと もに 脂質 過酸化 阻害 物質 であ るト コフ ェロ ール を投 与し ても CYPlA含量 の低 下が 認め られ た。
！ ）‑墨 三 坐 竺 ン 酸 欠 乏 に よ るP4塁 OcD変 動 のmRNAレ ベ ル で の 検 討 ア スコ ルビ ン酸 欠乏に よる 各P450分 子種 の量 的な 変動 が、 蛋白 質発現ま での どの 過程 で調 節を受 けて いる のか を知 るこ とは アス コル ピン 酸欠乏に よ るP450の減 少 を 説 明 す る う え で 極 め て 重 要 で あ る 。そ こで アス コル ビ ン 酸 欠 乏 時 に お け る 各 種P450分 子 種 の 発 現 のmRNAレ ベ ル で の 検 討 を ノー ザン プロ ット 分析に より 検討 した 。
ア ス コ ル ピ ン 酸 欠 乏 に よ りCYPIA1お よ ぴCYPIA2のmRNA量 は 明 ら か に 低 下 し 、CYP2BのmRNA量 は 変 化 し な か っ た 。 こ れ ら の 結 果 は、 対 応 す る蛋 白質 の含 量の 変化と 良く 一致 した 。す なわ ち、 アス コル ビン 酸欠乏に よ る 各P450分 子 種 の 変 動 はmRNAレ ベ ル で す で に 決 定 され てい るこ とが 明 らか とな った 。
．4)モ坐垂ZトCYP3Aの分子種特異的変動
4種類の抗ヒト（、´YP3A抗体を用いたイムノブロット分析の結果、他の動 物 種と同様にモルモット肝ミクロゾーム中には複数の（ニYP3A分子種が存在 し 、 同 じCYP3Aサプ ファ ミリ ーに 属し ていて もア スコ ルビ ン酸 欠乏 によ ら て それぞれが異なった量的な変動を示すことが示唆された。そこでモルモッ ト 肝cDNAラ イ プ ラ リ ー よ り 、CYP3Aフ ァ ミ リ ー に 属 す る4種 のcDNAク ロ ー ン を 単 離 し た(GP‑24、GP‑21、GP‑11お よびGP‑14)。 この 中でGP‑24、 GP‑21お よ びGP‑11は 国 際 命 名 委 員 会 に よ っ で そ れ ぞ れCYP3A14、 CYP3A15お よ ぴCYP3A17と 命 名 さ れ た 。CYP3A14、CYP3A15、CYP3A17
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およ ぴGP‑14のア ミノ 酸配 列の相 同性 は92.4ニ99.6%と 極めて 高い値を示し た 。 一 つ の 動 物 種 に お け るCYP3A分 子 種 の ア ミ ノ酸 配列 の相 同性 が90%以 上で ある例はモルモットが最初である。このようなことから塩基配列やアミ 丿 酸 配 列 の 違 い だ け か ら 本 研究 で 単 離 し た4つ のCYP3A分子 種が 、各々 異 な るCYP3A分 子 種 で あ る と 断 定 す る こ と は 難 し いと 考え 、CYP3A分子種 の 誘導 剤で あるDexの投 与や 成長に 伴う発現量の変化を検討した。その結果、
極 め て 高 い 相 同 性 を 示 し た4つ のCYP3A分 子 種 は 、 モル モッ トの 肝に常 在 し、 それぞれが異なった発現様式を示すP450分子種であることが分かった。
次 に こ れ ら4種 のCYP3A分 子 種 のmRNA量 が ア ス コ ル ビ ン 酸 欠 乏 に よ り どの よう な変 化を 示す かに つい て、Slマ ッピ ング 法に より検 討した。その 結 果 、CYP3A14お よ ぴCYP3A18のmRNA量 は ア ス コ ル ピ ン 酸 欠 乏 の 影 響 を 受 け な か っ た が 、CYP3A15お よ びCYP3A17のmRNA量 は 明 ら か に 減 少 し た 。 こ の よ う に 同じCYP3Aサブ フん ミリ ーに 属し てい なが らそ れぞれ の 分子 種の発現はアスコルビン酸欠乏により異なる変動を示すことを明かにし た。
近年 、ヒ トの 栄養状態は改善し、ビタミン欠乏症を呈するヒトの数は減少 し てい る。 しか し、潜在性ビタミン欠乏状態にあるヒトがかなり存在すると い われ てい る。 喫煙者は非喫煙者に比ベ血漿中のアスコルピン酸濃度が明ら か に低 くな り、 喫煙者の半分以上が潜在的欠乏状態になっていることが知ら れ てい る。 また 、健康な人においても加齢・老化に伴って、体内のアスコル ピン酸濃度は次第に低下する。特に病院食中に含まれるア丶スコルピン酸含量 が 低い こと から 老人の長期入院患者の体内アスコルビン酸濃度は著しく低く 潜 在的 欠乏 状態 に陥っていることが問題となっている。現段階では、アスコ ル ピン 酸欠 乏に 関して動物実験で得られた結果を直接ヒトに当てはめること や ヒト にお ける データの蓄積がないためヒトでの予測をすることは困難であ る が、 高齢 者に 対する薬物療法が問題になっているなど臨床上大きな問題が ある以上さらなる研究が期待される。
以 上 、 本 研 究 で は ア ス コ ル ピ ン 酸 欠 乏 によ る チ ト ク ロ ー ムP450の 変動 に 関し て高 度な 研究を展開し、大きな成果をおさめた。本論文「アスコルピ ン 酸 欠 乏 に よ る モ ル モ ッ ト 肝 チ ト ク ロ ー ムP450の 分 子 種 特 異的 変動 に関 す る研 究」 に含 まれる研究成果は薬学における基礎および応用のいずれにお い ても 優れ てお り博士（薬学）の学位を受けるに充分値するものと認めた。
