九州大学学術情報リポジトリ

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九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

効率的な肺ガン特異的ヒト型モノクローナルIgG抗体の取得に関する研究

川原, 浩治

九州大学農学研究科食糧化学工学専攻

https://doi.org/10.11501/3075469

出版情報：Kyushu University, 1993, 博士（農学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

(2)

(3)

一一一一一一一圃.

. I

交力三容白勺大丈月市ヵーンキ寺三妻宅三E^EヨEヨ白勺ヒ ^ト ^主担こモノクロナノレ I g G主元全本の

耳叉�専に思弓す一る砂子多宅

JJI JJ.烹す告才台

1 9 9 4

(4)

第1章

第2章

第1節

第2節

第1 項

第2 項

第 3 節

第4節

第5節

第6節

第 3 章

第1節

序論

ヒト型ハイブリドーマ作製のた

めの細胞融合法の検討

緒言

P E G法と電気融合法

ヒトリンパ節からのリンパ球の

分離

融合パートナー細胞の調製

電気融合法の条件の検討

P E G法と電気融合法の比較

考察小括

IgG 抗体産生ヒト型ハイブリド

ーマ作製のためのヒト融合パー

トナー細胞株の樹立

緒言

1 1

1 4 1 5 1 6 1 9 2 2

2 4

2 5

(5)

第2節第1 項第2 項第3 項第3節第4節

第1 項

第2項

第5節第6節

第4章

第1節第2節

第1 項

融合パートナー細胞株の樹立

親細胞の選択

HMy-2細胞の培養とクローニング

選択培地の成分濃度の検討

細胞融合

\ イブリドーマの抗体産生

\ イブリドーマの産生する抗体

のクラス

乳ガン特異的モノクローナル抗体の取得とその反応性の検討

考察小括

ハイブリドーマのクラススイッ

チ変異体の取得

緒言

フローサイトメーターを用いた

変異体の検出

フローサイトメトリー

1 1

2 ₇

2 ₉

3 0 3 3

3 5

3 6

4 0 4 2

4 3

4 5

(6)

第2 項第3 項第3節第4節

第5節第6節

第5章

第1節第2節

第1項

第2 項第3項

第3節

細胞の培養と検体の調製

クラススイッチ変異体の検出

クラススイッチ変異体の分取

クラススイッチを促進する因子

の検索

考察小括

抗体非産生融合パートナー細胞

の樹立

4 ₈

5 3 5 6

5 9

6 1 6 3

緒言 ⁶4

融合パートナー細胞の樹立

ヒト白血病細胞株M₀_{1 t}4の培養と

クローニング

細胞融合

A ⁴H ¹2細胞由来のハイプリドーマの産生する抗体クラス

肺ガン特異的モノクローナル

抗体の取得

1 1 1

6 6

6 7

6 9

7 3

(7)

第4節第5節

第6章

第1 節第2節第3節

第1 項第2項第3項

第4節

第5節

第6節

考察小括

ヒトリンパ球の体外免疫法の確立

緒言

細胞の調製と培養体外免疫法の確立リンパ球の前処理

体外免疫の検出法の開発種々の免疫賦括剤の体外免疫

におよぼす効果

免疫感作リンパ球の産生する特異抗体のクラス

体外免疫に及ぼすリンパ球の個体差

抗原となるガ、ン細胞の違いが体外免疫に及ぼす影響

1 V

7 6 7 7

7 8 8 0

8 1 8 4

8 8

9 4

9 6

9 8

(8)

第7節

第8節第9節

第7章

第1節第2節

第1 項第2 項第3節

第4節

第5節第6節

ヘルパー T細胞が体外免疫に

及ぼす影響考察

小括

体外免疫リンパ球を用いた肺ガン特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得

緒言

リンパ球の体外免疫リンパ球の調製

体外免疫

細胞融合とハイブリドーマのスクリーニング

抗原であるA ^{5 4}9細胞に対する抗体の反応性

考察小括

V

1 0 0 1 0 2

1 0 4

1 0 5

1 0 7

1 0 8

110

11 3 1 1 6 118

(9)

第8章

第1 節第2節

第3節

第4節

第5節

第6節第7節

第9章

第1節

肺ガンに反応する抗体の反応性の検討

緒言

E L 1 S A 法を用いたガン細胞株と

の反応性の検討

蛍光抗体法を用いた生細胞との反応性の検討

ヒト肺ガン組織との反応性の検討

肺ガンを認識する抗体の抗原の検索

考察小括

新しい細胞固定法を応用した

E L 1 S A法の開発

緒言

V 1

1 1 9

1 2 2

1 2 5

129

1 3 9 1 4 3

1 4 5

1 4 7

(10)

第2節

第3節

第4節

第5節第6節

第1 0章

第1節第2節

第3節第4節

第5節

細胞固定に必要な電子線照射時

閣の検討

細胞の固定法の違いによる反応性の変化

MW固定した種々の細胞株に対する抗体の反応性の比較

考察小括

\ イブリドーマの抗体産生とその高産生株の分取に関する検討

緒言

細胞膜面に存在する抗体量と細胞周期との関係

細胞内抗体量と細胞周期の関係抗体産生性の高いハイブリドー

マクローンを取得するための方法の提案

小括

V 1 1

1 4 9

1 5 3

1 5 7 1 5 9 1 6 1

1 6 2

1 6 4 1 6 9

1 7 2

1 7 5

(11)

第1 1 章総括 ^{1 7 6}

謝辞 ^{1 8 6}

引用文献 1 8 7

V 1 1 1

(12)

第1章序論

ハイブリドーマとは、自己増殖可能な親細胞株と抗体産生はするが増殖できないリンパ球を細胞融合して得られる新しい細胞株のことである。ハイブリドーマは細胞増殖を行いつつ単一の抗原特異性を持つ抗体、すなわち

モノクローナル抗体を産生する。 197 5年に世界で初めて

K 0 h 1 e rとM_{i 1}s t e i nは、マウスの系を用いたこの研究を報

告したい。 19 8 0年にはOlssonとKaplanがヒトの系で成功し三J、動物細胞を用いた有用物質生産という細胞工学の新たな分野が広がってきている。

こうした研究をもとに、モノクローナル抗体の生産と利用は重要性を増してきている。従来、細胞生理学や生化学、免疫学の分野では、抗体の特異性に着目して種々の物質の同定や検出、さらには精製等に、動物に免疫して得られる抗血清を利用してきた。しかしながら、抗血清には必要な特異性を持つ抗体ばかりでなく、元来血液

中に存在する抗体が含まれており、純度の高い単一の抗

原特異性を示す抗体を精製することは実際的に不可能であった。一方、モノクローナル抗体は、クローン的に増

4Ei

(13)

殖するハイブリドーマから取得されるため、原理的に単一の抗原特異性を有している。また、血清を用いた細胞培養ではなく、すでに知られている種々の細胞増殖因子を用いた無血清培養を行うことにより、必要十分量の純度の高い抗体を簡単な精製だけで取得可能である 3 )。以上の見地から、モノクローナル抗体の取得、利用に関し

て多くの研究がなされてきた 4〉o

ところで、マウスのモノクローナル抗体は、実際的に種々の目的で利用可能な段階へと到達している。しかしながら、ヒトのモノクローナル抗体は未だその取得に困難を伴っている。これには、次に述べるような原因が考えられよう。まず、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製するための理想的な親細胞株が存在しないという点である。マウスでは倍加時聞が短く、さらにクローニング効率や融合効率が高い細胞がすでに樹立されている5 )。この細胞はまた、骨髄腫細胞由来であるにも拘らず、細胞自身が抗体産生しないため、これを用いてハイブリドーマを作製した場合、その抗体産生に影響を与えない。一方、ヒトでは、マウスの系のような優れた親細胞株は樹立されていないため、得られるハイブリドー

nJb

(14)

マの産生抗体は親細胞由来の抗体産生の影響を受けてし

まう。次に、免疫の問題がある。一般に、目的抗原に対

する抗体を作製する場合、マウスでは直接体内に投与す

ることによって体内免疫が可能である。しかし、ヒトの

場合、抗原を体内に投与して免疫することは道徳・倫理

上許されない。また、抗原が極めて毒性が高かったり、

致命的な疾病を引き起こす物質である場合は、感作リン

パ球の入手すら困難である。従って、ヒト型の抗原特異

的モノクローナル抗体を取得するには、自然発生的な免

疫感作の生じたリンパ球提供者に依存するしかない。こ

うした点が、マウスの場合とは異なってヒトの系でのモ

ノクローナル抗体の取得を困難にしているものと思われ

る。

それにもかかわらず、ヒト型の抗体が必要とされる主

な理由は、医薬として利用するためである。マウスの抗

体を医薬としてヒトに投与した場合、人体内では異物で

あるため、これを排除しようと種々の生体防御機構が働

くれo その結果、例えばアナフィラキシーショック等が

生じてしまい、

人体の機能に障害を与える。蛋白工学的

手法によりこうした副作用のない抗体を作製しようと試

円《U

(15)

みている報告もあるが円、現在のところ有効な手段として確立していない。しかし、ヒト型モノクローナル抗体は人体に直接投与しても元来ヒト由来のタンパクであるため、副作用なしに利用することができる。

そこで、近年こうしたモノクローナル抗体の特異性を利用して、ヒトの難治疾患のひとつであるガ、ンの診断治療を行うことが検討されているれ一1 ⁰)。これまで、ガ

ンの診断・治療は X線による早期発見および手術による局部除去、化学療法等が主として行われている。しかしながら、ガンは人体内にもともと存在する細胞が悪性化することにより生じる疾患であるため、力。ン細胞のみを選択的に完全除去することは困難であると思われる。一方、モノクローナル抗体はガン細胞が体内のどの部位に存在しても、特異的に検索することが可能であると考えられる。さらに、抗体に殺細胞効果を持つ物質等を結合

させることにより、ガン細胞のみを除去することも可能

であろエ_ノO、 1 ^{1 )} 以上の見地から、モノクローナル抗体を

用いたガンの診断・治療は、細胞工学の技術を用いた最

も期待される有用な研究のひとつであると考えられている。

- 4 -

(16)

著者は、これまで述べてきた視点、から、以下の各章で述べる内容について研究してきた。 F _ig. 1 -1 に本研究の内容を略図で示した。

まず、ハイブリドーマ作製のための細胞融合法としてポリエチレングリコール ( P E G )法1 2 )と電気融合法1 ^{3 )} とを比較検討した (第2章; C - 2 )。電気融合法は、

近年、 Zimmermannらによって報告された方法であり、

PEG法より融合効率が高いとされている。そこで、これらの融合方法を試みた。その結果、使用する親細胞株の融合効率が低い場合や融合に供される細胞数が少ない場合のように特別な条件下では、電気融合法がPEG法より有効であるが、通常の融合条件下ではほとんど差がないと思われた。

つづいて、免疫グロブリンのサブクラスであるIgG型の特異抗体を取得するためのハイブリドーマ作製用親細胞株の樹立を試みた (第3章; _C _- 3 )。その結果、新

たに親細胞株HK-128が得られた。この親細胞株を用いて作成されたハイブリドーマの90%以上は、 IgG型の抗体を産生していた。従来から報告されているヒト型のモノク

ローナル抗体は、 IgM型がほとんどであるため 14)�16)

phd

(17)

(C-l，C-ll)

。

Parent cell

.HK-128 (C・3 )

・A4H12 (C・5 )

L戸nphocyte

• In vitro immunization (C・6 )

• Mutation (C・4 )

Hybridoma

γ

^IgG

l-_____，/

γ

• Ig Productivity (C・10)

Antigen specific

monoclonal antibodies

Fig.l-l

Aquisition of cancer speci白c monoclonal antibodies

nhu

(18)

本法は!gG 型の抗体取得法のーっとして新しい知見を与

えた。しかしながら、得られたハイブリドーマの抗体産

生は安定せず、長期継代培養すると抗体が産生されなくなる欠点、を有していた。

次に、既存の!gM 型ガン特異的ヒト型モノクローナル

抗体産生ハイブリドーマHB4C5を用いて、産生抗体クラ

スの変異した細胞、すなわちクラススイッチ変異体を検出・分取することを試みた (第4章; C ^- 4 )。その結

果、 H _B4 C 5細胞は低頻度ではあるけれども細胞内ですべ

ての免疫グロプリンサブクラスの抗体を産生しているこ

とが明かとなった。しかし、 IgG型の抗体を産生する

H _B4 C 5細胞を分取して、培養したところ、培養初期の一

時期は!gG 型の抗体を培養液中に分泌するものの、培養を継代するにつれて!gG の産生は消失することが分かつ

7こ。

つづいて、ハイブリドーマの親細胞株の抗体産生が、

得られたハイブリドーマの抗体産生へおよぼす影響を排

除するため、抗体産生をしない T細胞由来の融合用親細胞株の樹立を試みた (第5章; _C - 5 ) 0 その結果、新

しくA4 H ¹ 2細胞を樹立したo この親細胞株を用いて得ら

(19)

れるハイブリドーマの抗体産生は、リンパ球由来のサブ

クラスの抗体のみ産生しているものと思われた。したが

って、 A4 H ¹ 2細胞を用いることにより、親細胞株自身の

産生抗体の影響を受けることなく、ハイブリドーマを取

得することが可能であることを明らかにした。

次に、ガン細胞のように生体にとって危険な抗原をヒ

トの体内で免疫することは不可能であるため、生体外で

ガン細胞を抗原にしてリンパ球を免疫する、体外免疫法

の確立を試みた(第6章; _C _- 6 )。この結果、 _{アジュ}

パントペプチド、インターロイキン 2 、インタロイキ

ン6を添加した培養液を用いることにより、ヒトリンパ

球の体外免疫が可能であることを明らかにした。

つづいて、健常人由来のリンパ球を、肺ガン細胞を抗

原として体外免疫し、その感作リンパ球とA4 H ¹2細胞を

用いてハイブリドーマを作製した。そして、従来のガン

患者由来のリンパ球を用いた場合よりも効率的な特異抗

体の取得が可能か否か、またはG 型の特異抗体が取得可

能か否かについて検討した(第7 ^ニå込_早 _; _C

- 7 )。その結

果、体外免疫したリンパ球を用いてハイブリドーマを作

成した場合は、従来の患者由来リンパ球を用いた場合の

- 8 -

(20)

2 0倍以上の効率でガン特異抗体を取得可能であることを明らかにした。また、これまでほとんど得られていな

かったIgG 型の特異抗体も高効率で取得可能であること

が分かった。

つづいて、肺ガンに対して反応する抗体の詳細な反応

性を種々のヒトガン細胞株および肺ガン組織を用いて検

討した。さらに、それらの認識する抗原を分子量的に検

索するため、ガン細胞のホモジネートをウエスタンブロ

ッテイング法に供して検出することを試みた (第8章

C - 8 )。検討した 7種の抗体は、抗原として用いた肺ガン細胞以外のガン細胞に反応したり、ガン細胞の細胞

質や細胞膜に反応するなど多様な反応スペクトルを示し

た。さらに、これらの抗体の中には、分子量4 0もしく

は5 0 _K D のガン細胞抗原を認識しているものがあるこ

とを明らかにした。

また、ガン特異抗体のスクリーニングのために、従来

のグルタルアルデヒド細胞固定法ではなく、新たに電子線(マイクロウェーブ)を用いた細胞固定法の応用を検

討した (第9章; _C _- 9 ) 0 その結果、モデルとして用いた特異抗体とその抗原である細胞との反応性は、マイ

nuJU

(21)

クロウェーブ固定法を用いた場合とアルデヒド固定法を用いた場合とでは異なることを明らかにした。したがって、 1次スクリーニングに本法を用いることにより従来とは異なる反応性を持った特異抗体を検出することが可能であることが分かった。

最後に、得られたハイフリドーマの抗体産生に関する性質を、細胞周期や細胞内外の抗体生産、分泌抗体について検討した (第1 0章; ^C ^- 1 0 )。その結果、ハイブリドーマの抗体産生は細胞周期に一部依存する傾向があり、それは抗体の細胞膜透過性と何らかの関係がある

ものと思われた。

以上述べたように、本研究によりヒト肺ガンに特異的な1 ^gG 型モノクローナル抗体を高効率で取得することが可能となった。

一10 -

(22)

第2章ヒト型ハイブリドーマ作製のための細胞融合法の検討

第1節緒言

細胞融合は、膜融合、細胞質融合、核融合の 3段階に大きく分けることができる。ただし、一般には膜融合が起これば、自発的に残りの融合は進行する。従って、ハイブリドーマを効率よく取得するには、効果的に膜融合を生じる条件を検討すればよい。現在、よく用いられる融合法としては、ポリエチレングリコール( P E G ) 法と電気融合法があげられよう。そこでこの2 つの方法について融合効率を検討した。

PEG 法の原理は、詳細が明かではないが、細胞膜の構造と膜電荷に関わっていると推定されている 18)0 PEG の存在下で、細胞膜を構成している脂質2重層と機能膜

タンパクの構造変化が生じ、それぞれの細胞間距離が接近することにより、お互いに引き合う力が作用して膜融合が起こるとされているo 一方、電気融合法の原理は、

細胞膜の膜電荷のみに依存し、物理的に膜構造変化を誘

- 11 -

(23)

発することにある1 9 )。通常、細胞膜は負の電荷を持っている(Fig. 2-1 (A))。従って、細胞の懸濁液に電場を作ることにより、細胞の膜荷電状態を変化させ、細胞同士が互いに引き合う力を生じさせることができる(Fig.2- 1 ( _B))。正と負の電極聞に強力なパルス性の電圧を印加すれば、細胞膜構造に瞬間的に破壊が生じる(Fig. 2-1

( c ) )。細胞間距離をできるだけ少なく保った条件下で

は、破壊された膜同士が接合して融合細胞となる(F i g . 2 -1 _{( D}) )。

そこで、著者は電気融合法の最適融合条件を設定し、

従来から用いられている PEG法と比較して、より効率的なハイブリドーマの取得法について検討した。

一12 -

(24)

(A) 。

-

圃

Electrode

+

(B)

+

Pulse

(C)

jGJJ ? ;

(D)

Fused cell

Fig.2・1

Diagram of principle of electrofusion

(A) : Conditions o.f cell membranes having negative charges (B) : Formation of the electric field on cell suspension

(C) : Destruction of cell membranes by pulse shock

(D) : Generation of a fused cell by restoring cell membranes

13

(25)

第 2節

第1 項

P E G法と電気融合法

ヒトリンパ節からのリンパ球の分離2^{0 )}

5 m 1培養ディッシュ 3枚に、基本合成培地 ERDF21) (極東製薬) をそれぞれ5 m 1ずつ用意して、最初の1枚でリンパ節を洗った。別のディッシュにピンセットでリ

ンパ節を移し、リンパ節に付着している脂肪組織を解剖パサミでできるだけ完全に切除した。もし、脂肪組織が除去されていないと、分離後の遠心洗浄操作が増え、細胞の生存率や細胞数の低下をきたすので注意した。さらに残りのディッシュにリンパ節を移し、 2本のメスを直

交するように持って、 2 -- 3 mm角程度に細かく切った。

ハサミではなくメスを使うのは、切断面が押しつぶされて細胞の生存状態を悪くしないためである。 2枚のスラ

イドグラスの聞にリンパ節の細断片をはさんで、すりあわせながら、リンパ球を培地中に押し出したo リンパ節はスライドグラスで押しつぶすのではなく、すりあわせる回数を多くしておだやかに採取した。培地中のリンパ球懸濁液を遠心管に移し、 400 gで10分間遠心した。遠心

- 14 -

(26)

上清を捨てて、さらに新鮮なERDF培地で懸濁して、リンマ球の洗浄を 3回行った。こうして得られたリンパ球を実験に供した。通常、 7 rn rn程度のリンパ節から、 1 07個以上のリンパ球が生存率90%以上で採取された。

第2 項融合ノマートナー細胞の調製

融合パートナー細胞としては、 HO-323 細胞2 2 )とL1 CR-LON-HMy2(HMy2)細胞23)を用いた。両細胞ともヒトリ

ンパ球由来であり、前者はB リンパ芽球様細胞株、後者はプラズマ細胞腫細胞株である。これらの細胞に関する報告では、融合効率はHO-323細胞が 10 5親細胞につき1 クローン程度であり、 HMy2細胞は105親細胞につきO. 1 クローン程度である。培養は10%の濃度で牛胎児血清

( F B S ; ハイクローン社)を含むERDF培地を用いて、まきこみ細胞密度1 x 1 0 5 細胞/ rn 1で2 日おきに継代した。

細胞の状態をよくするため、融合前日には必ず培地交換を行い、細胞密度5x 105 細胞/ rn 1に調製後培養したo この状態で細胞の生存率を測定すると、 9 5 % 以上の良好な

値を示した。

- 15 -

(27)

第3節電気融合法の条件の検討

電気融合を行うにあたって、融合装置は電子科学社製

のES C F - 3 0 0 1をイ吏用した。融合は、親細胞株とリンパ球

の並列化(パールチェーン形成) を行った後、パルス波の電圧印加によって細胞膜に穿孔を開けるという2段階の操作を伴う24)。ごの2 つの操作のうち、前者は交流 1 0 0 Vを10秒間印加することで十分であった。後者はパル

ス電圧が融合細胞の形成頻度と生細胞率に大きく影響したため、その条件設定が重要であると思われた。そこで、

印加パルス電圧と融合細胞の出現率、さらに生細胞率との相関を検討した。

Fig.2-2 に結果を示した。融合効率は検鏡によりー視野に存在した 100細胞の親細胞に対する融合細胞数として示されており、生細胞率はトリパンブルー染色法を用いて測定した。印加電圧2.0KV，--_，2.3 KV/crnの範囲で融合細胞数が1 5程度と多く認められ、生細胞率も80%以上と

良好な条件であるごとが分かった。印加電圧1.4KV/crn 以下では細胞の融合像は全く認められず、また死細胞も

ほとんど存在しなかった。さらに、 2.6KV/crn以上では細

- 16 -

(28)

胞の破壊が生じて融合には不適であった。そこで、パルス電圧2. OKY--- 2.3 KY/cmで、実際にハイブリドーマを作製することにした。

- 17 -

(29)

EmMOロosagn三間凶 (の}Oロ巾印\]{00日)mw円角川口門の巾ロω)

20 50 10

(ま)kCヨssk〆

。。

2.3 2.6 Pulse voltage (KV / cm)

1.7 2.0 1.4

Fig.2-2

Effect of pulse voltage on廿le viability and electro

fusion efficiency of I-IMy2 cells.

Cell viabilities (

•

.) were measured byせle trypan blue dye exclusion test and fusion efficiencies ( 1222]) were decided by counting the number of fused cells with microscopic observation.

一18 -

(30)

第 4節 ^{P E} G法と電気融合法の比較

PEG法による細胞融合は次のように行った。融合パートナー細胞株を1_x107 細胞とリンパ球を2 _x1 0 7 細胞用意し、それぞれを混合して遠心した。遠心上清を取り除いて、細胞のペレットをほぐし、 ERDF培地で50% に希釈したPEG 4000 (メルク社) を1分間で 1m 1 加え、さらに 1 分間3 ₇ocに保温した。つづいて、 3 0秒おきに 1m 1ずつ ERDF培地を添加して全量で10m1 ，こした。遠心して、細胞を沈でんさせた後、上清を捨てて15%FBS含有ERDF培地 5 0 m 1で懸濁し、 9 6穴培養プレートに 10 0μl/wellの密度でまきこんだ。電気融合法は細胞数をPEG法の場合と同じか、その3分の1になるように調製した。融合パートナー細胞とリンパ球を混合して遠心後、電解液である融

合緩衝液(0. 25M Mannitol. O.lmM CaC12. O.lmM MgC12 になるように0.2mM Tris-HCl緩衝液 p H ₇. 2に溶解したも

の) に懸濁して1回洗浄した。融合緩衝液1m 1に細胞を懸濁して、融合チャンパー(電子科学社) に移し、融合装置を各条件に設定後操作した。 5分間放置後、チャン

てーから細胞を回収して、 ERDF培地に懸濁し遠心した。

- 19 -

(31)

15%FBS含有ERDF培地5 0 m 1に細胞を懸濁して9 6穴培養プレートに1 0 0μ 1 _/m 1になるようにまきこんだ。融合後は、

ハイブリドーマのみを増殖可能にする選択培地 HAT ( 1 00μ M Hypoxanth i ne. O. 4μ M A m i n 0 p u t e r i n. 1 6μ M Thym i d i neを含む15完FBS-ERDF培地〉で細胞を培養した。

ハイブリドーマの出現が確認されるまで、 2 、 3 日おき

に培地交換をした。

T a _b1 e 2 -1にPEG法と電気融合法を用いた融合効率の結果を示した。 HMy2細胞は、 PEG 法では105 融合パートナ -細胞あたりわずか o . 1クローンの融合効率であるにもかかわらず、電気融合法ではその効率はおよそo . 5 クローンまで上昇した。パルス電圧を2. 0 _KVと2. 3 _KVに変化さ

せても融合効率には、ほとんど影響はなかったo また、

融合に供した細胞の密度を低くしても、融合効率の低下はほとんど認められなかった。一方、 HO-323 細胞を用いた場合、 PEG 法では高い融合効率を示しているにもかか

わらず、電気融合法ではその効率の上昇は認められなかっfこ。

- 20 -

(32)

r:-..:>

トーd・

Table 2・1

Production of human-human hybridomas using PEG or electrofusion me出ods

Parent cel1 Fusion methods Pulse vol tage (KVjcm)

HO-323 PEG

HO-323 Electrofusion 2.0

HMy2 PEG

HMy2 Electrofusion 2.0 2.0 2.3 2.3

Cell density Fusion efficiency ( x107 cells/ml) (clone/ 105parent cells )

3.0 1.10

3.0 0.85

3.0 0.10

1.0 0.48

3.0 0.35

1.0 0.48

3.0 0.50

(33)

第5節考察

電気融合法は、 PEG 法で融合効率が低いHMy2細胞から効率よくハイブリドーマを取得可能であるという利点が認められた。 Mathewらも、 1 _{9 8}4年にやはり電気融合法によりハイブリドーマを効率よく取得している 25〕O しかしながら、 PEG 法で比較的融合効率の高いH₀-3 2 3細胞の場合は、電気融合法に供しでも、その上昇はあまり期待できないことが明らかになった。また、電気融合法と同

じ原理で利用されている、電気穿孔法による遺伝子導入等では、今回設定したパルス電圧よりはるかに高い電圧

で細胞膜を破壊させることがある26) 。これらの結果は、

電気融合法のパルス電圧は、必ずしもすべての細胞で均ーであるわけではなく、使用する細胞で十分な検討が必要であることを示唆していた。

電気融合法は条件設定さえ確実に行えば、理論的には細胞数が少なくても融合させることができるo それは、

パールチェーン形成の段階で、検鏡しながら融合ノマートナー細胞とリンパ球を意図的iこ接近させることができるからであるo P E G 法は遠心して細胞をペレット状態にす

- 22 -

(34)

るため、細胞数が少なければ、遠心による細胞の消失が起こってしまい、十分に融合させることはできない。

以上の見地から、電気融合法は融合効率の低い細胞を用いる場合や、細胞数が少ない場合には有効であるけれ

ども、実用的な融合効率を与える細胞を用いる場合は、

P E G法でも十分有効であると思われる。

- 23 -

(35)

第6節小括

ヒト型ハイブリドーマ作製のために、 PEG法と電気融合法の比較検討を行った。まず、電気融合法の最適条件

を求めるため、パルス電圧と細胞の生存率、および融合

効率の相関を検討したところ、 2.0--" 2. 3KV/crnの電圧で、

効率よく融合細胞が得られ、生細胞率も良好であること

がわかった。つづいて、実際にPEG法と電気融合法を用

いてハイブリドーマを作製したところ、 PEG法で融合効

率が低かったHMy2細胞は電気融合法により、その効率を

5倍程度高めた。一方、 PEG法で融合効率の高かった H 0 ^-3 2 3細胞を用いた場合、電気融合法ではその効率に

ほとんど変化はなかった。また、 HMy2細胞の場合、細胞

密度を低くして電気融合に供しでも、高い融合効率を保っていた。

- 24 -

(36)

第3章 IgG 抗体産生ヒト型ハイブリドーマ作製のためのヒト融合パートナー細胞株の樹立

第1節緒言

当研究室において、抗原特異的ヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、多数取得されているが27 ) 、これは極めて高い融合効率を有するヒト融合パートナー細胞株NAT-3014)およびHO-323細胞 2 ²)、 2 8 )が樹立されたことによるものである。これらの融合パートナ

一細胞株を用いてヒトガン細胞1 4 )、 29)や核酸3 0 )に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが樹立された

が、得られた細胞の多くはIgM 産生株であった。このことから、 NAT-30や H₀-3 2 3細胞が元来IgMを合成もしくは

分泌しているために、主としてIgM 産生ハイブリドーマが取得されてしまう点、さらにIgG 産生ハイブリドーマが得られでも速やかに抗体産生能が消失してしまう点が

考えられたo しかしながら、 I g G はヒトの血中抗体のうち70%を占めており、抗体による生体防御機構の主たる担い手であるo また、 I g Gの分子量がIgMの5分の l程度

-25 -

(37)

と小さいため、各組織への到達がIgM より容易である等

の利点、を有している。さらに、抗体の精製に関しても、

IgMより1 g Gの方が比較的容易であると考えられる。

以上の見地から、 1 g G クラスのヒト型モノクローナル

抗体を効率的に取得するために、新しく融合ノマートナ

細胞株を樹立することを試みた。

- 26 -

(38)

第2節融合パートナー細胞株の樹立

第1 項親細胞の選択

我々は、 ₁g M 産生ハイブリドーマしか取得できない原因のひとつとして融合パートナー細胞株自身の抗体の合

成・分泌が影響しているものと考えた。そこで、新たに融合パートナー細胞の樹立に用いる親細胞は、もともと IgG産生を行っている細胞に求めることとした。 Ta b 1 e

3 ^-1に現在までに報告されている融合パートナー細胞株を示した。この中から、 LICR-LON-HMy2(HMy2)細胞23) を用いて、新しい融合パートナー細胞を樹立することにしたo H M y 2細胞は形質細胞腫細胞株であり、 IgG を産生している。さらに、 ₈ - アザグアニン耐性株であり、実験で取得される様々なクローンを実際にリンパ球との細胞融合lこ供して、ハイブリドーマが取得可能であるか否

かを速やかに検討できるという利点があるo そこで、このHMy2細胞を以下の実験に供した。

- 27 -

(39)

Table 3・1

Human fusion partners for making human-human hybridomas

Fusion pa此ner Original cell line Fusion efficiency Reference Cell匂rpe Ig class (clonej 10 5parent cells)

r、コ NAT-30 B-l戸nphoblastoid IgM 0.3 14)

00

HO-323 B-lyrnphoblastoid IgM 1.8 22)

LICR-LON-HMy2 Plasmacytoma IgG 0.1 23)

SKO-007 Plasmacytoma IgE 0.1 2)

GM1500 B-l戸nphoblastoid IgG 0.2 31)

UC729-6 B-lyrnphoblastoid IgM 0.3 32)

KR四12 Hybrid myeloma IgG 0.1 33)

(40)

第2 項 HMy-2細胞の培養とクローニング

HMy2細胞は基本合成培地ERDFに10% の濃度で牛胎児血

清(F B S )を添加した培地を用いて継代培養した。目的とする融合パートナー細胞株は、融合操作で弱った状態からでもハイブリドーマとして増殖可能でなければならないため、クローニング効率の高いクローンを取得することにした。クローニングは限界希釈法により行った 34〉0

まず、 HMy2細胞を15%FBS-ERDF培地に懸濁して、 9 6穴培養プレート (ヌンク社) の1穴につき1細胞となるよ

うにまきこんだ。まきこみから2 ---- 3時間して、培養プレートを検鏡し 1穴に1細胞が存在するものに印をつけた。これらのうち、最も増殖の早いクローンを再度クロ

ニングに供した。この操作を5回繰り返したo 最初4

%だったクローニング効率は、 2回目のクローニング終了時には10%、 3回目で28%、 4回目で42覧、そして5回目には10 0 %を示した。この結果、細胞1個からでも増殖可能なクローンを取得し、これをHK-128と名づけて細胞融合に供することにした。

- 29 -

(41)

第3項選択培地の成分濃度の検討

融合に供した細胞はハイブリドーマのみを増殖させ、

親細胞株は死滅するような選択培地で培養した。一般に融合パートナー細胞株は、 ₈ - アザグアニンもしくは6

ーチオグアニン耐性株であるため、ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ、 ( HGPRT) を欠損しており、細胞の有する2 つの核酸合成田路の一方を欠く。さらに選択培地中のアミノプテリンが他方の回路の核酸合成過程を阻害するため、親細胞は増殖できず死滅する。しかしながら、ハイブリドーマはリンパ球からHGPRT の供給を受けて核酸合成田路の回復が生じ、選

択培地中でも増殖可能になる 3 ⁵)。

HK-128細胞の場合もこの原理に従って培養可能であるが、実際に細胞融合したところ、得られるハイブリドー

マの増殖がアミノプテリン濃度に鋭敏に影響されることが分かったため、この最適濃度を検討したo

Fig.3-1(A)に、種々のアミノプテリン濃度下での HK-

1 2 8細胞の生存率を示したo マウスやヒトの融合パートナー細胞を用いる場合、一般にアミノプテリン濃度は、

- 30 -

(42)

40 0 n M に調製する。 HK-128細胞は40 0 n M で5日程度培養

することでほぼ死滅し、その 9分の 1 の濃度である 4 4

nMでもこの傾向は同様であった。しかしながら、さらに

希薄な15 n Mの濃度では5日間の培養後でもほとんど細胞

は死なず、利用不可であることが分かった。そこで、

44nMのアミノプテリン含有培地を用いて、 HK-128細胞と

そのハイブリドーマを培養し、その増殖速度を検討した

(Fig. 3-1(B)) 0 2種類のハイブリドーマはいずれもこ

の培地中で成育することができるのに対して、 HK- 128

細胞は増殖できなかった。さらに図中に示してはいない

が、培養5日自に同じ培地を用いて継代培養をすると、

9日目にはHK-128細胞は、完全に死滅してしまった。

これらの結果から、 HK-128細胞を用いてハイブリドー

マを作製する際には、選択培地HAT のアミノプテリン濃

度を44nMに調製することにした。

- 31 -

(43)

(A) (B)

100. ^- ^圃 ^• ^- ^•• ^_ 100

、回^、

80.J 、15nM ^目^u^曲^u^-

，園田、_》_\《 44

刊

^司署。

F・4

、ー- 阿

.，+

仇_， ...

4 • ・

400

2へ

^∞^H ¹⁰

42伺•• _》²^，，^•^.⁴^•

」包

自

ω ₂己

ロυ ^ω

。I

i I i I i I i I i I

。 _l 2 3 4 5 。 2 3 4 5 6

Time

(days)

_Time

(days)

Fig.3・1

Effect of aI11inoputerin concentration on the viability and cell疋ro\Vth of HK-128 cells

A ^:

Viability of HK-128 cells cultured in medium containing various concentrations of aminoputerin

was measured by the tηrpan blue dye exclusion test.

B:HK-128cell and Wo hybridomas(Hyb.A，Hyb.B) derived from that cell were cultured in HAT

medium containing 44nM aminoputerin for 6 _days.

- 32 -

(44)

第3節細胞融合

樹立した新たな融合パートナー細胞株HK-128を用い、

乳ガン、甲状腺ガン、胃カ♂ ン患者由来のリンパ節もしく

は末梢血由来のリンパ球と融合した。方法は、第2章第

4節に示したPEG法である。 Table 3-2に親細胞株として

HK-128 、 HMy2、 HO-323細胞を用いて融合した時の各々の

融合効率を示した。

乳ガン患者由来のリンパ節リンパ球を用いて融合した

時、 HK-128細胞はその親株であるHMy2細胞を用いた場合

の約4 0倍と高い効率を与えた。さらに、 HO-323細胞の場

合と比較しても2倍程度と高い融合効率が認められた。

また、胃ガン患者由来の末梢血リンパ球を用いた場合、

HK-128細胞の融合効率は、リンパ節リンパ球を用いた場

合の半分程度まで低下するが、それでもHO-323細胞を用

いた場合の 2倍と良好な結果が得られた。

- 33 -

(45)

Table 3・2

Fusion efficiencies of various parent cells with lymphocytes isolated from lymph nodes or peripheral blood

*

Lyrnphocytes separated from peripheral blood of a stomach

cancer patient were used for the experiment.

(46)

第 4節 \ イブリドーマの抗体産生

第1 項ハイブリドーマの産生する抗体のクラス

HK-128細胞を用いて融合後、得られたハイブリドーマの産生する抗体を酵素抗体法(ELISA) 3ó)で測定した。

固相に結合させる抗原は、抗ヒト1 g G と1 g M 抗体(タゴ社)を50mMの炭酸緩衝液(pH9.6) に溶解して用いた。この反応を1時間以上行った後、抗体の非特異的反応を防

ぐために、 1先の濃度で牛血清アルブミン(_BS A )を含むリン酸緩衝生理食塩水(P B S )で、さらに1時間以上ブロッキングした。つづいて、ハイブリドーマの培養上清を1 時間反応させた後、結合した抗体のクラスを決定するために、 2次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ヒト1 g

Gもしくは1 g M (タゴ社)を1時間反応させた。反応測定のための発色基質液は、 O.3mg/mlの p-2， 2' -azino- bis-(3-ethylbenzothiazol ine-6-sulfonic acid)di- ammonium salt(ABTS) と0.003%の H 2 0 2を含むo . 1 Mのク

エン酸緩衝液( p H ₄_.0 )を用いた。得られる結果は、 ₄0 5 nmの吸光度である。そこで、陽性の判定は、検体の吸光

rhd nぺU

(47)

度からコントロールの吸光度を差し引いた値が、 o . 1を越える場合と定義した。

T a b 1 e 3 -3に HO-323細胞を用いた場合と比較して結果

を示した。 HK-128細胞を用いて得られたハイブリドーマはほとんどはG 抗体を産生しており、全体の1 0 %のハイブリドーマのみがIgM抗体とIgG抗体の両方を産生していた。しかしながら、最終的にはこの両方のクラスの抗体を産生するクローンは、 1 g M産生能を消失してしまった。

一方、 HO-323細胞の場合はほとんどのハイブリドーマが IgM抗体を産生しており、わずか2%のハイブリドーマのみが!gGとIgM両方を産生したにすぎなかった。これらのクローンもやはり培養をつづけることで、 !gG産生能が消失してしまった。

第2項乳ガン特異的モノクローナル抗体の取得とその反応性の検討

HK-128細胞と乳ガン患者由来のリンパ節リンパ球を用いて細胞融合を行って、ほぼ7000クローンのハイブリドーマを取得した。このうちヒト乳ガン細胞株 MC F - 7に

- 36 -

(48)

'"コーJ

Table 3・3

Classes of Igs produced by hybridoll1as derived froll1 HK-128 and HO-323 cells

Parent cells

HK-128 HO-323

Percent of hybridomas secreting Ig

IgG IgM

90 。

。 90

IgG+Igお1: None

10 0

2 8

(49)

特異的に反応するIgG 抗体産生ハイフリドーマHBll-17

を取得した。

Fig. 3 -2に、 E L 1 S A法を用いて 3 種のヒトカーン細胞

(乳ガン細胞株MCF-7、肺ガン細胞株PC-8、胃ガン細胞

株MKN-45) と正常繊維芽細胞 W ₁- 3 8に対する HBll-17

抗体の反応性を示した。この抗体のコントロールとして

ヒト血清IgGを同濃度で用いた。 HB11-17抗体は、若干反

応性は低いものの、乳ガン細胞株MCF-7 のみに反応し、

肺ガンや胃ガン細胞株および正常細胞株には反応しなか

っTこ。

- 38 -

(50)

0.2

�

^MCF-7

戸〈KC寸、3〉4

0.1

。

。 0.5

PC-8

1.0 0 0.5

[

Antibody

] (μg/ml)

Fig.3・2

1.0

Reactiviザof HB 11-1 ⁷ against three human cancer and a normal fibroblast cell lines

Culture supematant of HB 11-1 ⁷ hybridomas(Q) and human serum IgG (1阿川ll) (・) ^were

diluted 2 times with 1

^%

BSA/PBS sequentially，

むld were reacted with various cell lines.

- 39 -

(51)

第5節考察

現在までに、種々のヒト融合ノマートナ -細胞株が報告

されてきた (Table 3-1参照〉。一般的には、これらの

細胞は1₀5細胞あたりO.1クローン程度の低い融合効率し

か示さなかった。そこで、我々の研究室ではNAT-30や HO-323細胞のような融合効率の高い親細胞株を樹立してきた。しかしながら、この2 つの融合パートナー細胞株を用いて得られるハイブリドーマは、いずれもIgM産生株がほとんどであった。このことから、 IgG抗体産生ハイブリドーマを効率的に取得するには、新しく専用の融合パートナー細胞株の樹立が必要であることが示唆された。融合パートナー細胞株として最も重要な機能のひ

とつは、その増殖能にあるのではなかろうか。細胞融合直後のハイブリドーマは 1 クローンであり、これらは選

択培地中で培養され、さらに細胞質の状態は通常の2倍の染色体量をもっという不安定な状況にある。そうした

なかで、分裂を繰り返し、増殖してくるようなハイブリドーマが必要である。著者は以上の観点から、融合パー

- 40 -

(52)

トナー細胞株は高いクローニング効率をもたなくてはな

らないと考えた。

また、 HK-128細胞とHO-323細胞を用いて得られたハイブリドーマは、それぞれIgG抗体、 IgM抗体を主として産生していた。しかしながら、 1 g Gと1 g Mをともに産生しているハイブリドーマは、その抗体産生が不安定であることがわかった。新本らも、この点に関して1 g A産生ハイブリドーマを取得する際に同様な現象が生じることを示している37 )。一方、 ThomasらはIgG産生親細胞株と乳力、、

ン患者由来のリンパ球との融合で、乳ガン特異的なヒト型1 g G抗体を安定して取得している38〉0 これらの結果から、ハイブリドーマの抗体産生はその融合パートナー細胞株の元来持っている抗体産生系とリンパ球の持っている抗体産生系の両方に影響されており、安定した抗体産生はそれぞれのクラスが一致する必要があることを示唆

していた。

- 41 -

(53)

第6節小括

ヒト形質細胞腫細胞株LICR-LON-HMy2から、新たなヒト融合パートナー細胞株としてHK -1 2 8細胞を樹立した。

HK-128細胞は100完のクローニング効率を示し、 105 細胞につき1 クローン以上の高い融合効率を示した。得られ

るハイブリドーマの90%以上はIgG抗体を産生しており、

IgM抗体を産生しているハイブリドーマは、継代培養中にその産生を急速に消失した。この結果はHK-128細胞がヒト型 IgGモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得するのに、有効であることを示唆していた。

また、 HK-128細胞と乳ガン患者由来リンパ球との融合によって得られた約70 0 0クローンのハイブリドーマの中

から、ヒト乳ガン細胞株MCF一?に特異的に反応する1 g G 抗体産生ハイブリドーマHBll-17を樹立した。

- 42 -

(54)

第4章ハイブリドーマのクラススイッチ変異体の取得

第1節緒言

ヒト型ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、各種疾患の診断・治療に利用可能であるため、幅広

く研究が行われてきた 27〉o 我々の研究室もガン特異的ヒト型モノクローナル抗体に関する報告を行っている。

しかしながら、これら抗体のほとんどが1 g M 型であり、

1 g G 型の抗体は得られていない。一方、生体内では体外からの異物の侵入に対して、最初IgM抗体が産生され、

つづいてはG 抗体が産生されて抗原抗体反応により体内からすみやかに除去される。こうしたリンパ球の 1 gM産

生細胞からIgG産生細胞へのクラススイッチは、本庶らによって明かにされた 39 >。そこで、もしハイブリドーマでリンパ球のようにクラススイッチを起こさせること

ができれば、既存の抗体の抗原特異性を生かしつつさらに有用な抗体を培養細胞レベルで取得可能になる。

Scharffらは、実際にマウスハイブリドーマで、 1 g G ¹ からIgG2へのクラススイッチ変異体を取得したと報告し

- 43 -

(55)

ている 40)。また、 Rajewskiらもマウスハイブリドーマから、 IgG の一連のサブクラススイッチ変異体を取得したと発表している 41〉0 しかしながら、ヒト型ハイブリ

ドーマではこうした報告はない。さらに、 IgMから1 g G へのスイッチのようにアイソタイプ変異体に関する報告は、マウスの系でもみられない。

これらのことから、著者は1 g M型のヒト肺ガン特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマHB 4 C 5のクラススイッチ変異体を取得することを試みた。

- 44 -

(56)

第2節フローサイトメーターを用いた変異体の検出

第1項フローサイトメトリー

フローサイトメーターは別名セルソーターとも呼ばれている。この装置は 1秒間に1 0 0 0個以上の細胞を分析もしくは分取できる 42)0 Fig.4-1にセルソーターの構造について簡単に示した。検体となる細胞(Sample)は、前もって目的とする物質に対する蛍光抗体や蛍光色素で標識しておく。この検体はリン酸緩衝生理食塩水(PBS) で構成されているシース流(Sheath)とともに鉛直下方に噴射

される。ごのシース流の途中に蛍光色素を励起するためのレーザ一光(Laser beam)が照射されているため、検体が通過すると蛍光が発生する。この蛍光を種々の検出器 (Detector)が測定し、コンビューターに測定信号を伝達後、データ処理を行う。データは蛍光の他に細胞の大きさを表す前方散乱光(LS)と細胞の複雑さを表す側方散乱

光(9 0 L S )が得られる。従って、通常の測定ではLS と9 0 LSのヒストグラムを取得して、形態的に均一な細胞集団

のみの蛍光測定となるように指定(ゲーティング)した

一 45

(57)

後に、目的とする測定を行う。

また、細胞の分取は、次に述べる原理で行われる。検体を含むシース流は、機械的な振動により、液流から液滴が形成される。目的とする細胞を含む液滴に、正か負の電荷を与えると、落下途中にある電圧のかかった偏向板(Deflector)を通過する際に、正の電荷をもっ液滴は

負の極板側ヘ、負の電荷をもっ液滴は正の極板側ヘ誘引される。従って、偏向板の下に細胞回収用の培地入り遠心管(Test tube)を用意していれば、その中に目的とする細胞が落下する。ごうして、得られた細胞を実験に使

用する。

- 46 -

(58)

to Display

: : : : Computèr : : :

:

: :

Sample tube

Flow cell

Sheath tank

AU n a )O G 〉⑥，H一-bvrk+一一)O，H+己O

〈+

000@OO⑥000000 口。⑥ひ〉O」---EF--。

Deflector

Test tube +

Wastes

Fig.4-1

Structural diagram of ^f10w cytometer

- 47 -

(59)

第2項細胞の培養と検体の調製

10% FBS-ERDF培地で継代しているヒト型ハイブリドーマHB4C5細胞43)を2x 106細胞用意した。細胞は、フェノールレッド不合MEM培地(M E M _(一)) (日水製薬) で2回洗浄した後、 2 0μlの蛍光標識抗ヒトアイソタイプ抗体と

5 0μiの10%FBS-MEM(-)培地で懸濁した。反応3 0分後に、

それら細胞をMEM(-)で2度洗浄して、検体とした。これらの操作はすべて、 4 ocの低温下で行った。

この一連の操作は、細胞の自家蛍光発生を効率よく防ぎ、陽性と陰性の判断を容易にさせうる方法である。著者は、 IgM抗体産生ヒト型ハイブリドーマHB4C5細胞の細胞内抗体をF1 T C (フルオレセインイソチオシアネート〉

標識抗ヒトIgM抗体を用いて検出する際に、細胞を洗浄する培地と操作中の温度が自家蛍光発生におよぼす影響を検討した。

実験に使用したセルソーターは、 E _{P 1}C S 75 2 (コールター社) であるo Fig.4-2(a)に示すように、 MEM(一)で洗浄した場合、抗体を反応させていない細胞群は蛍光強度 2および3 の位置に全体の 90%以上の細胞が分布してい

- 48 -

(60)

た。一方、 FITC標識抗体で染色した細胞群は、蛍光強度 7と8を中心に広範囲に分布していた(Fig.4-2(b))。

これらのヒストクラムから蛍光強度4以下を陰性、 5以上を陽性であると判断した。次にフェノールレッドを含むERDF培地を用いて洗浄した場合、蛍光標識抗体で染色していない細胞群は、 Fig.4-2(c)に示すように蛍光強度 2 および3 の細胞が多いものの、陽性領域である蛍光強度5以上の細胞も多く認められ、自家蛍光を有する細胞が存在することが示唆された。また、 ERDFを用いてF¹ TC標識抗体で染色した場合(Fig.4-2(d))、 ( b )に比較して全体的に細胞の蛍光強度にばらつきが多く、この傾向には再現性があったo これらの結果から、培地中のフ

エノールレッドが自家蛍光発生になんらかの形で関与していることが示唆されたo さらに、検体調製を室温で行うと(Fig.4-2(e))、蛍光標識抗体で染色していないにもかかわらず、蛍光強度5以上の陽性領域に全体の42

Zの細胞が分布していた。 4 ocでの調製の場合は(a )に示

すように、陽性領域に細胞はほとんど分布していないことから、検体調製は4 ocで行うほうが適当であると判断

されたo なおこれらのデータは、いずれもFig.4-2(f)

-49 -

(61)

に示す、細胞形態の均一な集団のみに限定し取得した。

Fig.4-3'こ、フローサイトメトリーを行う際の検体調製法の略図を示した。図中の70%エタノール固定は実験

の目的によって削除してもよい。この章で使用した細胞

の調製は、すべて以上の実験結果に基づいて行われた。

- 50 -

(62)

1 2 3 .

S

^・ ⁷ ^{• t}101112131.15，.171・2・20

(b) 4 _"c， MEM(・}

Ab(+)

1α)Q 8∞

Sぬ 4∞

2∞

。

ω』@DEコZ

。。

(a) 40C， MEM(・) Ab(・)

1 2 3 . ‘ ・ 7 • .101112131415，.17..1・to

Fluorescence Intensltles

1α刃 8∞

600 4α3 2∞

。

ω』@DEコZ

ο 。

Intensltles

(d) 40C， EROF Ab(+) Fluorescence

tα幻 8∞

600 4∞

2珂

昌明』@aEコZ

。@

(c) 4・C， EROF Ab(・)

1α)() 8∞

広x) 4α3 2∞

ME@』εコZ

。@

1 2 3 • ^{5・ 7} • '101112 131"'5'・17"1'20

Fluorescence Intensltles 1 2 ^{3 4 5}C 7 • • 10官官1213141'1" 71'1.20 。

。

、.. ，， sz，，.1

90'-S Intensltles

R.T. MEM(・) Ab(・) (e)

FJ uorescence

1αm 8∞

6∞

4α3 2∞

舗と@DEコZ

。。

t 2 3 . ，・ 7 • • 101112 1:11.1‘'‘17，. lt ²⁰ Intenslties

。

Fluorescence LS

Fig.4・2

Effects of washing medium and temperature on the fluorescence intensities of HB4C5cells for detection of intracellular immunoglobulin

v

HB4

C

5cells were washed with

MEM(ー)

(a. b. e) or ERDF (c， d)

!?

edlum at40C or at room temperature (e).Then，the cells w re reacted with {b，d) or without (a，c，e)FITC labeled anti

humむ11gM antibody.A11 samples gave similar IS-90Iβcyto

gramsmd were obt伽ed from出e gated area shown in figure(f).

51

(63)

C 山 1寸γγC閃ωd叫叩e11出州ωl1s 州l1 s (1川S叫州(μ1 x ω l

Wash the cells

²

times with ME孔M(-) Fix the cells with ↓

^700/0

Ethanol

Wash the cells ↓

²

times with MEM(-) Resuspend in ↓

^100/0

FCS-MEM(-)

Rea 寸 ↓ 叫恥lab山ntib吋

Wash the cells 3 times with MEM(-) Resuspend註lME孔1(-) ↓

Fig.4・3

Scheme of sample preparation for f10w cytomet守

- 52 -

九州大学学術情報リポジトリ