く 4 Q

わ ら

2 L f t

との反応性の低下)を目的としたものに限られており、 レ七プターが ボ (11'[の機能、活性/不

i o .

性状態を直接制御しJ 3るとはrjえむい

こうした観点から、本章では蛋(ln衣 而 に 特 異 的 に 結 合 し 、 か つj市竹illIJ

f

却を行う

1 m  

[:1 

r l

^{除能のモジュ}

レータ

‑ J

としての人てレセプターを開発することにしたご 今同は、長 (In として;i~ [‑伝達を本 米 の 機 能 とするシトクロムーc(Cyt‑c)に忌日した Cyt-c に関しては完全にそのfI~ili がゆj 隊であり、 ー然にイバEする Cyt‑c‑蛋白質複合体の構造についても詳細に研究が行われていることから、 レ セ プ タ ー の 分 子 設 計 が 比i絞 的容易であると考えたからである ふこで、Cyt‑c‑蛋 白 氏 後 合 体 に 関 す る 祁;tf例をJlm次険証しながら、 Cyt‑c 表 面 へ の レ セ プ タ ー の 分 子 設 計 を 進 め て い く こ と に し た。

2^・2.分 子 設 計

Cyt‑cの 生 体 内 認 識 シ ス テ ム

生体内の蛋白 Tf- 蛋白 12 複合体問においては、蛋白 22 表面の認識は極めて厳 ~ffi であると言える 天 然 系 で の蛋白

1 2 ‑

蛋白質複合体の中で、特にCyt‑cに つ い て 考 え れ ば 、 最 も 典 型 的 な 伎 合 体 の 例 と い う の が 、 呼 吸 鎖に見られる Cyt‑c‑Cyt‑cオキシダーゼ、 Cyt‑c‑Cyt‑bc，複合体である。刈[2‑)に は ミ ト コ ン ド リ ア 内 肢 に お ける呼吸代謝系の構成を示すコ

Complex 1 Complex  11

Fo  QH 

ー‑

乙

分子を水.こ還元する このi

l 2 F

伝達の段階で Cyt‑cが形成するlE[:11'[ t主介休の1!~大の依能が発現される これらの校合体は各々の般化還元屯(立に応じたー定の!IIrlJぶで;五 jへの''1:t t ìl.Ît しを ir う 。 I!i~:'HI(Jに 1!7.成 した水 去イオンはF，F，‑ATP合成酵ヨミーによる ATP合成に利

m

^{されるという}

f i : t i l

みである

エの他にも天然系には、 Cyt -cーCyt-b，~2) 、 Cyt -c-フ。ラストシアニン、 Cyt -c-アズリン~^¥1、C)t心ブラボドキ シン以などの複合体を見ることが出来るが、その佐合体形成機惜と屯{・移動反応が良く研究されているの が、図 2-6 に示す Cyt-c-Cyt-cペルオキシダーゼ (CCP)校合体である、CCP は II~Ü:~を般化完IJ として辺正月!Cytー を酸化する醇素であるが、 Cyt‑c‑CCP複合体の構造の解明には、徐々なアプUーチがこれまで、行われてい る 初期的な研究でKangらは、CCPは二つの異なるドメインでCyt‑cとjilli介していると従案し4へその役、

この説は Hoffman あるいは Durham 、 Millett らの光誘起~G:

r

^{移動を利)lJした尖験や、 Ennanらのペルオキシ}

ダーゼ活性に関する検討から、初めの Cyt -cには非~;~.に山川、アフィニティ ーで結合するが、

: 詐

!Iの仁yt^・ c には低いアフィニティーで結合するという負のアロシティーにより文 rf されてきた ~Ó州 また怯令休の 構造解明にはポイントミューテーションを用いた手法も取られており、 CorinとMcLc1lcb1らはl CCPの / ニオン性残基Asp37、79、217をLysに置換した変異体を作成した州 これらの変児休による倹1;.[から、

Asp 37が天然の複合体には必須なアミノ酸であることを主張した3 その他のf‑

i L

として、 Saltcrlcc、Poulos らは天然の CCP と Cyt-c を化学的にクロスリンクし、 NMR によ る構造解析や í~

r

^{移動反応の検}

^{; I}

^.j"を行っ

た川'¥'1 以上のようなアプローチは蛋白貨の構造と機能(?lij性)の

f u r

珂を矢11る1‑，で、

J I :

常にむ:よーのあるもliれ を数多く与えた門

一方で、完全に構造生物学の立場から Cyt‑c‑CCP複合体の構造が解明されたのは 1992年になってからで あり町、 KraulらのX線結晶情造解析の結果から、 Lysから併成される Cyt‑cヘムポケットJI司辺のカチオン 性残基と AspあるいはGluからなる CCPのアニオン性残基との相互作別が、iIミも近筏した部位においてい 3‑‑+ Aという距離で存在していることが明らかになった。

。

， .  Fel^V， 

ーiT巾191

. ・

Cyt‑c ('IQ  Cyt‑c ('Q 

ES complex 

図2‑6. Cyl‑c‑CCP複合体のX線結品構造解析図(左

1

[[1J:三主体としてぷした)および反応機情(イii!!lJ)

この禄なCyl‑c‑CCP複合体表面のアニオン性残基とカチオン性残基との十IlF工作

m

^{は、 L記のH子l以}J1にお}

けるComplex

m

^、Wにおいても示されており、生体内ではかなりの特民性をも って認設が行われているこ とを知ることが出来る

ア ニ オ ン 性 ク ラ ス タ ー の 設 計

生体内認詰システムを参考にしてCyl‑cレセフターの開発を行うためには、ド12・7のCyl‑cの

x * ! l *

^品

t d 4 1

造解析図から判断して、 表 面 のLys13^，25、'27^，72^，86^，87といったカチオン

' l t J J U l

よから情成される特徴的な 広範囲のドメインを、静電的な相互作 用 を 利 用 し て 認 識 す る 方 法 が 最 良 で あ ると

J 5 ‑

えられる、そのために は、レセプター表面にCyt‑c認 識 部 位 と し て の ア ニ オ ン 性

Lys 86 

図2‑7. Cyt‑cの三次 構 造(LysiWゆ

1

のみ表示した)

これまでの報告例から、人 工 的 に ア ニ オ ン 性 ク ラ ス タ ー を 構 築 す る た め の 法 本 的 下 法 と し て は 、 防

1 1

分 十集合体や二次元平面、金などの基盤を利用する方法が挙げ られる。実際に幾つかの例においては、仁yl‑ cをその燥な平面上に固定化す る こ と に 成 功 し て い る。例え ばI‑Iamachiらは、アニオン性1)ン酸!J

日 1 T:

^分

子膜に異方性を持って Cyt-c を結合させ、それによって引き起こされる mi*mなI~;J次情造の収!日j が Cyt-c に N­

デメチラーゼ、活性の増幅をもたらすことを見出した刊。Bowdcn、Nikiらは

1 5

何j‑̲にアルカンチオールを集 積した自己集合単分子膜(SAMs)を月]しEることで、電 極 表 面 に カ ル ボ キ シ レー トクラスターを形成し Cyt‑c

を吸着させた'\~.'i510

Taniguchi

らは金定値上に SA

Ms としてピリジンを吸おさせ、円変化 }~~l Cyt

-c と辺元 '~~l

^Cyt‑c 

の吸着挙動を調べた州:Mcし~lldon

はアニオン性の S

n0

2 ^{上に ïfIij;}}

^{Cyl‑cをj?il}定化することで、光;正j況を取 り出すことに成功している刊ここうした例はいずれも、 Cyl‑c表面での結合前日立をlリj昨 に し て い る と は

f

えないが、アニオン性クラスタ ーを応用してCyl‑C表 而 を 多 点 的 に 認 識 し た 例として参考にすべき点

し1内

しかしながら多点認識部位を単一の レ セ プ タ ー 骨 格 に 導 入 す る こ と は 、 従 米 の ホ ス ト ゲ ス ト の 手 法 か ら は依然、困難であると言える:Hamillonら は こ う し た 問 題 に 対 し て 、 カ リ ッ ク ス ア レーン骨格を ScafToldと した分子設計を行うことで、クラスターの 構 築 に 成 功 し た。そこで今山政々は、機能性人工レセプターの 開 発 に 以 下 の 様 な 観 点 か ら の 分 子 設 計 を 行 う こ と に し た。

(J)クラスターを導入する Scaffoldとして、光増感斉iJとしての機能を有するルテニウムトリスビピ， )ジル知 体を利用する《

(2)アニオン性クラスターとしてNewkomeらが開発した校分かれ1:火のユニッ ト(デンドリマー)を利f!lする

(3)ルテニウム錯体の配位様式を利用したカルボキシル基クラスターのライブラリ ーを湖裂し、そのljlか ら、特定蛋向質表面にのみ高い親和性を示すものをコンビナトリアルに倹宗する助川

(4)ルテニウム錯体への光照射により、一定方向への光誘起電子移動反応に必づく長I'J

1

¹

1

の川竹状態の制 御を行う

以上の条件に対して、具体的には図2‑8に示す三つのタイフ。の配位段式のレセプターを合成することに

したし

o f

し

p

o p ¥ '

∞ 刷

/ /

︑

c

pH O

防

2.1 a; R1 

= 

branched carboxylate， R₂ 

= 

R3 

= 

H  2.1 b; R₁ 

= 

R₂ 

= 

branched carboxylate， R3 

= 

H  2.1 c; R₁ 

= 

R₂ 

= 

R3 

= 

branched carboxylate 

~ . ~

2.1a 

2.1 b  2.1c 

図2‑8. ルテニウムトリスビピリジル鈷体を基体としたレセプタ‑2.1a・cの

f I I t ;

^{立、配位校式(、}:f;rUI[:AI) 

以下には、これらのレセプターが示す特定蛋白質への結合特性と、光誘起託子移動によるilf1I 

t ! l

の?，ij性 状態のi1JJi御について報告するョ

2^・3.実験

以下の合成には特に表記がない限り市販品特級試柴を精製せずにそのまま

m

しEた ;l吃燥溶媒は

r l i

版の ^a 級試薬を脱水、蒸留して用いたっ

2・3・I.レセプター2.I bの合成

レセプター2.1bの合成は2.2'‑ビピリジル‑4，4'‑ジカルボン酸(2.2)を出発原料として、以下のスキームユ! こ促って合成した まずエチルエステルによって末端が保護された枝分かれユニットを文献のノf法刊に従 つで合成したこれを縮合剤(ベンゾトリアゾールートイルオキシ，トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキ

30 

これを J話化リチウムのイ{{Cド、

、 ず2.2と結合させ配位二f2.3を似た 什フルオロホスフェー ト(BOP))を用

ルrjlで2ユ二ビピリ ジルと加熱還流して非対称なト 1) ス型錯体とし、 ルテニウムー~lIlljの対アニオンを PFt>へと交換してね裂し

この方法により、異なる配位

f

を有するルテニウム トリスビピ1)ジル錯イ本の合成が

n f

能となる さらに2.4をエタノ

1レテニウム三塩化物と反応させルテニウムビス錯体2.4とした

n J  

V41 ふn

' Vい

ー と 日

∞ 日

こ仇

¥ 0

ね

c /

︒ 斤 ぺ

c

恥OHP

f 

h

u r l H [  

航

炉

y 斗

叫

カ

ア tレ

︒

J r

保の

基 末 山 而

︑ ン ー レ

キボ

Y ν

カ  

J f之後 た

ドキュメント内 九州大学工学応化分子物質創造工学 (ページ 33-37)