九州大学工学応化分子物質創造工学

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

非共有結合的相互作用を利用した蛋白質内光誘起電 子伝達システムの構築に関する研究

高島, 弘

九州大学工学応化分子物質創造工学

https://doi.org/10.11501/3166772

出版情報：Kyushu University, 1999, 博士（工学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

九 州 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 物 質 創 造 工 学 専 攻 博 士 論 文

非 共 有 結 合 的 相 互 作 用 を 利 用 し た 蛋 白 質 内 光 誘 起 電 子 伝 達 シ ス テ ム の 構 築 に 関 す る 研 究

平 成 12 年 2月

高 島 弘

目次

第 一 章 緒 言

1 ‑1 . 序

1 ‑2.新 規 機 能 付 与 の た め の 蛋 白 質 エ ン ジ ニ ア リ ン グ 1・2・I. 遺 伝 子 工 学 的 手 法 か ら の 機 能 性 蛋 白 質 の 創 出

1‑2‑2.  合 成 化 学 的 手 法 か ら の 機 能 性 蛋 白 質 の 創 出

1‑3. 問 題 提 起 と 本 論 文 の 構 成

I ‑4. 参 考 文 献

門/﹂

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第 二 章 ル テ ニ ウ ム ト リ ス ビ ピ リ ジ ル 錯 体 を 基 体 と し た 蛋 白 質 表 面 レ セ プ タ ー の 開 発 と 機 能 評

価:シトクロム cへ の 特 異 的 結 合 と 効 率 的 光 還 元 反 応 23 

2‑1. 序 2‑2. 分 子 設 計 2・3. 実 験

2^・3‑1. レ セ プ タ ‑2. I bの 合 成

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2‑3‑2.  レセプタ ‑2.1a. 2.1 cの 合 成 33  2‑3^・3. ル テ ニ ウ ム 錯 体

Ru  ( b  P  Y ) 3

お よ び2.1a‑cの 分 光 学 的 特 性 お よ び 酸 化 還 元 特 性 35  2‑3‑4.  ル テ ニ ウ ム 錯 体

R u ( b P Y ) 3

お よ び2.Ia‑cの ヘ ム 蛋 白 質 へ の 結 合 挙 動 36  2‑3‑5.  ル テ ニ ウ ム 錯 体2.Ia‑cが.促 進 す る ヘ ム 蛋 白 質 の 光 還 元 反 応 36  2‑3‑6.  ル テ ニ ウ ム 錯 体2.Ia‑cの 発 光 寿 命 測 定 と 電 子 移 動 速 度 の 評 価 37 

2‑4. 結 果 38 

2‑4・I. ル テ ニ ウ ム ト リ ス ビ ピ リ ジ ル 錯 体2.I a‑cの 特 性 38  2^・4‑2. ル テ ニ ウ ム 錯 体 の ヘ ム 蛋 白 質 へ の 親 和 性 の 検討 39  2‑4‑3.  ル テ ニ ウ ム 錯 体2.Ia‑cに よ る ヘ ム 蛋 白 質 の 光 還 元 反 応

2‑4‑4.  ル テ ニ ウ ム 錯 体2.Ia‑cの 発 光 寿 命

2‑4‑5.  ル テ ニ ウ ム 錯 体 励 起 状 態 か ら の電 子 移 動 速 度の 評 価

2‑5. 考 察

ハu n J A ι

寸 寸 / ハ

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2‑6. 結 論

2‑7. 参 考 文 献

第 三 章 再 構 成 法 と 化 学 修 飾 法 を 利 用 し た 、 亜 鉛 置 換 シ ト ク ロ ム

b

562に お け る ドナーー増感剤ーア

ク セ プ タ 一 三 元 系 電 子 伝 達 シ ス テ ム の 構 築 55 

3・I. 序 3ぞ . 分 子 設 計 3‑3. 実 験

5 0 3  

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3‑3・1. フ ェ 口 セ ン 連 結 化 合 物 3.1aの 合 成 3‑3・2. フ ェ 口 セ ン 連結 化 合 物 3.1bの 合 成 3‑3^・3. Cyt‑b_S62の 大 量 発 現

3^・3‑4. Cyt‑b_S62の 精 製

3 ‑3 ‑5 . C Y t ‑b 5 62の ア ポ 化 お よ び 再 構 成 3^・3‑6. Cyt‑b_S62の 表 面 修 飾

3^・3‑7. Cyt‑b_S62(ZnPP)‑RuAs^{お よ び C}Y t ‑bs ^6 2( 3. 1 a， b) ‑R u Asの 分 光 学 的 測 定 3‑4. 結 果

3・4‑1.Cyt‑b_S62(ZnPP)‑RuAs^{の 同 定} 3‑4^・2.U V、 蛍 光 ス ペ ク ト ル の 比 較 3‑4・3. 蛍 光 寿 命 の 結 果

3‑4‑4.  レ ー ザ ー フ ラ ッ シ ュ フ ォ ト リ シ ス 測 定 3‑5. 考 察

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6 6 6 7 7 7 7 7

7 ' 8 8 8 8 9 9 3・6.結 論  

3‑7.参 考文 献

第 四 章 ミ オ グ ロ ビ ン 表 面 へ の 人 工 ホ ス ト 分 子 の導入 に よ る、 ホ ス ト‑ゲス ト相互 作 用 を 利 用 し

た 非 共 有 結 合 系 で の 三 元 系 電 子 移 動 反 応 1 03 

4‑1 序 4‑2. 分 子 設 計 4‑3. 実 験

1 03  1 08  1 1 1  1 1 1  1 1 3  1 1 5  1 1 5 

1 1 6  1 1 6  4‑3‑1.  化 合 物 4.1‑4の 合 成

4‑3‑2.  ア ダ マ ン タ ン ル テ ニ ウ ム 錯 体 4.3お よ び 4.4の 合 成 4‑3‑3. 化 合 物 4.1お よ び 4.2の ア ポ M bへ の再 構 成

4‑3‑4.  Mb(4.1)お よ び Mb(4.2)の 分 光 学 的 測 定 4‑4. 結 果

4‑4^・1.U Vス ペ ク ト ル に よ る 再 構 成 M bの 同 定

4‑4‑2.  U V^{ス ペ ク ト ル}に よ る ア ポ 蛋 白 質 と 化 合 物 4.1お よ び 4.2の 量 論 比 の 決 定 1 1 7  4‑4‑3.  M b ( 4.2)に お け る 蛍 光 ス ペ ク ト ル お よ び 寿 命 測 定 に よ る 同 定 1 1 9 

4‑4‑4. Mb(4.2)に お け る 配 位 水 の pKaの 決 定 120 

4‑4^・5.Mb(4.1)と ル テ ニ ウ ム 錯 体 4.3に お け るこ 元 系 の 構 築 と 電 子 移 動 反 応 121  4‑4‑6.  Mb(4.2)と 化 合 物 4.4に お け る 疑 似 三 元 系 の 構 築 と 電 子 移 動 反 応 127 

4‑5. 考 察 1 33 

4‑6.結 論 137 

4‑7. 参 考 文 献 139 

第 五 章 ア ポ 蛋 白 質 マ ト リ ック ス に よ っ て 効 果 的 に 制 御 さ れ る 、ドナーー増感剤‑ア ク セ プ タ 一 三

元 系 分 子 の 電 子 移 動 反 応 経 路 と 電 荷 分 離 状 態 143 

5‑1 . 序 143 

5^・2. 分 子 設 計 146 

5・3. 実 験 148 

5‑3^・1. Cyt‑b_S62お よ び M bへ の 再 構 成 1 48 

5^・3‑2. 化 合 物 5.1，Cyt‑b_S62(5.1)お よ び Mb(5.1)の分子モテ・リンク 1 48  5‑3‑3. Cyt‑b_S62(5.1)お よ び Mb(5.1) の 分 光 学 的 測 定 149 

5^・4 結 果 1 50 

5‑4‑1.  U Vス ペ ク ト ル の 比 較 1 50 

5‑ι2. 

U  V

ス ペ ク ト ル に よ る ア ポ 蛋 白 質 と 化 合 物 5.1の 量 論 比 の 決 定 1 5 1  5‑4‑3.  分 子 モ デ リ ン ク に よ り 予 測 さ れ る 化 合 物 5.1 と 再 構 成 蛋 白 質 内 の 5.1の 構 造 1 5 1  5‑4‑4.  蛍 光 お よ び 励 起 ス ペ ク ト ル 、 蛍 光 寿 命 測 定 結 果 153  5‑4‑5.  レ ー ザ ー フ ラ ッ シ ュ フ ォ ト リ シ ス 測 定 1 56 

5^・5. 考 察 166 

5‑6. 結 論 5‑7. 参 考 文 献

第 六 章 結 言 6^・1. 本 研 究 の 成 果 6‑2. 参 考 文 献

謝辞

177  1 78 

182  1 82  185 

立 早 緒 言

宮内

1・1.序

ゲ ノ ム か ら ポ ス ト ゲ ノ ム へ

1970年代に開発された遺伝子組み替え技術と DNA塩基配列決定技術は、ノ1.=物学、'[.=命科学に市命的な 変化をもたらし、新しい遺伝子の発見を次々に可能にした。特に、医学および薬学分貯への氏￨猷は大きく、

免疫グロプリンや T細胞受容体などの免疫系を支配する遺伝子や、ヒト成長ホルモン

などの医薬品として有用な物質の遺伝子など、数多くの医学上主~な jlt 伝 r の配ダIJ が決定されて

インターフェ ロン

、，

、ー』

た

の様な疾患関連遺伝子の全配列を決定しようとする試みの中で、現花まで~11之も研究者の

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日を集めてきた のが、がん遺伝子の解明である。1986年に Scicnce紙上で提案された、がん解明のためのヒト全ゲノムの 解析は、 1991年にヨーロッパ、アメリ カ、日本を中心とした国家プロジェク ト「ヒトゲノム計1[可」として 公式に具現化され、現在も研究が進められている 1)。ゲノムとは一口で言えば生物の極を決める遺伝情報 ヒトゲノムは22対の常染色体と雌雄一本 ず つ の 性 染 色 体DNA中に収められている。既 の総和であるが、

に多くの病原ウイルス、大腸菌、枯草菌、酵母などの全ゲノム解説は終了しており~.-I)、

ても、ようやく染色体の一つ(第22染色体)については全I益法配列が解説され、あとわず か数年でぺそての解 読 が 終 了 す る で あ ろ う と 言わ れ て い る 九 ilj‑伝 的 な 性 質 がiは も 良 く 解っているキ111'tiIである大腸Ci‑i

ヒトゲノムに関し

(Escherichia coli)でさえ、約4000の遺伝子をも っているが、その全ゲノム↑

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，

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を明確に11¹，米たのは灼くべき ゲノム配列からその機能が推定される既知のものは全配列の数卜%にしか過ぎず、

進歩である。なぜなら、

従 来 の 遺 伝 学 に よ っ て は 発 見 さ れ な か っ た 未 知 の 機 能 が ゲ ノ ム 解 説 に よ って 引 き 出 さ れ る 可 能 性 が あ る からである。手 に 入 れ た ゲノム情報から大腸菌の全ての機能 を 明らかにし、また逆に、大腸菌細胞をゲノ ム情報に基づいてーから再構築することも近い将来可能になると予測される。

4次行~i;Ïであるアミノ

‑つは蛍

( 1 1 1

の

1

豆類あり ゲノム DNAに書かれている情報には大きく分けて

酸 配 列 を 決 定 す る コ ー ド 配 列(opcn陀adingfrarnc)であり、

リボソーム上でトランスファ‑RNA(tRNA)の仲介を受けてアミノ同支配列に制訳 するために必要な、多種類のシグナル配列である。ゲノム配列が決まれば泣伝子のモザイクHI}Attの規則性 コード 配 列 を メ ッ セ ン ジ ャ ー もう 一つは、

RNA(mRNA)に読みとり、

に従って、まずコード配列を推定することができる。真核生物のコード配ダiJはエキソンとイン トロンに分 断されており、イントロンを含む様に転写されたmRNAはスプライシングによって、イントロンカ

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JlI徐さ れる。この後リボソーム上でアミノ酸配列に翻訳され、ゲノムがコードする蛍ピ

1 1 1

が生産される(凶ト1) 

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s  ゲノム上の機能エレメント

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しかしなカf ら、ゲノム自c:~Ij-IJ{解明されたとしても、そこに415 かれた:0Jlふを君jl 併することは草子易ではない ふのため現在では大別して、次の二つのタイプの研究を進める必~がある とf考えられている。一つは、 ja 伝子を人為的に破壊あるいはク口一ニングすることによ って、 変異ili伝 r を(間体や細胞に羽入し、 Jく Jx 理~!

や 遺 伝子発 現 など が ど う変 わ る か を調 べることでその近 伝j三の機能を

1 f t

祭 し よ う と す る 泣 伝学的な研究 であるごもう一つは、コード配列から発現される蛋白貨の構造と機能をあらかじめゲノムから批祭しよう

とするものである。

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走者は実際に、ポストゲノム時代の大きな課題として掲げ.られており、ヒトを合めた 地球上のほとんどの生物中の染色体 DNA の解説が終了すれば、ゲノム j瓦 jL 配列 ~1J の蛋白 ft をコードする 塩基配列と表現蛋自民との対応づけがより急務になるだろっと言われている。蛍

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におけるアミノ西支配 列と構造の多様性は、生物進化の過程で遺伝子を変異させることによって作り山されてきたが、

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淘j太の中での遺伝子進化、変異の法則を、ゲノム配列の巾に見出すことが

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米るかどっかは市大な問題で ある。また、ゲノムの大規模な探索によって、従来の遺伝学的な手法ではrljJま発見し得なかった未知蛋白 質が我々の目前に提供される可能性があり、その情造と機能をどう関述づけて評価するかについても議論 されなければならない。そうした観点から、既に現時点においても、発現される蛋白質の構造と機能をゲ ノムと関連づける、ポストゲノムの立場からの研究が開始されつつある日)。

ゲ ノ ム 科 学 と 蛋 白 質 工 学

ポストゲノム時代における新規機能性蛋白貨の創出のためには、ゲノム科学だけでなく、吋然、泣伝学、 生物学、分子生物学、分子発生、進化学、遺伝子工学といった分野からの研究を必要とするであろうし、

発現された未知蛋白質の構造とその機能を評価するためには構造生物学、

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白質工学といった分野からの 境界を超えた研究が必須となる。近年の分子生物学や蛋円

1 1

て学の進展は、天然に存在しない安門賞の開 発を可能にしており、今や、蛋白質は生物学者のみの研究対象ではなく、 l沈に分子レベルでの議論を可能 にするナノメートルサイズの分子機械として扱われ始めている。従って、i.Ii

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工学、あるいは併造生物 学との境界領域でのボーダレスな研究によって初めて、 「ゲノム(DNA)の 情 報 がRNAを通じて、蛍内貨の 機能と構造にどの様に伝搬されているか」とし寸追伝現象の統一的な解釈、すなわちゲノムと衣現長lコ貨 の対応付けが成し得るのではないだろうか。もしそれが近い将米可能となるならば、生命科学、て学の大 きな目標である、望みの機能を付与した蛋白貨の設計を自在に行うということがまさに現実へと変わり、

人類は21

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紀に忽像もつかない「生命

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を手に入れることになる。

1 ‑2.新 規 機 能 付 与 の た め の 蛋 白 質 エ ン ジ ニ ア リ ン グ

人類に有用な新規の蛋白貨を創製することは、生物化学や分寸二

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物学といった学問的立場‑からの興味を 集めるだけでなく、現在地球規模の問題として取り上げ.られている環境、資源問題に対しても工学的に重 要な意義を与えると考えられるc 古典的な化学修飾によるに学的k工場・からの安口氏の改変は、 11土適 pHの 調整、耐熱性、変性剤あるいは有機溶媒に対する

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構詩造的強化を行うことを目的とした。‑)j、分子生物学からの泣伝子工学は蛋白貨の部位特 異的変異体の作製を可能にしたが、そのほとんどの場合、天然型蛋白貨の機能を低下させる結果に終わり、

蛋白質の機能向上や新規機能の付与を誘導することは思く言えば偶然に頼るところが多かった。しかしな がら、近年では蛋白質の構造と機能の関連が徐々に明確にされており、工学的な立場からも天然蛋白貨の 機能向上がかなりの精度をもって行えるようになりつつある。そこで、以下には近年の蛋白質工学あるい

2 

は遺伝子工学の分野において間売されたがf規機能性長ピ

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のいくつかを{)iJIに挙げながら、 iえj庄の手法つい

J 簡単に述べることにする『

1・2‑1 . 遺 伝 子 工 学 的 手 法 か ら の 機 能 性 蛋 白 質 の 創 出

分子生物学、蛋白質工学の立場に基づいた、従来の ill{Z~ r 亡学的千 ä~ による新規機能性iIlf 1~11Jl の|泊先に おいては、構造生物学の分野から与えられた天然型蛍山貨の :次構造を参与にして、ぷ穴，i2，pil¥t L~I)

i ι ( 7 l

^fj性中 心)付近や高次構造に影響を及ぼすと考えられる蛋自民衣而のアミノ酸残必を変換するという、点突然変異 (ポイントミユーテーション)が古くから用いられている。これまでに天然町長(11'[の侠能化を行った例と して、 Sligar らは、ヘム蛋白貨の一つであるシトクロム払の軸配位子である His を Mct に変 i~をすることで、

電子伝達蛋白貨がN‑デメチラーゼ活性を発現する醇素へと変換されることを報行している ^S) Monte11uno  らはミオグロビンの遠位配位子His64をValに置換した変具体を作製し、フェリル酸素移

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による

ι

体 選 択的酸素添加反応が効率的に進行することを示した 9)。こうした手法においては、あらかじめ長r'1 1'1 H/}

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のモデリングなどから、構造および機能が著しく変化するであろうと考えられる位換部位を幾っか選択し、

分子設計に基づいた遺伝子操作を行うのが基本である。そのため、 1)iylS 

¥ f L 

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的に複数のアミノ般の[丘換 が可能である、 2)変異蛋白質の構造と機能の相関を明確に評価tH米る、という利点をイjするが、 ‑)jで、 アミノ酸の選択や導入位置は人為的であるため、あるれ皮FfJ.l，された花IJHI付でのiIfl(1'1

1

の彼自色 lilJ̲l:̲しか望 めず、全く未知の機能を引き出すことは難しいと考えられる。

遺伝子工学の分野における DNA合成技術の進歩には目覚ましいものがあり、 11之近で、はDNAオリ ゴマー は容易にかつ迅速に入手することが出来るようになった。蛋白質工学の分貯においては、 こうした DNA オリコゃマーの配列設計を利用することによって、目的の変異を選択的に起こす技術も既に目先立されている DNAオリ ゴマーを利用した興味深い例としては、同 1‑2に示す「分千進化」 的 下j去が挙げられる。これは、

あらかじめ化学的処理やシャツフリングなどによってランダム に 変 児 さ れ た オ リ ゴDNAを利JlJして、蛋 白質の特定ドメインのアミノ酸を全てランダムに変換し、莫大な数の変

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f"':11'Iライブラリ ーの'1¹から、

目的とする機能性蛋白質を効率的に選別、獲得しようとする試みである。この下法における^jは大の特徴は、

蛋白質工学とコンビナトリアルケミストリーの融合であり、これまでのポイントミューテーション的手法 では行えなかった蛋白質の未知の機能を迅速なスクリーニングによって許制で‑きる点にあるcこうした進 化的手法によって得られる泣伝子配列と蛋白究機能との相関は、ポストゲノムにおける新脱会同I^ll1'[の探宗 に工学的な立場から重要な知見をうえるものと J~J 待される門 図 1-3 にはポイントミューテーション法と、

進化的手法(di問 tedcvolution)の違いを模式的に示す

3 

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図 ト2. D N Aオリゴマーを 用 い た 蛋 白 質 ラ ン ダ ム 変 民 体 の 作 製1111

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combinatorial approach 

図1‑3. 部 位 特 異 的 変 異 法 と コ ン ビ ナ トリ アルな進化 的 下法の比i絞1'i)

この係な手法による新規機能性蛋白貨の探索は変異蛋白質ライブラリーからの選択という点において、

Schultz、Lcmerらが見出した抗体触媒(catalyticantibody)保 索 の 手 法 に 泣 い(

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j[i:ではAmold、Loeb、HiIvert、

Stemmcrなど が 徐 々 な 蛋 白 質 で こ の 手 法 を 取 り 入 れ て お り 興 味 深 い 成 果 を 欽 多 く 部 作 し て い る 1111九 その 一例を挙げ、れば、 A m oldらはPseudomonasputiぬから得たシトクロム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナーゼを万戸1J

1

.Jけ て進化させ、約200000稔の変具体の中から、 j品目変化水素を利用したナフタレンのノ

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[‑なしで 天然型の20倍 以 仁 の 速 度 で 進 行 さ せ る 変 異 体 の 発 見 に 成 功 し て い る 1(11)r H i Ivcrtらはホモ こllt体で、ある

k

腸薗chorismatemutase(CM)の 触 媒 部 位 に 関 わ っ て い る ヘ リ ッ ク ス lに つ い て 、 そ の ヘ リ ッ ク ス 鎖 中 の 配 列 をランダムにデザインし、多数の変異体の中からiii̲‑む体としてもおい

i l i

性 を 維 持 す る も の を 発 見 し た。こ れ は 進 化 法 に よ る 機 能 性 蛋 白 貨 の ダ ウ ン サ イ ジ ン グ と し て 興 味 深 い 1~ヘ しかしながらこうした分子進化の 淘 汰 に よ っ て 獲 得 さ れ た 機 能 は 、 完 全 に そ の 蛋 白 貨 の 併 造 に 先 ん ず る も の で あ り 、 発 現 さ れ た 機 能 か ら ア ミノ西支配列の相向性は検証出来るものの、 三次元的立体構造に関する情報へとフィードパックすることは

4 

現段階で(ま困難な場合が多い このことば‑般的に、 RNAの 進 化 l三{.や

i / c 1 1

内，!I'似 に つ い て も 勺 て は ま る こ とであり、配列情報と機能との相 tY~J についてはスクリーニングの結 ~l~ からr-;!!IJが つ く も の の 、 そ の 立 体 的 造 に つ い て は 研 究 が 立 ち 後 れ て い る このことは本下法における今伶の Ul~~:mである

1^・2‑2.合 成 化 学的 手 法 か ら の 機能 性 蛋白質 の 創 出 de n 0 voデ ザイ ン

現 在 ま で に 蛋 白 質 工 学 あ る い は 構 造 生 物 学 に お け る 研 究 を 通 じ て 、 央 大 な 放 の 長l'1 t'Iの :次 仇 込ことその 様能に関する情報が蓄積されている( これらの'1'，日f~ を北に、 全く合成化学的な心;場ーから長 l'1 t'tの

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お う と す る 試 み が あ り 、 こ う し たd:novoデ ザ イ ン は、遺 伝 チ 工 学 的 手 法 と、fi.;ん で 現 花 の 蛍(1

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ける 一大 潮 流 と な っ て い るuこれはMcrritieldに よ っ て 開 発 さ れ た ペ プ チ ド，I'，H!I合 成 法 の

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ーによるところ が大きく l 凸}、 数十残基のペプチドについては作易に入手できるだけでなく 、 実際に 100残 )t!~

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伎の疑似合そ 白 貨 の 合 成 も 可能となっ て い る か ら で あ る )7.)九 段 も 初 期 的 な段附での dcnovo設 計 は、OeGradoらによ っ て行われた4ヘリックスパンドルの構築が挙げ られる )YJo4‑ヘリッ ク ス パ ン ド ル は シ トクロム b¥'(l2や ミ オ ヘ ム エ リ ス リ ン な ど の 天 然 蛋 白 質 斗lに 見 ら れ る 重 要 な構造 で あ るつ彼らは以ドのじ(1I‑..fに/兵す校な α‑ヘリ ックス構造^aのデザインを行い、これを 三量化 し た2‑ヘリックスペプチドがノ

k

溶液'1'で

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^{己 会 合 し て4ヘリ}

ックスパン ドル構造を取ることを明らかにしたい~J，。さらに 一木 飢 と し て，Jh]快した64伐jたからなるペ プ チ ドは水溶液中において4ヘ リ ッ ク ス パ ン ド ル へ と 折 り 公 ま れ る こ と をIJミしているいλ)

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Ac・GElEEllKKLKElLKG ‑COOH  Ac ‑GKLEEll附くII王El阿3・COOH

16 + 16 residue Peptide X 2ミ 二 士

64 residue Peptide 

図1‑4. 4‑α‑ヘリ ック ス パ ン ド ル の dcnovoデザイン

こ う し た 例 を 契 機 と し て、こ れ ま で に 多 数 のdcnovoデザインペプチドが介成され、 Coilcd‑CoiltI~辺 211・271

や、 ヌーヘリ y クス:!i'\ーは l 、 βシート早川)、 日ーサンドイ y チ-I-I.-I~J 、 αß-複合体 4リ '\1，などの校卒fË なデザインも nrtj~ と

なっている こ れ ら の ペ プ チ ド に つ い て は 分 子 モ デ リ ン グ やX級ネ九日間治解析が行われているものもあり、

ふ の 情 造 に 関 し て は 多 く の 情 報 が 得 ら れ て い る また、最近では[1:11 ろ に 示 す 係 に 、 ス プ ラ イ シ ン グ の 観 点 か ら 個 別 に 設 計 さ れ た 数 十 残 基 の ペ プ チ ド を化学 的 に 連 結 し て 、 長(1

n

の 介 成 を 行 お う と す る 試 み が

Kentら に よ っ て 提 案 さ れ て い る 勺 川 その一例 と し て 、 彼 ら は ペ プ チ ド チ オ カ ル ボ ン 阪 と ブ ロ モ ア セ チ ル 化ペプチドとの結合反応を利用し、 202 残基の HfV プロテアーゼて泣体の合成に成功している'\~，^{) さらに、} こうした手法1固 相 合 成 に も 適 用 で き る こ と が 示 さ れ て お り 州 、 ト ー 記 に ポ し た 絞 維 な 構 造 の ペ プ チ ド 単 位 を順 次 組 み 合 わ せ るこ と で 今 後 よ り 洗 練 さ れ たdenovo蛋 白 貨 の 設 計 がl可能になると期待されている

コ

。 川 : : 。

^R

HrγNH 

3 H 

ρ  H 

SR  H 3 

C‑terminal Scgment 

。

CO₂‑

Target Protein  図ト5̲Chcmical Ligationによる長自

f t

^令成

し か し こ れ ま で に 報 告 さ れ た 長 鎖 ペ プ チ ド に よ っ て 出 成 さ れ る 必 110VO

i l i  

l' J 伐の多くは、(1 )将人するア ミノ般に制限がない、 (2)大量合成可能、 (3)フォールデイング、変'1''1::泊料仰?誌を合む‑‑次fll:j

i l i

の解析にJ!tIす る 、 と い う 利 点 を 有 す る た め に 大 変 魅 力 的 で あ る が 、 現 段 階 で は 天 然 蛍 白 釘 を 凌 ぐ 程 の 機 能 を 狼 科 し て い るとは言えないD したがって本手法は、蛋白質の新規機能発現という而に限れば、泣伝子 [乍による天然、

型蛋白貨の改変とし、う手法に比較してやや見劣りする部分があるぞ

非 天 然 ア ミ ノ 酸 の 利 用

天然安白質を構成している 20槌 煩 の ア ミ ノ 般 に 限 ら ず 、 有 機 化 学(1なに令成した非天然アミノ般をilf(1  質中の任意の位置に導入することができれば、蛋白貨の機能を出IJ(I~ に改変 UJ1 米る可能性がある。 尖|際、非 天然アミノ酸の導入はペプチドレベルにおいても有効であり、そのfI~ili に去しく影響を及ぼし、これまで に 天 然 ア ミ ノ 椴 で は 構 築 で き な か っ た 伎 雑 な 構 造 を 形 成 す る こ と が 山 来 る M4710 以 ド に は そ の 例 を 幾 っ か 不す円

ペプチドの二次構造を大きく変化させる非天然アミノ際として、 αーアミノ椴誘存体を合め、 (0)ーアミノ 酸、 β アミノ殿、 y- アミノ酸、階アミノ般などが知られているJ 例えば、 ~l ^1‑6に示す線なペプチドオリ コーマーは、興味深い二次情造へと折十

) 5 2 :

まれる。Gdlmanらは I・1の 係 な シ ク ロ ヘ キ サ ン を

f ' J .

^怖とした β アミノ酸オリゴマーを合成し、これらが水中において 31~ ヘリ y クス防法を取ることを rifl らかにした帆ヘ またSωbachらはI^・2の様なβアミノ般オリゴマーを合成し、 12

ハ o ハ

2ヘリ ックスという興味深い併追を構 築することに成功している M さらに Hancssian らが合成した y- アミノ般からfI~h文されるオ 1) ゴマーI・ 3 は 2.61~ ヘリ y クス情造で安定に存花する弓71ー こうした 12- ヘリックスや 14- ヘリックスは天然には兄られな いことから、現在非常に注目を集めている構造である。

6 

円 ト

￨ 竹

町

図 1‑6. 種々のヘリックス情造へ折り

4 2

まれる非天然ペプチド

これに並行して、ターン構造、シート構造の構築や環状ペプチドの情築を行おうとする試みもなされて いる。従来のターン構造やシート構造の構築には、 KcllyやNowickらが行った株なテンプレートを利

J J J

し たものが主であったが凸礼町、 GellmanおよびSccbachらは βアミノ般を用いてそれぞれ 1‑4、I・5の校な β ターン構造の構築を可能にしている恥爪1)。また環状ペプチド構築の例として、 IshidaらはluijlJII'rな併造のy‑

アミノ酸を利用して、環状ペプチドI・6の合成に成功した7h)c さらに Ghadiriらのイf名な研究として、 (0)ー アミノ般を利)fjした環状ペプチドがあり、これはペプチドのrI己会合によりイオンチャンネルという機能 を獲得することが報告されている moこの様なことから、

J I =

天然アミノ般からHI]}ぶされるオリコーマー悦

i E

はかなり多様であると言える門

NH₃+ CF₃COO. 

1・5

H.・e・'''''''1、.r

l

へ

NH3+ CF，_3'‑'VVH0COO. 

2C 

1‑4  1・6

凶 1‑7. ターン、シート情造および環状ペプチドを形成する

J

ドベ然ペプチド

こうした個々の非天然アミノ取が発問する性質によってペプチド;次情巡の;印刷lを行う例以外にも、機 能性分子を導入したアミノ般を利則して、外部刺激によってペプチドN1t

i l i

を変化させるという例も祁行さ れている 7X.7'.11 Hopkinsが合成した、(i， i+3)あるいは，i(i+4)の位泣にイミノ;昨般をイ{する

J I :

天然アミ ノ般 を導入したペプチドは、 Cu²+イオンの燥な金属イオンのイ子千EFでそのヘ yリクス情j去をぷ:しく安定化する

11)  1m peri al iらは栂々の金属配位部位を有する非天然アミ ノ般 I・7 を合成してペプチドに導入し、金以と の錯化不動を詳細に検討している~¹¹ こうした非天然アミノ般は、 SasakiやGhadiriらのヘリックスパンド ル形成の報告に見られるように、金属錯体をテンプレートとした d:.:/]0 vo蛍l'ln設計への応

J I J

が期待され る'2月，，;~~ ^I  さらに、フォトクロミ yク分子であるアゾベンゼンを訂する

J I :

^{天然アミノ肢1・8の合成も報缶}

されている )¥'1 1 ・ 8 を含む環状ペプチドは光あるいは熱といった外部刺 ~~í にょうて、シスートランス民性化 こ伴う大きな構造変化を引き起こすことが明らかとなっている

7 

()  (1  ~

ρ r ‑   ， " N

^'N'

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2N"へC0₂H .~

1 

卜7 H₂N'、C02H

C02H 

C02H 

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︑

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刊4

MH  

C02H 

図 1‑8. 金属錯化部位およびアゾベンゼンをイ{する

J I :

^{天然アミノ円安}

蛋白

1 1

が 発 現 す る 機 能 は 、 変 性 や フ ォ ー ル デ イ ン グ と い っ た マ ク ロ な 三次fII

L l l t

の安化によって

; : 3 7 4 1

を受 け る が 、 む し ろ 活 性 中 心 周 辺 と い っ た 機 能 発 現 に 重 要 な

r m

位 で の 微 悦 的 な 環 境 変 化 に

; t i l j i

却 さ れ て い る 部 分 が大きい。これは従来のポイントミューテーションによる検討からも明らかな紋に、長白f1r^JJ'のあるアミ ノ 酸 配 列 の 置 換 は 、 そ の 周 辺 ア ミ ノ 酸 残 基 と の 相 互 作 用 を一変 さ せ る た め 、 烈

I !

UJという形で活性'1¹心 付 近 に構造変化を誘起するためである。従 っ て 、 上 述 し た 様 な ペ プ チ ド レ ベ ル で の

J I :

天然、アミノ酸の導入によ る「構造変化

J

を、効果的に蛋自民へ利用しようとするならば、触似活性呼に関ヲーしたアミノ般をIfl(接 変 換することはもちろん、活性巾心や 21511 認識部位といった機能発現に:m~ な的所周辺への JI:天然アミノ般 の導入が有効であると思われる。一方、構造変化をitfr^Lll1の機能制御のためのエフェク ターと しない場介 には、酸化還元活性な非天然アミノ酸を導入し、蛋白質内の電子移動反応、を介して活性t!，心の

I

般 化 泣JC 状 態 」 を 制 御 す る と い う 方 法 が 有 効 で あ ろ う。蛋白質内では長距離の氾子移動反応が可能であるので、ユト 天 然 ア ミ ノ 酸 の 導 入 位 置 は 活 性 中心 近 傍 で な く と も そ れ ほ ど 問 題 で は な い か ら で あ るL この綾な 2つのス

トラテジーに従って、蛋白質への非天然アミノ般の導入法が現在までに幾っかり日発されている。

蛋白質に非天然アミノ酸を導入する、代表的な

) h t

は次の 4つである亡すなわち、(1 )化学合成法、 (2)七 ミシンセシス法、 (3)誤 認 識 を 利 用 し た 納

n

包内合成、 (4) ミ ス ア シ ル 化 ト ラ ン ス フ ァ‑RNAを利

J I J

した細 胞外合成、であるn

(1 )に挙げた化学合成法は、いわゆるペプチド合成の連続であり、

a

nOvQデ ザ イ ン で 述 べ た)J法 論とみ' 質的には変わらない山的。 選択するアミノ酸の極類や数に ;!Jlj 限がなく部位特児 (I'J な手法であり、大 11;; イ;J~

が可能という手1].1去をイ干する。代表例としては、 Wcllsらによる

3

非ド

l

:天?然点アミ ノ何般交j担盟ヒスチシジ ンをi力!手人した1リj  ボヌクレア一セゼ の合!成￡が学げ、られるH州，1勺

1

彼皮らはj泣立(伝i丘:了下4工マ学:ゴ的!内ヲに作製したペフプ。チドf リ1jガ一セゼ、を不引利リ

W

刊JJ川川!日jして、 4‑

‑

フルオロヒスチジンをリボボ ヌクレア一ゼゼ の j活古百引，↑性￨

ボボ ヌクレア一セ の j加J川日水分角解平活性は天然のものに比べてかなり低いものであるが、同友性条

1 ' 1

ニ下において加水 分 解 反 応 を 促 進 す る と い う 興 味 深 い 結 果 を 得 た。

(2)の セ ミ シ ン セ シ ス 法 は 蛋 自 民 を 特 定 の 部 位で切断 し 、 そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト と 別 途 に 合 成 し た 非 天 然

ペプチドを再び結合する方法である跡引)p 代表的な例として、 Grayお よ びImrcrialiらは、実際にペプチド レ ベ ル で 金 属 と の 錯 化 が 硲 認 さ れ た ピ ピ リ ジ ル ア ラ ニ ン を シ ト ク ロ ム cのセミシンセシスに応、川した 彼 らはここに、ルテニウム錯休を錯化させることによっ て 蛋 白 質 内 氾 子 移

! I f )

^J反 応 を 検 討 す る こ と に 成 功 し た

((>JI  lmanishiらもシトクロム cの化学 的 合 成 に 成 功 し 、 ピ レ ニ ル ア ラ ニ ン や フ ェ ニル グ リ シ ン と いった芳

香族非天然アミノ肢を導入しているり(l， Hamachiら は リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼSの

s ‑

プロテインと

s ‑

ペ プ チ ド 複 合体に着日し、イミノ二酢 酸 や ア ゾ ベ ン ゼ ン を 修 飾 し た

s ‑

ペ プ チ ド を 別 途 合 成 す る こ と で 、 新 鋭 機 能 を 発 現 す る リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼS を合成した(図 1̲9)X71 こ の リ ボ ヌ ク レ アーゼ

s '

は 金 属 や 光 と い っ た 外 部 刺 激 に

8 

応答し、活性中心に関与した2つ の Hisが S‑プロテイン、S‑ペ プ チ ドfHlJに作々 lつずつ存'(1:するため、 j)l1 水 分 解 活 性 の人為的なオンーオ7~JIj御が可能である。この係な七ミシン七シス jj、は天然 itlf(J 

1 ' I

からの プ ラ グ

メン ト化が 本 質的に重要 であり、適用出来る蛋r'lnに 制 限 が あ る が、機 能tLit

! f   [   '

1 

n 

L~ l1合のための打力な干 段である』

Mutantら peptlde

Semisynthesis 

ー

^.~

Natlve S世 間teln Rlbonllclea~c S 

図 1‑9. セ ミ シ ン セ シ ス 法 に よ る リ ボ ヌ ク レ アーゼS'の 合 成

(3)の誤認識を利用した蛋白質合成は、非天然アミノ酸の存在下で大腸的などの宿主主を行い、大腸菌‑のア ミノ酸誤認識を誘導して非天然、アミノ酸を蛋白質に導入する方法であるり4勺。リ し か し な が ら 本 下 法 は 天 然 ア ミ ノ 般 に 類 似 の 非天然 ア ミ ノ 酸 し か 利 用することがIlj米ず、古!日立特児1(りでないという

I I J J m

点を合 んでい るc

(4)の ミ ス ア シ ル 化tRNAを 利 用 し た 細 胞 外 合 成 は 、 あらか じ めtRNAに

J

ドパ然アミノ般をifl

. i Y

しておい て 、 細 胞 外 蛋 白 質 合 成 を 行 い 部 位 特 異 的 に 非 天 然 ア ミ ノ 般 を 導 入する)J法である(凶ト10)リh州 イJ名 な 例と しては、 Schu1tz らによる光駆動型 T4 リゾチームの開発が挙げられる。 i1î 'l"t¹1¹心に光解裂 J~~!の保 J~!f )J~

( ト s ‑

ニ ト ロ ベ ン ジ ル ア ス パ ル テ ー ト を 導 入 す る こ と で 、 光 照 射 に よ っ て 活 性 カ¥IIJ1復 す る 光 駆jOJalの 蛍 白 釘 を 合 成すること に成功した州『しかし彼らの 開 発 し た ア ン バーコドン(終止配列)をJI1し3る方 法では;切りとljてら れ る ア ミ ノ 酸 が一つに限られているために、複数の非天然、アミノ般を導 入することは 州 航であった。そこ でSisicbらは4塩 基 コ ド ン 法 を 用 い る こ と で 、 蛋 白 質 に 絞 数 個 の 非 ノミ然ア ミノ般1(ヌI1‑11)をiZ人すること を可能にした。これによって蛋白質￨付エネルギー移 動 や 定 千 移 動 反 応 を 杭 々 の ク ロ モ フ ォ ア の 泊lみ 介 わ せ で 行 う こ と を 可 能 に し て い る l)l))。

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A a一 N e一

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TAG‑mutated  plasmid 

Mutant protein  contatning unnatural 

amino acid  図 ト10. ミ ス ア シ ル 化tRNAを 用 い た 細 胞 外 蛍 自 民 合 成%pl

9 

COOH  COOti  COOH  COOH  COOH  COOH  COOH 

刷 己 。

同

h 弘 ^{" ゐ 内 包}

l‑naph山ylal且nine 2‑naphthylalanine  9‑anthrylalanlne  9・phenanthryl‑ I‑pyrenylalanine  p‑biphenylalanine  2‑an山rylalanine alarunc 

叫 己 も "

COOH  COOH 

"Nh 

" N 2 1   ^削ぺ 九 同

O:zN‑"" 

0 ‑ N

² 

_N  do 

p‑nitrophenyト 3.5‑di nitrophenyl  ^{M./ ¥  M.}  9‑carb日olyl・ aLl汀yptophan alanine  alanine  p‑dime山ylamino‑ alaninc 

3・(9‑ethylcarbazol yり 2・pyrcnylalanine phcnylalanine  alanine 

COOH  COOH  COOH  COOH 

州 刑

日

^kynur

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^N 己 。

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enzoylphcnyト

^{、 刷}

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^{G B}

^rla^on^c

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i^en^nyc^l ・ 2‑anthraquinonyl‑

p‑phcnylazophenyl・ alanine  al:lnine  alarune 

図トJ1 Sisidoらによって導入された非天然アミノ般州}

以上の様な観点から、有機化学的な立場ーからの非天然アミノ酸の蛋 (111への

4 4 .

^{入は、 j}立(え

r

^{工学(()手法}

に勝るとも劣らない有効な手段であることが解る_E しかしながら、こうした化学的下法の共通の日!j題点と して、機能改変の目的と手段が

J ̲ ‑

手 く 合 致 し た 場 合 に の み し か 、 そ の 下jυ法j去;の版凶戚j父iυj刈J^をづ発(;1川li市IU^￨ハ山l米 な い と い う / が挙げ、られる。そ の た め に 、 非 天 然 ア ミ ノ 酸 を 用 い る と い う 手 法 以 外 の 、 よ り 多 校 でN

i 1

ftf^な)hl~lii命の1m^発 が望まれているu

補 因 子 の 再 構 成 に よ る 非 天 然 分 子 団 の 導 入

ゲノムコード泣伝子の|行部に従って、リボソーム上で発現するi.t~îln^{は必本的には} 20 干^lJ[iti^{のノく然アミ} ノ酸の組み合わせによって成り立っている このゲノムコード蛋(1貨 の 幾 つ か に つ い て は 、 尖

￨ η

_に多段な

機能を発現するために、 (1)結鎖の付加、(2)リン酸化、(3)スプライシング、 (4)防丘小

J

}JII、(5)ili

じ 1 1 ' {

の 二

: i f

化などの翻^:j訳後の調1~を受ける([主[ 1‑1 ) ゲノムにコードされて党現された蛋r'111を合め、主111胞を情築して いる蛋白質全てをゲノムという

7 7 ‑ A 5

に関述づけて「プロテオーム

J

^{とH子ぶが、プロテオームにおける制沢}

後 過 程 で の 蛋 白 貨 の 機 能 化 は ポ ス ト ゲ ノ ム 時 代 の 霊 安 な 課 題 で あ るJ.~:IIIJ]包|付においてはこの級な調印機併 によって、アミノ酸以外の生体物質をき)f位 特 兵 的 に 長IJ

1 1

に修飾し、機能発現に不可欠な

2 5

^ぷをflIJ^うシス

テムが長いi_r=‑刀をかけて確立されている こ う し た 観 点 か ら 、 ア ミ ノ 般 以 外 の 生 体 物 釘 を 利JTJ^{して蛋内質}

へ の 修 飾 と 機 能 化 を 行 う こ と は 出 来 な い だ ろ う か ? 故 近 開 発 さ れ た 手 法 と し て 、 長 白

f f

の 機 能 発 現 に 不 可 欠な要よで、ある

I f r

lJ因子」に着目した研究が行われつつある)

補因子を利用した蛋白貨の部位特異的化学修飾、機能制御を行うための手法はHamachiや Will山 rらによ って提唱されている一すなわち、補囚子はアポ蛋白質(酵素)と非常に高し、親和性を示すことから、あらか じめ目的の機能性分チ団を補因子に有機化学的に修飾しておき、それをアポ蛍仁

1 1 1

^{に再構成するという戦}

ハU

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