博 士 （ 歯 学 ） 鈴 木 宣 充 学位論文題名
Mechanical stress directly suppresses osteoclast differentiation in RAW264 ． 7cells
（メカニカルストレスは直接的にRAW264.7 細胞の 破骨細胞分化を抑制する）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
【緒言】
骨量 の 維持 ある いは 増進のた めには適度な運動が必要であ るという報告があるが、力 学的負荷（メカニカル ストレス）による 骨組織への直接的な影響に ついては未だ明らかではない 。特に、破骨細胞との関連において は、 骨 芽細 胞や 歯根 膜 細胞 との 共培 養下 で メカ ニカ ルス トレ ス を作 用した場合に、 破骨細胞への分化誘導 能 を 低 下 さ せ る 報告 はあ る が、in vitr。で のRANKL刺激 下に おけ る 単球 系細 胞を 用 いた 破骨 細胞 分化 誘 導系 に おい て、 メカ ニ カル スト レス を直 接 作用 させ た報 告は な い。 今回、我々はマ ウス由来の破骨細胞前 駆 細 胞 で あ るRAW264．7細胞 を用 いて 、RANKL刺 激に よる 破骨 細胞 分 化誘 導系 にお い て、 直接 的に メカ ニ カルストレスを与 えた場合の影響について検 索した。
【材料と方法】
各 種 濃 度 のRANKLを 添 加 し 、RAW264．7細 胞を48穴 プ レー トに て培 養を 行 った 。培 養6日後 、10％中 性 ホル マ リン で細 胞を 固 定し 、TRAP染 色後 、TRAP陽性 多核 （2核以 上） の 細胞 を破 骨細 胞と し 、その細胞数 を 求 め た 。 ま たRANKL濃 度 を100ng/mIと し 、 培 養7日 間 の 破 骨 細 胞 数の 経時 的変 化 を測 定し た。 さら に 象 牙 質 切 片 上 で 培 養 を 行 い 、 形 成 さ れ た 吸 収 窩 を 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に て 観 察 し た 。 次 に 、RAW細 胞 をRANKL（100ng/m｜ ） 処 理 の 下 、 培 養5−6日 の48時 間FIexerce‖TensionSystemに 従いメカニカルス トレスを与えた。メカニカルストレスを与えないものをコントロ―ルとした。培養液の交換は 2日 毎 に 行 い 、 同 時 に 同 濃 度 のRANKLを 添 加 し た 。 培 養6日 に 細 胞 を 固 定 しTRAP染 色 後 、TRAP陽 性 多核 細 胞数 を測 定し た 。さ らに 同細 胞中 の 核数 を測 定し 、破 骨 細胞 数と核数との関 係について検索した。
ま た 、 培 養3―4日 およ び 培養5―6日の48時 間 、培 養3―6日 の96時 間、 それ ぞれ 連 続的 にメ カニ カル ス トレ ス を与 えて 培養 を行い、 破骨細胞数の経時的変化につ いて検討した。さらにコン トロール群と培養5―6 日 に メ カ ニ カ ル ス ト レ ス を 与 え た 群 で 、培 養6日にRNAを回 収し 、RT―PCR法 にて 各 種遺 伝子 の発 現状 況 との関連性につい て検索した。
【結果】
・RANKLと破骨細 胞分化との関係
破 骨 細 胞 数 は50ng/mIのRANKL濃 度 で 急 激 に 増 加 し 、RANKLの 濃 度依 存的 に 増加 した 。7日間 の培 養に お いては、4日以降 、破骨細胞数は時間依存的に 増加し、6日にピークに達し た後減少した。RANKLにより 分化し
た 細 胞 は 、象 牙 質 切 片上 に 多 く の吸 収 窩 を 形成 し 、 培養 した細 胞が硬 組織吸 収能を 有する破 骨細胞 である ことが証明された。
・メカニカルストレスによる破骨細胞分化の抑制
メ カニカ ルスト レスを 与える ことに より、コ ントロ ―ル群 に比べ て破骨細胞数はおよそ半分以下に減少した。
核 数 を比 較する とコン トロ― ル群で40核以上 を有する 細胞が 存在す るのに 対して 、メカ ニカル ストレ ス群で は 細 胞 数 と相 関 し 、 明ら か な 核 数の 減 少 が 認め ら れ た 。ま た 核 数 と同 様 に 、8核以 上を有す る巨大 破骨細 胞数が減少し、細胞サイズの縮小が認められた。
・メカニカルストレスを与えた場合の破骨細胞分化における経時的変化
培 養3ー4日にメカ ニカル ストレ スを与 えた群 （MS3−4群 ）では 、培養6日まで は常に コントロール群に比べ て 破 骨 細 胞数 は 半 分 以下 で あ っ たが 、 コ ン トロ ― ル 群 は7日で 破 骨 細 胞数 が 滅 少す るのに対 して、 逆に急 激 な 増 加 を示 し た 。 またMS5ー6群 お よ びMS3―6群 に お いて も 、MS3ー4群 と同 様 の 傾 向が 見 ら れ た。48時 間 メ カ ニ カル ス ト レ スを 与 え たMS3―4群とMS5―6群 と比 較し、96時間メ カニカ ルスト レスを 与えたMS3−6 群は、培養期間を通して破骨細胞数は明らかに減少していた。
・破骨細胞分化に関連する遺伝子の発現
メ カ ニ カ ル ス ト レ ス 群 で は 、 破 骨 細 胞 数 の 減 少 に 伴 い 破 骨 細 胞 特 異 的 遺 伝 子 で あ るTRAP、matrix metalloproteinase−9（MMP−9）、cathepsin−K(Cath−K）、calcitonin receptor（CTR)のmRNAの発現が減少する ー 方、破 骨細胞 分化抑 制に関 係するinducible nitric oxide synthase（iNOS）の発現は増加した。しかし、破 骨 細 胞 分 化誘 導 に お いて 必 須 転 写因 子 で あ るnuclear factor of activatedTcell cytoplasmicl(NFATcl） を 含 むNFATフ ァ ミリ ― （NFATc2、NFATc3)において は、メ カニカ ルスト レス群 で、破 骨細胞 数が減 少してい る に もか かわら ず、そ の発現 は増加し た。RANK、c‑ fmsおよ びINF‑ロ ではメ カニカ ルストレ スによ る明ら か な影響は認められなかった。
【考察】
今 回の実 験では 、RANKLを 添加したRAW細胞 を用い た破骨細 胞分化 誘導系 におい てメカ ニカル ストレ スを与 えることにより、破骨細胞分化が抑制されることが示された。さらに、メカニカルス卜レスを与えることで、形成さ れ る破骨 細胞の 核数の 減少お よび巨 大破骨細 胞数の 減少が 認めら れたことより、破骨細胞成熟過程において、
RAW細 胞 か ら破 骨 細 胞 への 分 化 だけで なく、 単核破骨 細胞か ら多核 破骨細 胞への 融合も 抑制し ている ことが 示唆された。
経 時的変 化にお いては、メカニカルストレスを与えた時期および期間により、破骨細胞分化の抑制効果が異な っ ていた 。特に48時間メ カニカ ルスト レスを 与えた 群より、96時間与えた群で破骨細胞分化の抑制効果が大き いことが示された。しかし、いずれのメカニカルストレス群においても、刺激を解除した後も培養を継続すると、破 骨 細胞数 がコン トロール群のピーク時の破骨細胞数まで回復することから、メカニカルストレスが破骨細胞分化 を完全に抑制するというより、むしろ遅延させている可能性が示唆された。
破 骨 細胞 分 化 関 連遺 伝 子 の 発現 状 況 を 検索 し た と ころ、 破骨細 胞分化 時に発 現する 特異的 遺伝子 である TRAP、MMP−9、Cath−K、CTRのmRNAの 発現 が 減 少 し、 破 骨 細 胞分 化 を 抑 制す る と さ れるiNOSの 発 現 は 増 加していたことから、メカニカルストレスによる破骨細胞数の減少と相関性を示した。しかし、破骨細胞分化に必 須 と され るNFATclは 、メカニ カルス トレス 群で増 加し、 またNFATclの発現を 誘導す るNFATc2の 発現も メカニ カ ルスト レス群 で増加していた。さらに、NFATclの上流に位置するNF‑だBからのシグナルによるネガティブフイ
― ドバッ ク作用 および、iNOSの誘導発現により、破骨細胞分化抑制に働くとされるINF‑ロにおいては、メカニカ
ルストレ スの影響が認められなかっ たことから、メカニカルストレスはNFATフんミリ―を含むNFATclより下流の シ グ ナ ル 伝 達 を 制 御 す る こ と で 、 破 骨 細 胞 分 化 を 抑 制 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 以 上の こと よ り、 破骨 細胞分 化誘導系において細胞への 直接的なメカニカルストレス の影響は、破骨細胞分 化 を完 全に 阻 害す るの ではな く、NFATcl下流のシグナル 伝達を抑制することで、破骨 細胞分化を抑制および 遅 延さ せ、 さ らに 破骨 細胞分 化後の成熟過程において破 骨細胞同士の融合も抑制する 可能性が示唆された。
