円 ︒

THF‑MeOH 

3.1a 

スキーム 3‑1. フエロセン述結化合物3.1aの合成

N ‑Boc‑N人 フ 工 口 セ ン カ ル ポ ニ ルー工 チ レ ン ジ ア ミ ン 3.3の合 成

100 ml二口反応容器にフエロセンカルボン限3.2を600mg(2.61x 10・1mo、り BOP結合斉IJ1.38 g(1.2 cq.)  を入れ脱気窒素置換した。ここに乾燥N，N二ジメチルホルムアミド(DMF)を10ml J)IIえ出解した。さらに一 ノN‑Boc‑エチレンジアミン500mg( 1. 2 eq.)の乾燥DMF溶液5mlをJJIIえ、 N，N二ジイソプロピルエチルアミ ン(DIEA)400 mg( 1.2 eq.)を加えて室温で 12時間撹持した。反応終了後、溶似を減!凸?去しポンプで乾燥し た。残

i

査を 100mlのジクロロメタンに溶解させて、蒸留水 100mlで三回洗浄した。ヂJ機肘を分取し、 J!正 水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去したc得られた黄色固体をシリカゲルカラムクロマトグラフフイ ー(展開溶媒:ジクロロメタン→ジクロロメタン:酢酸エチル=1 : 1)で中，'f~\~した 出似をWf

L ‑

し

f k

色川 体を得た。収量830mg(86 7c，)。

FT‑IR (KBr); 1690 cm"(ウレタン Cニ0)，1640 cm"(アミドC=O)

'H NMR(250 MHz， CDCIi， TMS基準，. rt.)  ; 8 / p p m = 1. 4 (s， 9 H， t ‑B u  ，) 3.4 ‑3. 5 (t  x 2， I 0.0 H Z， 2 II x 2， ‑ NHCH]CH]ヲNH‑)、4.2(s，5 H， H二infcrrocclle)， 4.3(s， 2 H， m‑H‑in  fcrroccnc)， 4.7(s， 2 H， o‑H‑in  fcrroccllc)， 5. I (br‑ S， I H， ‑NH‑Boc)， 6.6(br‑s， 1 H， ‑NH‑CO‑feπoccne) 

N‑フエロセンカルポニルー工チレンジアミン 3.4の 合 成

100 ml二口反応容器に化合物3.3を800mg(2.15 x 1 O-~ mol)入れ、脱気笠素位換した 乾燥ジクロロメタ ンヌ

o

mlを加えて懸渇させ、TFA1.23g(5.0cq.)を加えた。三j品で 1n 刊行佼.j~iミした後、完全に ~HWí:していた のでさらにTFAを1.23g(2.0 cq.)加え室温で撹持した。室泊で24

n S : 1

日j反応した後、ニンヒドリン党色を路 かめ、反応溶液を減圧留去したー残

i 1 I

を100mlのジクロロメタ ンに溶解させて、 DIEAで

' 1 '

和した だ?奴 を留去し、得られた

m

^色の?HI状物質を 200mlのジクロロメタンにj存角午させて、飽手JI炭般ナトリウム本溶液 IOOmlで一回洗浄した 有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒をじ?去して黄色同体を得た 収量450mg(77 7c) 

FT‑IR (KBr): 1690 ^Clll，・(ウレタン C=Oの消失).1633 cm‑'(アミドC=O)

'H NMR(250 MHz、CDCI，TMS基準， .rt・):8/ ppm = 2.9(1，12.5 

H之、 2H‘ -C H， CH、NH~).

^{3.4( ，( 12.5 HL 2 H， ‑}

6 4  

CH:CH~NH~). 4.2(ωS5   H. H‑i巾nヒπOたt町C氾C叩ne吋)、4.3(

い

s.2H m  

‑，H‑CO‑fcπcx:ene) 

3，8，12，18‑テトラメチル・2，7‑ジビニルー13・工ト キシカルホ・ニル工チルー17 ‑

( N  ‑

フ 工 口 セ ン カ ル ポニル，工 チ ル ア ミ ノ カルバモイルエチル)ポルフィン 3.5の 合 成

100 ml二口反応容器にプロトポルフイリン IX‑モノエチルエステルを200m g (3.38 x 1 0 ‑1 III 01)、BOP料f1 斉JI299 mg(2.0 cq.)を入れ脱気窒素置換した ここに乾燥D MFを201111加え俗解した、さらに化介物3.t.1 R~

mg(2.0 cq.)の乾燥DMF溶液5mlを加え、 DIEA87 mg(2.0 eq.)を加えて守fillで12II.~: ^l[Jl悦

i l

した 以応、

t

冬l' 後、溶媒を減圧留去しポンプで乾燥した」残i宣を 200ml のクロ U ホルムに溶解させて、 ;Jぷ:1/ ノ水~I()α)(り)ハIl川1 一回

i

洗先浄したO 有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 j川県をも

a

J.~ した。 何られた!日色物れをシ リカゲルカラムクロマ トグラフフィー(展開溶媒 :クロロホルム→クロロホルム:メタノ』ル=斗0:1)で 精製したコ溶媒を留去し黒色粘性国体を得た。収量 150mg(52 7r) 

m.p. > 200 OC(分解)

FT‑IR (KBr); 1733 cm‑1(エステルC=O)，1633‑1640 cm'l(アミドC=O)

1H NMR(250 M Hz， DMSO‑q"  DMSO基準， r.t.) ; 8/ ppm = 1.0(1ll， 3 11， -CH~C}f l) ， ~L~(lll， 4 I‑I、13，17‑CILCfJ，‑). 

3.4‑3.6(m x 2， 2 H x 2， ‑NHCH:CH̲、NH‑)，3.6‑3.7(m，12H，3，8，12，18‑CH1)4.0(s，5 H、H‑in fcn‑occJlc). 4.1 (111、2Jl.

‑CH:CH ，)，4.2(s 2 H. m‑H‑in  ferroccne)， 4.4(m， 4 H， 13， 17‑CH:CH_2‑). 4.5(s， 2 H， o‑H‑in fcrroccIlc)、6.2‑6.5(dx :2.  15.0 Hz， 4 H， ‑CH=CH:)、7.5(br‑s，1 H，ーNH‑CO‑fc汀ocene)，8.0(br‑s，1 H， ‑N H‑CO‑porphyrin)， 8.5(111.2 H. ‑CH=CH、). 10.2(m， 4 H， meso‑H) 

MALDI‑Tol二Mass(dithranol， positive) ; 845.9 (M = 844.83) 

3，8，12，18‑テ卜ラメチルー2，7・ジビニルイ3・工トキシカルポ二ル エ チ ル イ 7‑(N ‑フエ ロセ ンカル ホニル・工 チ ル ア ミ ノ カ ル バ モ イ ル 工 チjレ)ポルフィンー亜鉛 錯体 3.6の合成

100 mlナスフラスコに化合物3.5を130mg( 1.53 x 10.‑1 mol)を入れ乾燥クロロホルムを301111、iitAZf!?メ タノールを 4ml }Jllえ j容解した。 ここに Zn(OAc)~^{337 mg( 1 0.0} cq.) を 10ml のìit~~wメタ ノールに j作月平したも のを加え、室ihAで7時間技作したu この反応、は定量的かつ直ちに反応する TLCで以料の消失をは認し溶 媒を臼去した内残波を 150mlのクロロホルムに溶解させて、ぷ仰木50Jll 1で三]I!]洗浄した 有機j円を分取

し、無水硫円安ナ トリ ウムで乾燥後、溶媒を旬去して黒褐色の"il]休を得た 収:1::130 mg(91 7r) 

m.p. > 200て(分 解)

MALDI‑Tof‑Mass (dithranol、positive): 907.8  (M = 908.20) 

UV(CHCJ;) :同大吸収波長(入Inm) = 413(Soret). 544581 (Q ‑Banc1) 

3，8，12，18‑テ ト ラ メ チ ル‑2，7‑ジ 七 二 ルー13‑ヒ ド ロ キ シ カ ル ポニル工チルー17 ‑(N ‑フエロセンカ ルポニルー工 チ ル ア ミ ノ カ ル バ モ イ ル 工 チ ル ) ポ ル フ ィ ンー亜鉛錯体 3.1aの 合 成

100 mlナスフラスコに化合可知3.6を90mg(9.90 x 10ヌ・mol)、を入れテトラヒドロフラン(TIIF)を30ll1 1、 メタノールを20m 1加え溶解した ここに0.1M水酸化ナトリウムぷ浴液9.81ll1(5.0叫・)を力1Iえ、主泌で7 時間撹件した さらに0.1t‑.l水酸化ナトリウム水溶液9.8ml(5.0 cq.)を加え、主jhliで合計 12時間桜排した

6 S  

FT‑IRにてエステルの消失を確認した後、反応溶液を 20mlまで波縞した 以応溶液に 1i¥1}以内支ノj(溶液を 加え中和し、遠心分離(7000rpm 4 CC)にかけた門上澄み溶液をデカンテーショシにより除去し、，t:̲じた沈

J

を200mlのジクロロメタンおよび201111のメタノールの似合浴奴に溶解させて、.J11!111，した イn定肘を Jg~

水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去したc 黒褐色の粘性同体を得た 収~，;-:50 mg(57 7r) 

m.p. > 2

∞

^CC(分解)

Ff‑IR(KBr); 11'33 CI11.I(エステルC=Oの消失)， 1707 cm‑I(カルボン

M :

^{C=O)， 1630 crn I(アミドC=O)}

IH NMR(250 MHz， DMSO‑qぃDMSO基準， r.t.) ; 8/ ppm = 3.1 (rn. 4 H 、 1:~，1 7-CH2CHl-)' 3.2‑3.3(111 X 2，2 H x 2.  -NHCHlCH~H-) ， 3.6‑3.7(m， 12 H， 3，8，12， 18‑CH1)， 4.1 (s， 5 H， H‑in fc灯occnc)4.2(s，211、Jll‑H‑in '1じ汀1 occnc)，4A(Ill.

4H，13，17‑CH]ヲCH2‑)，4.6(s， 2 H， o‑H‑in  ferroccne)， 6.2‑6.5(d x 2， 15.0 JIλ4 H，ーCH=CIJ:)、7.7(br‑s.1 H、ーNlf‑

c o

^・feπocenc)，8.1 (br‑s， 1 H， ‑NH二CO‑po叩hyrin)，8.6(111， 2 H， _‑CII=CH2)10.2(rn 4 Il、I11CSO‑め MALDI‑Tof‑Mass (dithranol、positive); 879.7  (M = 880.15) 

元素分析;計算値 C.17Hj.i(N^，(Oj.FeZn1.25H10 C， 62.53 ; H， 5.42 ; N，9.31.実j則他 C.62.53 ; H， 5.48 ; N、9.02CJc 

3・3‑2.フ ェ 口 セ ン 連 結 化 合 物 3.1bの 合 成

化合物3.1bの合成はアミノメチルフエロセン3.7を出発以料として、以ドのスキーム3‑2に従って合成 した。化合物3.7は文献記載の方法に従って合成した.jO)。これを川い、まずN‑Boc‑Gly‑OHとBOP桁l合邦

l

により結合反応し、 TFAにより Bcに基を脱保護した。得られた末端にアミノ基を有するユニ yト3.9を、 同様の結合反応によりプロトポルフイリンIX‑モノエチルエステルに連結しt.:._oZn(OAc)、により fll~J;} 鈷化 を行い、最後にエチルエステルを加水分解し、目的化合物を得た。

ζト ¥

宅三~ l~n2

3.7 

PP‑打lonoester BOP， DIEA 

dry‑DMF 

大

^{ゲO H人r‑‑‑r‑‑‑‑‑‑COOH}

BOP， DIEA 

dry‑DMF 

2N ^{イ シ ト ド}

_dry CH^TFA _2CI

2 

3.8 

OC2Hs 

Zn(OAc)2  CHCI3‑MeOH 

3.10 

宅三;?/

NaOHaq.  OH 

THF‑MeOH 

3.1b

る

スキーム 3‑2. フエロセン連結化合物3.1bの合成

N ‑Boc‑フエ ロ セ ニ ル メ チ ル ア ミ ノ‑クリシン 3.8の合 成

三デイ川

3.9 

OC2Hs 

3.11  宅~

1001111二口反応容器にアミノメチルフエロセン3.7を1.55g(7.20 x 10・'11101)、BOP結合斉IJ4.78 g( 1.5 cq.) 

66 

を入れ脱気窒去置換した ここに乾t燥長DMFを20ml加えj浴容角肝干した さらにモノ N‑Boωc

の乾燥 D~1F^溶容i夜

i

液5mlを加え、 DIEAl. 39 g( l. 5 eq. )を加えて主治で 12

. n

):f日付

' j i f l

したl Jえ1.[‑，終j'後、 iH仰を J戒圧留去しホンプで乾燥した 残 i査を 1501111 のクロロホルムに溶解させて、ぷぽノ~^{50 llllでf7LJ[IJ}l洗浄した 有様層を分取し、紫水硫酸ナトリウムで・乾燥後、溶媒を留去した 得られた;，{I色同体をシリカゲルカラム クロマトグラフフィー(展開溶媒 :一回目クロロホルム、二!日

l

臼何j:目安エチル)でイ，

f I

製した、iHWを日

L

し

; l t

色の粘性物質を得た 収量2.47 g(92 7c) 

Ff‑IR (KBr);  1700 cm'^J(ウレタン C二0)、1663cm'^J(アミドC=O)

'H NMR(250 MHz CDCIぃTMS基準 r.t.); 8 /ppm = 1.4(s， 9 H、t‑Bu)、3.8(d、2H， -NllCfl~CO-)‘ 4.ト斗.2(川、 J ¹¹¹  

‑CH，‑feπocene and H‑川feπoccne)，5.1 (br‑s， 1 H， ‑CH]NHCO‑)， 5.6(br‑s， 1 H ‑N H‑Bcに)

フェ口セニルメチルアミノーグリシン 3.9の 合 成

100 ml二口反応容器に化合物3.8を2.47g(6.63 x 10・.~ mol)入れ、脱気宅ぷ{川県した 乾燥ジクロロメタ ン40mlを加えて懸濁させ、 TFA7.56 g( 10.0 cq.)を加えた(室jjliで 1

n . f  

lflJ撹作した後、完全に溶解していた のでさらにTFAを3.70g(5.0 eq.)加え室温で撹持した。室渦で24rl.~;IIJJ 以応した後、ニンヒドリン発色を的;

かめ、反応溶液を減圧留去した。残

i t t

を100mlのクロロホルムに溶解させて飽和以内支ナトリウムノ

k

溶液 100 mlで分j夜操作を行ったc水層を分取し、 50ml のジクロロメタンでて[~J^1‑I1II，lll，した イパ定JI~11 を分Jfi し、

無水硫酸ナ トリウムで乾燥後、溶媒を留去して黄色固体を得た。この粗生成物をヘキサンで1，'，卜法洗浄し、

残泣を減圧乾燥した。収量1.80g(99 %) 

FT‑IR (KBr); 1700 cm"(ウレタンC=Oの消失)， 1652 cm"(アミドC=O)

'H NMR(250 MHz， CDCI~， ^{TMS基準，r・t.); 8/ ppm =卜5(br‑s，2 f，I}-CH~NF-!l)' ^{3.3(s， 2 H， ‑NI} ICJJ~COー).4.1-4.2(111 ・ 11 、日‑CF‑!了fcrroccneand H‑in fcrroccnc)， 7.5(br‑s， 1 H， -CH~NHCO-)

3，8，12，18‑テ ト ラ メ チ ル‑2，7‑ジビニルー13・工トキシカルポニル工チルー17 ‑(フエロセニルメチ ルアミノーグリシン‑N‑カルバモイル工チル)ポルフィン 3.10の 合 成

100 ml二口反応容待にプロ トポルフイ リン IX‑モノエチルエステルを200mg(3.38 x 1 O'~ ^IllO、り BOP純白 斉IJ299 I1lg(2.0 cq.)を入れjj見気笠素置換した ここに乾燥DMFを201111加え溶解したp さらに化合物3.9J 84  mg(2.0 cq.)の乾燥 DMFi容

i

夜5mlを加え、 DIEA87 mg(2.0 cq.)を力11えて主j品で1211日!J民

i

'l'した jメ}.い終 f {炎、溶媒をj威圧留去しポンプで乾燥した 残

i E

を200

ml のクロ ロホルムに j制作させて、 AEC7 ノ~

^100 llllで

ー:同洗浄した『 ィEf機!汚を分取し、弁l~ノk 硫般ナトリウムで乾燥後、 ìHb:tを fNLしたr 何られた，'.1.\色物穴をシ

リカゲルカラムクロマトグラフフィー(展開溶媒:クロロホルム→クロロホルム:メタノールニ40: 1)で 精製した 浴煤を留去し黒色粘性同体を得た 収量 150mg(52 7r) 

1l1.p. > 200 OC(分解)

FT‑IR (KBr): 1730 cm '(エステルCニ0)、1637CI1l.^I(アミドC=O)

'H NNIR(250 MHz. DMSO‑q"  DMSO基i后 「し): 8/ ppm = 1.0(m， 3 

H 、 -CH~ CF-!!)、 3 .3 ( m 、 4

^{H， 13，17‑CH}₂^{CF‑!̲:>‑)司}

ll‑(m. 2 H. ‑CONH CF‑!̲..CONH‑)， 3.5‑3.6(m.  12 H. 3，8，12， 18‑CH₁)， 3.8(d， 2H， ‑NH CH̲..‑fc付occne)、4.0(s，9H， H‑in  le町ocene).‑L 1 (m・2H. -CF-!_，CH~)、-l A( Ill. ^{‑lH 13.17・C H，C H̲ 了) 6.2‑6.4(dx 2司15.0Hム4日、 ‑CH=CH，).7.5(br‑s、l}

6 7  

H. ‑CONH‑feπoccne)、8.1(br‑s. 1 H. ‑NH‑CO‑porphyrin). 8.3(m、2H， ‑CH=CI I~) ‘ 1 O.O(m. + .H. l11eso‑H)  1ALDI‑Tof‑Mass (dithranol、positi¥'e): 8'+6.9 (M = 8斗6.8)

3，8，12，18‑テトラメチル骨2，7・ジビニルー13・工トキシカルポニルエチルイ7・(フエロセニルメチ ルアミノークリシンーN‑カルバモイル工チル)ポルフ ィンー亜鉛錯体 3.1 1の 合 成

100 mlナスフラスコに化合物3.10を250mg(2.96 x 10 1.‑ll1oJ)を人れ乾燥クロロホルムを 50ml、'ii.;I¥

W i

メタノールを 10ml加えj容解した門ここにZn(OAc)26.+9 mg(10.0叫)を 10Il1 Jの中.!.J~~ 問メタノ ールに dj. f~~f. し たものを加え、室温で 4 時間撹排したに この反応は定 ~ii⁽¹⁰かつ11¥ちに反応する TLCでlJ;('1^:1の消失をは lit

し溶媒を留去したっ 残 i査を 150ml のクロロホルムに浴解させて、 f夜間ノ~^50 m 1で‑:[111洗浄した イd走 JI~1 を 分取し、無水硫般ナ トリ ウムで乾燥後、溶媒を留去してよIUs色の[/d体を得た 収

: 1 : :

240 mg(89 7c) 

m.p. > 200 OC(分解)

FT‑fR (KBr); 1733 cm'^l(エステルC=O)，1635 cm'^l(アミドc=O) MALDf‑Tof‑Mass (dithranol， positive) ; 908.8 (M = 908.20) 

UV(CHCI._i) :極大吸収波長(入/nm) = 413(Soret)， 544、581(Q ‑Band) 

3，8，12，18‑テトラメチルー2，7‑ジビニルー13‑ヒ ド ロ キ シ カ ルポニル工チルー17 ‑(フ ェ口セ二ルメ チルアミノークリシン‑N‑カルバモイル工チル)ポルフィン白亜鉛錯体3.1bの合成

100 mlナスフラスコに化合物3.11を120m g ( 1 .32 x 1 0 .1‑m 0 1)、を入れTHFを30m1、メタノールを 20ml 加え溶解した。さらに 1 M水酸化ナトリウム水溶液 1.3 m 1 (5. 0 cq.)を加え、室jiltで7時間悦作した。さら に1 M水酸化ナトリウム水溶液 1.3ml(5.0 cq.)を加え、室協で合計 128，

H I n  

'ijt.J"j:した ，FT‑IRにてエステル の消失を確認した後、反応溶液を20mlまで、決縮した。反応溶液に 1 M出限ノ

k

溶液を加え1I1不11し、 j主心分 離(7000rpm， 4 OC)にかけた。上澄み溶液をデカンテーションにより除去し、生じた沈j肢を 1001111のジク u ロメタンおよび20mlのビリジンの混合溶媒に溶解させて抽出した 有機!??を

J ! ! υk

硫酸ナ トリ ウムで乾燥 後、溶媒を留去したJ 黒褐色の粘性固体を得たd 収量 110mg(倒 的、

m.p. > 200 OC(分解)

FT‑IR(KBr); 1733 cm'^l(エステルCニOの消失)、 1717CI1l.I(カルボン椴C=O)，1630 cm I(アミドC=O)

IH NMR(250 MHχ， DMSO‑q，. DMSO基準、r.t.);O / ppm = 3.1(m， 4 H、13，J7‑CII2CH_F)，3.3(m， 4 H， 13，17‑ CH2CH]‑)， 3.4(m， 2 H， ‑CONHCH]CONH‑)， 3.6‑3.7(m、12H， 3，8，12， 18‑C]‑];)， 4.0(s， 9 H， H‑in fcrroccnc)， 4.4(m， 4  H，I，]J7‑CH]CHγ)， 4.6(s， 2 H. o‑H‑in  fcrrocenc). 6.2‑6.5(d x 2， 15.0 Hλ 4 H.ーClI=CH₂⁾，7.7(br‑s， 1 H， CONlI‑ ferroccne)、8.J (br‑丸 1H. ‑N H‑CO‑po中hyrin).8.6(m， 2 H， ‑CH=CH₂₎， 10.2(m、4H， lllCSO・H)

MALDI‑Tof‑肘lass(dithranol、positive);880.6 (M =880.15)  元3去ミう分?布析r _{三十 7釘釘7~}11白立 C 

5 引1守(走

3・3‑3.Cyt‑bs62の大量 発 現

Cyt‑b'o2の発現は、組み替え遺伝子として Cyt‑b'O2発現ベクターを含む大j弘前(EcoJi.)を京大院工 ・長悦 先生から頂いた これをプロトコル、あるし汁まSligarらの報告をもとに行ヮた‑111.‑2，

また操作は福同県 J~

6 8  

業技術センターで行い、 赤尾 氏 、 末 永 氏 、 片 山 氏の指導のもとで、行った

コ ロ ニ ー の 発 現

プラスミドは細菌やカビが持つ、 染 色 体 と は 独 立 に 自 己 抜 裂 を 行 う 校 外j立伝

r

^{であり、多くは山村、}DN^

...:.あるつプ ラ ス ミ ド 上 に は 複 製 開 始 点 や 細 胞 内 の プ ラ ス ミ ド コ ピ

数を調節する部位の他、 抗生 物 質 耐 性(R[斗チ)などのキ!日間のI刊iに

ご : L i i N f J : I

直接必要としない

j E

伝子がコードされている(右図)ηプラスミド(i Amp 

大腸菌内や培養細胞に導入することが可能で(形質転換)、プラスミ ドベクターを含む菌体は培地中でグリセロールストック(ヌ

o

^7r)とし

/長期保存が可能である(‑80CC)。約 l年 間 保 存 し て い た グ リ 七 ロ ー ルストックから純 度の 高 い 菌 体 を 得 る た め、寒 天 培地 上でコロニー の発現を行った。

以 下 の 操 作 は 全 て ク リ ー ン ベ ン チ で 行 っ た。Luria‑Bc口3I1I

medium(LB培地)に Bacto‑agarを 加 え た も の を オ ー ト ク レ ー ブ 滅 的 (120て、 30分)して、得られた溶液をi戚菌シャーレに流し込み、刃ミ 天培地を作製した。次 い で 、 抗 生 物 質 で あ る ア ン ピ シ リ ン を 60mg/ 

mlの割合で、蒸留水 Imlに溶解し、 0.22μm(ミリポア梨)のフィルタ ーを通して減過滅菌した水溶液を、寒天プレー ト上にピペットマン

行 100μl滴 下 し た。シ ャ ー レ を 手 で 回 転 さ せ な が ら 、 ス プ レ ッ ダ ー (エタノール滅菌したもの)を用いて寒 天 上 に 塗 り 広げた。その後、

111 };: :~! Q;'j山

yt‑b_Sl>2の プ ラ ス ミ ドDN^

ーj¥，;Iだ け 火 わ る ように11111制 寸 る

コロニープレート

Cyt‑b562菌体を含むグリセロールストックから少量を白金耳(ノ〈ーナーで減問)ですくい取り、本天 [̲‑tこづ￨っ かきながら広げ ていった(ストリ ー キ ン グ、右上図)。シャーレをテープで完全にj:.)I:1[し、 29CCで ‑1ぬイン キュベートしたc 翌 朝 コ ロ ニ ー の 発 現 を 確 認 し た。

種 培 養(smallculture) 

大

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に 菌 体 を 増 殖 し た い 時 、 大 量 培 地 に 直 接 植 菌 し な い で l皮少;を府地でJ;}frしてから(スターター)大 量培地に加える。これは、直筏大量居地に

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菌ーすると菌密度が非常に低いので、十分な

: l f

の 的 体 が

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^刑す

る前に他の菌が増殖し、結局 培 養 後 の ほ 養 液rllの細菌がコンタ ミした細菌で，'i^められてしまう公れがある ためである。ある程度以上の細菌を増殖すればコンタミは1!¥f;視 で き る の で 、 少 佐 の ス ケールから始める 得られた単一コ ロ ニ ー を 用 い て 、 試 験 管 内 で 菌 体 の 増 殖 を 行 っ たp

以 下 の 操 作 も 他

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の 際 に は ク リ ー ン ベ ン チ で の 操 作 で あ る。 Bactro tryptonc(DIFCO製)45.0g、YcastExtract(DIFCO製)22.5g、 塩 化ナトリウム 45.0g、水酸化ナトリウム三粒を 4.51の 蒸 白 水 に 溶 解し、 pHを7.5とした このうち 20本の試験官・に 51111ず つ 水 浴 液

を流し込み、オー トクレーブ滅菌(120CC^、30分)後、 LB培 地 を 作 Small culLUre 

裂した《ここにアンピシリン(1 00 m g / m 1 [J_{溶液)を5μl}ピペ ッ ト マ ン で_JJJIえた 京 尺 プ レ ー ト か ら で き る だけ単一の コ ロ ニ ー を 選 別 し、つまようじ(/'Iーナーで滅菌)でコロニーを拾い集めて、ょうじの先端を府 地中でゆすいだ(図)‑この試験管にシリコン栓を付け、 37CCのインキユベーターに斜めに設託して(エア レ ション)、 6時間振とう培養した(12‑+_巾111) 菌 体 の 発 現 は 振 と う 時 間 に 付 し てS字型に増加し、振とう

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時間が開始から 4 時間位まではほとんど府地に変化はないが、 それ以佼 2、述に J~M した ^長時IIljの振とう は、不必要な泣伝子や蛋白貨の生成を

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l‑うので、反応U.inlJは必ず厳守した 6時間後、b't(1色 に 渇 っ た 溶 液を得た前

本培養 (Iarge culture) 

以 下 の 操 作 も 植 菌 の 際 に は ク リ ー ン ベ ン チ で の 操 作 で あ るに11も しくは21のノ〈ッフル(エアレーション効ギカ九奇まるように作られたう 角フラスコ)にLB府地を 3001111 / 1 1 パッフルとなるように合 ~n- 1‑+ 1  を入れ、オートクレーフー滅菌(120OC、30分)した。ここにアンピシリ

ン(100I11g / ml母溶液)をmμ1/3001111と な る よ う に ピ ペ バ マ ン で

C コ

それぞれに加えたG 先 程 のsmallculturcを1.5ml /300 1111となるよう に加え、アルミホイルのふたを被せて37OCのインキュベーターに設 置し、 一晩 振 と う 培 養 し た(124中111)。翌 朝 、 黄 白 色 に 濁 っ た 溶 液 を 選 別し、 Cyt‑b"1i2の 抽 出 に 用 い た。

蛋 白 質 の 抽 出

亡二〉

Largc culture 

本 培 養 で 得 ら れ た 菌 体 を 集 め 、 目 的 と す る 蛋 白 質 を 抽 出 す る 燥 作 を 行ったっ本I庁長にて科られた懸濁i(i の一部を 5001111の遠心管に入れ、 40C、 6000中mで8分 間 遠 心 分 離 を 行った('J主心分離は ーj立に6本のj主 心管を用いた。上 澄 み を デ カ ン テ ー シ ョ ン に よ り 除 去 し 、 残 り の j官濁 j夜を再び5001111加え述心分離すると い う 操 作 を 繰 り 返 し て 、 す べ て の 懸 濁 液 か ら 菌 体 を 回 収 し た。菌体の重量をmlJ定し、 40Cに冷却して同収 菌体 1gに対して3mlの 緩 衝 液(4OC、10m M  Tris / HCI、pH8.0)を 加 え 、 間 体 の 塊 が な く な る よ う に 入 念 にかき混ぜた。 次に、菌体~?9ih夜 1001111 に対して 1. 5gのクロロホルム(4CC)を激しくかき出ぜながら 11Xjド

し、遠心管に栓をして 4 0Cで 2 時間撹伴し、ペリプラズムから Cyt-b."i62 をノk ネ11 に抗lI H\ した心 溶液の色が.~IJ や か な 赤 に な る こ と を 確 認 し て 、 先 に 加 え た 緩 衝 液 の2倍 体

f f l

の 緩i

i 1

j

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友(4OC、10m M  TrisパlCI、pH8.0)  を加え、栓を外して悦伴し、残っているクロロホルムを蒸発させた。この抽出液を再び述心分間E(4CC、6000

中m、30分)にかけ、上澄みをデカンテーションによ り 回 収 し 、 再 び 仁

i

登みをjiI心 分 離(4OC、6000中m、30 分)した。デカンテーションにより上澄みとして、 Cyt‑b"1i2水 溶 液 を 待 たι これに 1M J.~I~般ぷ溶液を}JIJえ、

pH 4.55に調室きした六沈 澱と し て 生 じ て く る 白 色 物 質 を 遠 心 分 雌(4OC、6000巾m、60分)により除き、デカ /テーションして約600mlのCyt‑b51i2^粗i容i^{夜を得た。}

UVス ペ ク ト ル に よ る Cyt‑bS62の 発 現 の 確 認

大腸菌から発現したCyt‑b"1i2の 粗 精 製 溶 液 に つ い て

uv

ス ペ ク ト ル を 測 定 し たd測 定 サ ン プ ル は ほ 長 波 を 緩衝液(JOmM Tris / HCl、pH8.0)で3分の lに 希 釈 し た だ け で 、 正 確 な 波 皮 は 決 定 し て い な い臼結果を[:;.(1 3‑7に 示 す 包13‑7から Cyt‑b5日の存在は確認され、これはまたゲル電気泳動の分析によっても支

t F

^された

しかし純度の指僚となる Rz値(soret帯 の 吸 光 度 と280nmの吸光度の比)がl以 下 で あ り 側 め て 純 度 は 低 い これは抽出したものがCyt-b56~^{だけでなく、不要な} DNA、 ペプチドを多く含んでいるためである ^従って

次にCyt‑b_."in2の 精 製 を 行 う こ と に し た

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ドキュメント内 九州大学工学応化分子物質創造工学 (ページ 70-99)