博 士 （ 農 学 ） 尾 花 由 美 子
学 位 論 文 題 名 1 1
植 物 ADP― glucose pyrophosphorylaseの 構 造 お よ び
活性調節機構に関する研究 学位論文内容の要旨
ADP‑glucose pyrophosphorylase (AくlPase，EC 2.7.7.27)は，ATPとグルコース1‐リン酸 (Glc l‑P)からデ ンプン 生合成に おける 唯一の基 質，ADP‑グ ルコース(ADPG)を生成する 反 応 を触 媒 し ，デ ンプン生 合成量 を左右す る鍵酵素 のーつ である． ほばす べての植 物 AGPaseは ，3‐ ホスホ グリセリ ン酸(3‑PGA)によ る活性化 および正 リン酸(Pi)による 阻 害 を 介し た ア ロス テリック 調節を 受けるが ，その分 子機構 の詳細は 不明で ある．植 物 AGPaseは 異なる遺 伝子に コードさ れた大 小サプユ ニットか ら構成 されるへ テロ4量体で ある．両サブユニットの役割は異なり，主として小サブユニットが触媒活性を，大サブユ ニットがアロステリック特性を担っているが，両サプユニットの一次構造の類似性溶高く，
共通の祖先遺伝子から進化したと考えられている．一般的に，植物における大サブユニツ ト遺伝子は，小サプユニット遺伝子に比べて多様であり，器官特異的な発現パターンを示 す． このこ とは，器 官によ って異な るアロ ステリック調節特性を有するAGPaseが存在す ることを示すが，その生理的な意義は明らかではない．本研究では，大サブユニットに焦 点を 当て， ＠アロス テリッ ク特性変 異酵素 の作製と植物での発現，＠アロステリック特 性変 異酵素 における 活性調 節機構の 解析， ◎ATP結 合機能の 解析に より，アロステリッ ク調 節機構 を明らか にする ことを目 的とし た．また，＠ヘテロ大サブユニット酵素の解 析により，酵素の4量体構造の多様性について検討した．
＠アロステリック特性変異酵素の作製と植物での発現
ジ ャ ガ イ モ 塊 茎AGPase大 サ ブ ユ ニ ッ ト(PLS)で 単 離 さ れ たUpl (E38K)お よ ぴ Up2 (GlOIN)変異tよ，3‑PGAの活 性化を 受けやす く，Pi阻 害に高い 抵抗性をもつ「活性 調節上昇型(up‑regulated)」アロステリック特性を示す．本研究では，さらなる活性調節上 昇 型 酵 素 を 得 る た め ， シ ロ イ ヌ ナ ズ ナAGPase大 サ ブ ユ ニ ッ トApLIにUplお よ び Up2変 異 に 相 当す る 変 異を 同 時 に導 入(Up3変異 ；A33K and G96N)し， シロイヌ ナズナ 野 生 型小 サ プ ユ ニッ ト(ApSl)と 組 み 合わせ た変異 シロイヌ ナズナAGPase (AA‑Up3)を 作 製 した ．AA‑Up3のア ロ ス テリ ッ ク 特性 は ， 両変 異 の 単純 な 相 加的産 物ではな く，
AA‑Up3は野生型酵素では阻害物質であるPi（低濃度）により活性化された．この特性は，
植 物 内で 高 いAGPase活 性 維 持に 貢 献 する と 考 えら れ ， 実際 ， シ ロイヌ ナズナApLl欠 損株 ヘUp3 Apll遺伝 子を導 入した形 質転換 体は，野生型植物より高い同化デンプン蓄積 量およぴ同化デンプン代謝回転率を示し，植物生長等を支える炭素供給能の向上が示唆さ れた．
＠アロス テリッ ク変異酵素の活性調節機構の解析
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大 サ ブ ユ ニ ッ ト へ のUp3変 異 導 入 に よ るPi活 性 化 機 構 を 解 析 す る た め ，Up3変 異 を 導 入 し た ， ジ ャ ガ イ モ 塊 茎AGPase (PP‑Up3)，ApSlお よ ぴPLSか ら 構 成 さ れ るhybrid AGPase (AP‑Up3)を 作 製 し ，AA‑Up3と 共 に ア ロ ス テ リ ッ ク 特 性 を 調 べ た ．AP‑Up3酵 素 は ，Pi濃 度 依 存 性 の 活 性 上 昇 を 示 し た が ，PP‑Up3酵 素 はPi濃 度 に 関 係 な く 一 定 の 活 性 を 示 し た ． い ず れ のUp3酵 素 も3‑PGA非 存 在 下 で の 高 い 酵 素 活 性 を 示 し ，Up3変 異 は 酵 素 を 活 性 型 に 近 い 構 造 に 変 化 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た ． ま た ，Piに よ る 活 性 化 に は 3‑PGAが 必 要 な こ と か ら ，Up3酵 素 に お い てPiは3‑PGAと の 親 和 性 を 増 加 さ せ て 活 性 を 上 昇 （ 活 性 化 ） さ せ る と 考 え ら れ た ．さ ら に， 結晶 構造 が解 析 され てい るジ ャガ イ モ塊 茎 小 サ プ ユ ニ ッ ト を 鋳 型 と し た 大 サ プ ユニ ッ トの 立体 構造 モデ ル から ，両 変異 の構 造 位置 お よ ぴ 構 造 変 化 を 予 測 し た ．Upl変 異 は 自 身 が 存 在 す る ル ー プ 構 造は 変え ず， 近傍 に 存在 し ， 小 サ ブ ユ ニ ッ ト と の 相 互 作 用 に 関 係 す る ル ー プ ． ヘ リ ッ クス 構造 を ，ま た，Up2変異 はPi結 合 部 位 の 後 方 の ル ー プ 構 造 を 改 変 す る と 予 想 さ れ た ． こ れ ら の こ と か ら ，Up3酵 素 のPi活 性 化 は(1) Up2変 異 に よ るPi親 和 性 の 低 下 と 阻 害 へ の 抵 抗 性 お よ ぴ(2) Upl 変 異 に よ る 大 小 サ ブ ユ ニ ッ ト 間 の 相 互 作 用 変 化 を 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 の 改 変 に よ り 生 じ て い る と 考 え ら れ た ．
◎ATP結 合 機 能 の 解 析
触 媒 活 性 を も た な い 大 サ ブ ユ ニ ッ ト もATP結 合 能 を 保 持 し て い る こ と が 知 ら れ て い る ．Upl変 異 が 位 置 す る 領 域 はATP結 合 部 位 に 相 当 す る こ と か ら ， 大 サ ブ ユ ニ ッ ト の ATP結 合 は ア ロ ス テ リ ッ ク 調 節 に 寄 与 し て い る と 考 え ら れ た ． 立 体 構 造 モ デ ル よ りATP 結 合 残 基 を 予 測 し ，2種 の 部 位 特 異 的 変 異(Q127AとK41A)をPLSに 導 入 し ， 野 生 型 小 サ プ ユニ ット と 組み 合わ せた 変 異酵 素を 作製 した ．8‑azido‑AI￣Pに よる フォ ト アフ イニ テ イ ラ ベ ル 実 験 か ら ， 変 異 導 入 は 大 サ ブ ユ ニ ッ ト のATP結 合 能 を 野 生 型 大 サ ブ ユ ニ ッ ト の80％ に 低 下 さ せ る が ， 小 サ プ ユ ニ ッ ト のATP結 合 能 に は 影 響 し な い こ と を 明 ら か に し た ． 一 方 ， 反 応 速 度 論 的 解 析 か ら ， 変 異 導 入 は 酵 素 のATP親和 性を 野生 型酵 素 の約50％ に 減 少 さ せ ，3‑PGA親 和 性 お よ ぴPi阻 害 へ の 抵 抗 性 も 低 下 さ せ る こ と を 示 し ， 大 サ ブ ユ ニ ッ ト へ のATP親 和 性 の 減 少 が 大 サ ブ ユ ニ ッ ト の 調 節 能 カ を 低 下 さ せ る こ と を 明 ら か に し た ． 立体 構造 上 ，AI、P結合 部位 はア ロス テ リッ ク因 子結 合 部位 とは 離れ ，大 小 サブ ユニ ッ ト の 相 互 作 用 に 関 与 す る 構 造 に 隣 接 す る ． し た が っ て ，AGPaseの ア ロ ス テ リ ッ ク 活性 化 は ， 大 サ ブ ユ ニ ッ ト へ の3‑PGAの 結 合 ，ATPの 結 合 に よ る 構 造 変 化 が 小 サ ブ ユ ニ ッ ト へ と 伝 達 し ， 酵 素 を 活 性 型 へ と 移 行 さ せ る こ と に よ り 起 こ る こ と が 示 唆 さ れ た ．
＠ヘテロ大サブユニッ ト酵素の解析
多 く の 植 物 貯 蔵 器 官 で は 複 数 の 大 サ ブ ユニ ット が 同時 に発 現し てお り ，シ ロイ ヌナ ズナ 長 角 果 に も2種 の 大 サ ブ ユ ニ ッ ト(ApLl and ApL3)が 同 時 に 存 在 す る ． 大 腸 菌 内 で ， 小 サ ブ ユ ニ ッ ト(ApSl)とApLlお よ ぴApl´3を 共 発 現 さ せ 長 角 果 のAGPaseサ プ ユ ニ ッ ト 発 現 を モ デ ル 化 し た ． 菌 体 抽 出 液 を ニ ッ ケ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ イ ー に 供 し ，ApL3に 付 加 し たHis‑tagを 用 い て 分 離 分 画 を 行 っ た ． イ ミ ダ ゾ ー ル 濃 度 の低 い 画分 に溶 出さ れた 酵 素 はApSl:ApLl：ApL3＝2：lニ1で 構 成 され るへ テ ロ大 サブ ユニ ットA（ 押恥e（ 弛pp，）
（S1凡1／L3・」蛤P鵠c）であることが明らかとなった．Sl几1／L3−AGPaseの比活性，熱安定性，
基 質 親 和 性 お よ ぴ ア ロ ス テ リ ッ ク 特 性 は ， ホ モ 大 サ ブ ユ ニ ッ トAG・P謎c（Sl几1‐お よぴ S1／L3‐AGPase）と 同等 の酵 素 機能を示した．したがって ，異なる大サプユニツ・トが 同時に 存 在 す れ ぱ ， ホ モ 大 サ ブ ユ ニ ッ トA（ 強aseだ け で な く ， ヘ テ ロ 大 サ プ ユ ニ ッ トAGPascが 構 造 的 に 安 定 し た 酵 素 と し て 植 物 体 内 で 十分 存在 可 能で ある こと が示 唆 され ，多 様な サブ ユ ニ ッ ト 構 成 のAGPaseが 貯 蔵 デ ン プ ン 合 成 に 寄 与 す る 可 能 性 を 示 し た ．
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
植物ADP −glucose pyrophosphorylase の構造およ，び 活性調節機構に関する研究
本 論 文 は 、図41、表11、引 用 文 献191を含 み 、6章 か ら な る総 ぺ ー ジ138の和 文 論 文である。別に参考論文2編が添えられている。
植物が合成するデンプンは人類に欠くことのできないエネルギー源であるが、その生合 成経路の詳細は明らかになっていない。ADP‑glucose pyrophosphorylase (AGPase; EC 2.7.7.27) はデンプン生合成の基質を供給する鍵酵素であり、その酵素活性はデンプン生合成量を左 右する。 本研究は 、生体 内でAGPase活 性を制御するアロステリック調節機構を明らかに す る と と も に 、AGPaseの 酵 素 構 造 の 多 様 性 を 理 解 す る 目 的 で 行 わ れ た 。 AGPaseは、ATPとグル コース1．リ ン酸(Glc l‑P)からデ ンプン生 合成における唯一の 基質 、ADP‑グル コース(ADPG)を生成す る反応 を触媒す る酵素 である。 植物AGPaseは 、 3‐ホ スホグリ セリン 酸(3‑PGA)に よる活 性化および正リン酸(Pi)による阻害を介したア ロステリック調節を受けるが、その分子機構の詳細は不明である。AGPaseのアロステリッ ク特性は、デンプン生合成量を左右することから、この詳細を理解することは植物生産性 を向上さ せるため に極め て重要で ある。 植物AGPaseは異なる遺伝子にコードされた大小 サブユニ ットから 構成されるヘテロ4量体であり、両サブユニットの役割は異なり、主と して小サブユニットが触媒活性を、大サブユニットがアロステリック特性を担うと考えら れている。植物における大サブユニット遺伝子は小サブュニット遺伝子に比べて多様であ り、器官特異的な発現パターンを示す。このことは、器官によって異なるアロステリック 特性を有 するAGPaseが 存在する ことを 示すが、その生理的な意義は明らかではなぃ。し たがって 、どのよ うな酵 素特性を もつAGPaseが各器官で機能するかを明らかにすること は、デンプン生合成全体を考える上で重要である。
ジ ャ ガイ モ 塊 茎AGPase大 サブ ュ ニ ット(PLS)の ラ ンダ ム 変 異導入 により 得られた2 種 のUplお よぴUp2変 異 は 、3‑PGAの 活 性化 を 受 けや す く 、Pi阻 害 に高 い 抵 抗性 を も つ「活性上昇型くup‑regulated)」酵素を与えた。本研究では、シロイヌナズナAGPase大サ ‑ 1059―
之 和
篤 英
浩 博
春
藤 井
田
伊 松
横 森
授 授
授 授
教
教
助 教
教 助
査 査
査 査
主 副
副 副
ブ ユ ニ ッ トApLlにUplお よ びUp2変 異 に 相 当 す る 変 異 を 同 時 に 導 入(Up3変 異 ） し、
小 サ ブ ユ ニ ッ トApSlと 共 発 現 さ せ 、2重 変 異 酵 素(AA‑Up3)を 作製 した 。AA‑Up3は野 生 型 酵 素 で は 阻 害 物 質 であ るPiによ り活 性化 され た 。こ の特 性は 、植 物内 での 高い AGPase活性維持に寄与すると 考えられ、実際、AA‑Up3を発現するシロイヌナズナ形質 転 換体は，野生型植物より高い同化デンプン代謝回転率を示し、植物生長等を支える炭素供 給能の向上が示唆された。
Up3変異酵素のアロステリック特性解析ならびに立体構 造モデリングから、Up3変異 導 入 に よ るPi活 性 化 機 構 が 、Up2変 異 に よ るPi親 和 性 の低 下と 阻害 への 抵抗 性お よぴ Upl変異による大小サブユニ ット間の相互作用変化を介したシグナル伝達の改変により生 じて いる こと を明 らか にし た。 また 、Upl変異 が位 置す る領域はATP結合部位に相当 す ることから、推定ATP結合部 位に変異を導入した変異酵素を作製した。8ーazido‑ATPによ るフォトアフイニティラベル実験から、変異導入は大サ ブユニットのATP結合能を野生型 大サ ブユ ニッ トの80％ に低 下させるが、小サブユニット のATP結合能には影響しない こ とを明らかにした。一方、反応速度論的解析から、変異 導入は酵素のATP親和性を野生型 酵素 の約50％ に減 少さ せ、3‑PGA親和 性お よびPi阻 害へ の抵 抗性 も低 下さ せる こと が 示された。ATP結合部位は大 小サブユニットの相互作用に関与する構造に隣接することか ら 、AGPaseの ア ロ ス テ リッ ク活 性化 は、 大サ ブユ ニ ット への3‑PGAの 結合 、ATPの結 合による構造変化が小サブユニットーと伝達し、酵素を活性型へと移行させることにより 起こることが示唆された。
シ ロイ ヌナ ズナ 長角 果で は2種の大サブユニット(ApLl＆ApL3)が同時に存在する． 大 腸 菌 内 でApSlとApLlお よ びApL3を 共 発 現 さ せ 長 角 果 のAGPaseサ ブ ユ ニ ッ ト 発 現 をモ デル 化し た。 菌体 抽出 液からApL3に付加したHis‑tagを利用して酵素精製したと こ ろ、ApSl:ApLl:ApL3゜2:1ニ1で構成されるヘテロ大サブユニットAGPaseが得られた。 こ の酵素は、ホモ大サブユニッ トAGPaseと同等の酵素機能を示した。したがって、異な る 大サブユニットが同時に存在 すればホモ大サブュニットAGPaseだけでなく、ヘテロ大 サ ブユニットAGPaseが安定した 酵素として植物体内で十分存在可能であることが示唆さ れ た。
本研究では、AGPaseのアロステリック特性を改変した「活性上昇型」酵素を作製し、そ の酵素特性および立体構造モデルの解析から、構造変化をともなう大小サブユニット間の シグナル伝達がアロステリック調節に重要であることを 明らかにした。また、ATPが基質 としてだけでなく、第3のア ロステリック因子として機能することを示した。さらに、異 なる大サブユニットをもつAGPase存在の可能性を示した。これらの知見は学術的のみ な らず、植物体内における炭素源を有効に利用しデンプン量を増加させるなどの応用面にお いても大いに貢献するものと判断した。
よってく審査員一同は、尾花由美子が博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格を有 するものと認めた。
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