medium containing 44nM aminoputerin for 6 days.
32
-第3節 細胞融合
樹立した新たな融合パー ト ナ ー細胞株HK-128を用い、
乳ガ ン、 甲状腺ガ ン、 胃カ♂ ン患者由来のリ ン パ節もしく
は末梢血由来のリ ン パ球と融合した。 方法 は、 第2章第
4節 に示したPEG法である。 Table 3-2に親細胞株 と して
HK-128 、 HMy2、 HO-323細胞を用いて融合した時の各々 の
融合効率を示した。
乳ガ ン患者由来のリ ン パ節リ ン パ球を用いて融合した
時、 HK-128細胞はその親株であるHMy2細胞を用いた場合
の約4 0倍と高い 効率を与えた。 さらに、 HO-323細胞の場
合と比較しても2倍程度と高い融合効率が認められた。
また、 胃ガ ン患者由来の末梢血リ ン パ球を用いた場合、
HK-128細胞の融合効率は、 リ ン パ節リ ン パ球を用いた場
合の半分程度まで低下するが、 それでもHO-323細胞を用
いた場合 の 2倍と良好な結果が得られ た。
33
-Table 3・2
Fusion efficiencies of various parent cells with lymphocytes isolated from lymph nodes or peripheral blood
*
Lyrnphocytes separated from peripheral blood of a stomach
cancer patient were used for the experiment.
第 4節 \ イブリ ド ー マの抗体産生
第1 項 ハイブリ ドー マの 産生する抗体の ク ラ ス
HK-128細胞を用いて融合後、 得られたハイブリ ドー マ の産生する抗体を酵素抗体法(ELISA) 3ó)で測定した。
固相に結合させる抗原は、 抗ヒ ト1 g G と1 g M 抗体(タゴ 社)を50mMの炭酸緩衝液(pH9.6) に溶解して用いた。 こ の反応を1時間以上行 っ た後、 抗体の非特異的反応を防
ぐために、 1先の濃度で牛血清ア ルブミ ン(B S A )を含むリ ン酸緩衝生理食塩水(P B S )で、 さらに1時間以上ブ ロ ッ キ ン グした。 つづいて、 ハイブリ ドー マの培養上清を1 時間反応させた後、 結合した抗体の ク ラ ス を決定するた めに、 2次抗体として ペル オ キ シ ダー ゼ標識抗ヒ ト1 g
Gもしくは1 g M (タゴ社)を1時間反応させた。 反応測定 のための発色基質液は、 O.3mg/mlの p-2， 2' -azino-bis-(3-ethylbenzothiazol ine-6-sulfonic acid)di-ammonium salt(ABTS) と0.003%の H 2 0 2を含むo . 1 Mのク
エ ン酸緩衝液( p H 4 . 0 )を用いた。 得られる 結果は、 4 0 5 nmの吸光度である。 そ こ で、 陽性の判定は、 検体の吸光
rhd nぺU
度から コ ン ト ロ ー ルの吸光度を差し引いた値が、 o . 1を 越え る場合と定義し た。
T a b 1 e 3 -3に HO-323細胞を用いた場合と比較して結果
を示した。 HK-128細胞を用いて得られ たハイブリ ド ー マ はほとんどはG 抗体を産生しており、 全体の1 0 %のハイ ブリ ドー マのみがIgM抗体とIgG抗体の両方を産生してい た。 しかしながら、 最終的に は この両方のク ラ ス の抗体 を産生するク ロ ー ンは、 1 g M産生能を消失してしま った。
一方、 HO-323細胞の場合はほとんどのハイブリ ドー マが IgM抗体を産生しており、 わずか2%のハイブリ ドー マの みが!gGとIgM両方を産生したにすぎなか った。 これらの ク ロ ー ン もやはり培養をつづける こ とで、 !gG産生能が 消失してしま った。
第2項 乳ガ ン特異的モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の取得とその 反応性の検討
HK-128細胞と乳ガ ン患者由来のリ ン パ節リ ン パ球を用 いて細胞融合を行 って、 ほぼ7000ク ロ ー ンのハイブリ ド ー マを取得した。 こ のうち ヒ ト乳ガ ン細胞株 MC F - 7に
- 36
-'"コ ーJ
Table 3・3
Classes of Igs produced by hybridoll1as derived froll1 HK-128 and HO-323 cells
Parent cells
HK-128 HO-323
Percent of hybridomas secreting Ig
IgG IgM
90 。
。 90
IgG+Igお1: None
10 0
2 8
特異的に 反応するIgG 抗体産生ハ イ フ リ ド ー マHBll-17
を取得し た。
Fig. 3 -2に、 E L 1 S A法を用 い て 3 種の ヒ ト カー ン 細 胞
(乳ガ ン細胞株MCF-7、 肺ガ ン細胞株PC-8、 胃ガ ン細胞
株MKN-45) と正常繊維芽細 胞 W 1 - 3 8に 対する HBll-17
抗体の反応性を示した。 この抗体の コ ン ト ロ ールとして
ヒ ト血清IgGを同濃度で用いた。 HB11-17抗体は、 若干反
応性は低いものの、 乳ガ ン細胞株MCF-7 のみに反応し、
肺ガ ン や胃ガ ン細胞株および正常細胞株に は反応しなか
っTこ。
38
-0.2
�
MCF-7戸〈KC寸、3〉4
0.1
0.1
。
。 0.5
PC-8
1.0 0 0.5
[
Antibody] (μg/ml)
Fig.3・2
1.0