抗 腫 瘍 活 性 関 研 究 株

金沢大 学十 全 医学 会 椎 誌 第1 0 0巻 第5号 9 8 9−^{1 0 0 3 く1 9 9 11}

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9

す る

金沢 大学 医学 部 歯 科^口腔 外 科 学 講 座く主任^二山 本 悦 秀 教 授フ

加

栄

く平 成3 年9 月2 7 日 受付う

98 9

Euba cte rtu m le ntu m rE^． le ntu mj A T C C 2 5 5 5 9 株^の菌 体 超 音 波 処理 上滑 液く^{S u}pe r n ata nt Of

s 。nic ated c ells，S up⁻S C l ^の担 癌^マ ウス に対す る抗 腫 瘍 活 性を，

エ ^ー ルリ ッ ヒ腹 水 癌 細 胞 旧hrlich

a s cite s c a r cino ma c eus，E A C 細 胞I， サルコ ^ー マ18 0細 胞くSa r c o m a 18 0 c e11s，S⁻¹8 0 細月割 ^およ び^{メ ス}A 細 胞 くMeth A fibr o s a r c o m a c eus，M eth A 細 榔 ^の固型癌を 用^い て検 討し た^． 抗 腫瘍 活性は， 各標 品 投

与群^マウス の対 照 群^マウス に対す る腰 瘍 重^量の比く腫瘍 増 殖 阻止率上 あ る^い は 平均 生 存日数^の比 くTノ CI で評 価し た^． 玉井一福田培 地4 8時 間培 養 菌液^から得ら れ た培 養上浦 液， およ び超音 波破 壊 菌 体^の遠心

上清 液 くSup⁻S Cl ， 遠心沈 溶そ れ ぞ れの抗腫 瘍 活性を． E A C 細 胞^およ び S⁻18 0 細 胞を使っ て検 討し た結 果，Sup⁻S C に腫瘍 形 成の抑 制が認め ら れ た^■ そこ で同上清^のエタノ ^ー ル画分_くethan 01 fr a ctio n，E F l ^に

っ い て 上記^の2 腰瘍お よ び同 系の M eth A 細 胞^で調^べ た と ころ． 同じ く 腫瘍 増 殖 阻止率で 3 9^．7M

46^．1％， TIC で¹3 6^．7 ^p1 39 ^．6％以 上^の抗 腫 瘍 活 性が認め ら れ た． 次に E F をpH 2^■0， PH4．0， pH 6^rOの

各pH で等電 点 沈 殿し た画 分^につしユて各 腫 瘍 細胞で抗 腫 瘍 活 性を調べた と^ころ^， pB 6 ^．0 画 分^に腰 痛増 殖 阻止率^で3 9^．0−^{5 8．5}％， TIC で1 3 2．2T^{13 9．4％以 上の抗腫瘍 活 性が得ら れ た一夏}に pH 6^■0画 分を凍 結乾 燥 し， 濃 度を⁴ 段 階 く3^．5． 7^．5， 1 5^．0． 2 2^．5m gl^{mll に}分け て 用量一反応 関 係を み る た め M ^eth A 細 胞 で 比較し た ところ， 7．5， 15^．Om gノml 濃 度 投与 群^{に おい} て腫 瘍 形 成^の抑 制が み ら れ た^一 そ して， よ り高 濃 度^の22 ^．5m gl ml 投 与 群では^マ ウス の架死． ま た低 濃 度^の 3．5m glml で は腫瘍^の抑 制が み ら れ な か^っ

たことから． 抗 腫 瘍 活 性^に対す る 至適 量が存 在す る^こと が 示 さ れ た^． ま た本 標 品は1 0 0⁰C の加 熱^によ り 不 活性 化さ れ な^{い こ}と か ら^， そ^の本 体は蛋 白で は ない こと が推 測さ れ た^． 本 標 品のマ ウスへの投 与 方 法 を筋 肉内． 腫 瘍 内^およ び腹 腔 内^の3経 路^に分け Meth A 細 胞を 用^い検 討し た と^ころ^， 投 与 経 路^によ る 明 ら^かな抗 脛 癌 活性^の差異 は^みら れ な か ったく腰 瘍 増 殖 阻止率，3 0^．3 ⁻3 5^．8％ト ま たpH 6^．0画分標品 を投 与し た^マ ウス では， 腫 瘍 部 位^に L 3 T4 陽 性丁細 胞の著明 な浸 潤が病理組 織 学 的^に認め ら れ た． 以 上の結 果 よ り， E．le niu m A T C C 2 5 5⁵9 株の Sup⁻S C は抗腫 瘍活 性を有して おり， 本 活性^には免 疫 系が関与し て^いる^こと が 示唆さ れ た^．

K ey ^{w o r}d an a e r Obe， a nti⁻tu m O r a Ctivi_{t y}， Euba cte riu m le ntu m

抗腫瘍物 質の研 究は多 岐にわ た^って いる^． そ れ ら は 合成 化合物と 天然 物とに大 別でき， 種々 の物 質^に及ん で^いる が， 天然物の中で最も古く か ら その抗 腫 瘍性^に 着目さ れ た ものが微 生 物^であ る^． 細 菌が作る毒 性物 質 を 悪性腫瘍^に対抗す る薬と し^て利用 す る^こと は， 人間

A b b_{r e v}iatio n s 二A B C ， a Vid in b iotin _pe r o xida s e

Cl． botuli_{n u m}

， C lo strid iu m botulin u m E A C，

の健康を目 指す研 究を続け ている もの にとっ ての ひと

つの課 題で あ^っ た^．

こ の微生物^の抗腫瘍 作用 ^{につ い て}は， 1 8 6 8 年

Bu s ch^りの丹 毒^に躍 患し た肉腫 患 者が 症状^の改 善を^み

た と す る報 告^に端を発し， その後189 8年^にColey^{2 ，}は丹

C O m ple xi A F T F_， ag^{a r−}fr e e T am ai⁻Fukuda三 E hrlich a s cite s c a r cin o m aニ E F ， eth a n ol f_{r a ct}io n J E −le ntu m ， E uba cteriu m le ntu m ニ I M ， intr a m u s c ula r ニ I P， intr ap^erito n eal _芸 I T，

9 9 0

毒^から分離し た溶血性^{レ ン}サ球 菌と霊 菌と の混 合 培 養 濾 液で あ る有 名な Coley

，

sto xin を考 案し，多 数^の有 効

例を報 告し た． そ れ以 降， 種^{々 の}微生物^の生 菌， 死 菌 あるいは菌 体 成 分^の抗 腫 瘍 活 性が検 討さ れ， 国 内外を 問わず 多数の研 究 報 告が な さ れ て き た^{3 卜 7 j}． そ して細 菌の菌 体 あるいは その構 成 成 分^のあ る ものは， 生体に とって抗原と な るばか り で な く生物 活性^を有し， 生体 の免^{疫 応 答を賦 活 化す ること が知}ら れ て く る よ うに な^って き た^{4 1．} し^か し， そ の ほ と ん ど は好 気 性 菌^に関 す る研 究であり， 嫌 気 性 菌^に よ る抗腫瘍 活 性^の研 究 は， C わ5わ^ー寝由雄， 嫌気 性 C叩 叩商 都盆め仰 の ^一 部^に 散 見さ れ る^にすぎな^{い8 ト間}

近 年， 著 者の研 究 室^の玉井ら は， 口腹 癌の感 染 病 巣 よ り高 率^に分 離さ れ る嫌 気 性 グラム陰 性 菌 F描 0古庄 C⁻ fgわ祝 別 に着 目し， そ の抗 腫 瘍 活 性の検 討を行^い， 培 養 上清液 中^に抗 腰 瘍 活 性 物 質を見^い出し た． 更^にその本 体は細 胞 壁 構 成 成 分である リ ボ多 糖 体 く¹ⁱpopol_ys a c c⁻

hari de，L P SJ で あ る^こと を明ら かにし た^{1 1 ト 1 31．} 上述の 玉井ら の研 究^に端を発し^， 著 者の研 究室で は各種の嫌 気 性 菌に つ いて抗 腫 瘍 活 性の検 討が な さ れt グ ラ^ム陰 性 薗の 沌ゴ7go 彫J 血^川， グ ラ^ム陽 性 菌の P 勿^{ねC O C C 鋸51 引，} アナ^■坤 ね^乃加 cfg rブ祝 刑^{1 61}が抗腫瘍 活 性を有す ること が 明 ら か^にさ れ た^，

著 者は本 研 究で， 口腔 内常 在 菌^{の 一}種で， 嫌 気 性グ ラ ム陽 性 梓 菌で ある 成 仏鋸 ね祓仰 乙 肋助川 Z 作^． Je 邦吉祝 研ノ^{用に つ い}て の抗腫 瘍 活 性の検 討を行っ た^．

材 料お よ び方 法 王． 使用菌 株

実験^には E^．le ntu m A T C C 2 5 5 5 9 株 く金 沢 大 学 医療 技術 短期 大 学 郡 山岸 高 由 教 授よ り分与1 を使用 し た^，

I工． 使用培 地

前 培 養^には， 玉井一福田培 地^{1 81}くTa mai⁻Fukuda m ediu m， T F 培 地 H ^ニ ッスイ， 東 京1 ^およ び T F 血液 寒天平 板 培地 く1 0％血液 ^． 2 ％ 寒 天 加T F 培 地1 を使 用 し た． ま た本 培 養^には， 寒天 を除^いた T F 培 地 く^aga r⁻fr e e T F 培地， A F T F 培 地I を 用^いた^．

m ． 且 ム釧 細別 標晶^の調 整 1 ． 培 養 法^およ び培 養液^の処理法

E^．le ntu m A T C C 2 5 5 5 9 株培 養 薗 液0^．5ml を T F 培 地1 5ml に植 菌し3 7⁰C で培 養し た． 4 8時 間 培 養 後，

T F 血 液 寒 天 平 板 培 地^に1 白 金 耳を 塗抹し， B B L ガ^ス

藤

パ_ックくBe cto n D ick ins o n，Ccx Ikey^{s v}ille，U S Aンを恥 て 3 7⁰C ^．48時 間 嫌 気 培 養 後， 形 成さ れ て く る集落を T F 培 地1 5ml に釣 菌し た． 3 7⁰C ^．4 8時 間 培 養後5ml を T F 培 地1 0 0ml に移 植し た^． 3 7⁰C ^．2 4時間培養後，

5 0ml を A F T F 培 地1，00 0mlに移 植し4 8時間本 培養_を 行^っ た^． 本 培 養後， 無 菌 的^に冷 却 遠 心 器 R S⁻2 0 1工1くト ミ ^ー 精工， 東 副 を 用^いて 6，5 0 0X g ，2 0分 間遠 心し，

培 養上清 液 く^{s u}pe rn ata nt Ofc ultu r e，Sup⁻Clと沈壇 儒 体 い^こ分 離し た^． さ ら^に Sup⁻C は異物 濾 過フ ィ ルタ^ー

マイ^レクス H A く孔 径^{こ0．4 5}J^{L m} l くM i11i_po r e Co rpo ra^． tio n，Bed fo rd，U S Al を 用^{い て}濾 過 滅 菌し た後，実験^に

供し た^．

2 ^． 超 音 波 処理 菌 体上 清 液 く^{S u}pe rn atant of

S O nic ated c ells， Sup⁻S Cl と超 音 波 処理 菌 体沈 く^{S e}d im e nt of s o nic ated c eus，Sed⁻S Cl の調整

本 培 養 後， 遠 心し て得ら れ た菌 体に滅 菌 生理食塩水 を加え遠 心 洗 浄 く⁶，5 0 0_{x g}， 2 0分 間1 を行っ た^． 洗浄菌 体3^．2gく湿 重 卦 ^に滅 菌 生理食 塩 水5 0ml を加え，超音 波 破 砕 器 M del U R−^{2 0 Pく2 0 氾切 くト ミー精工1 を 用い}

て 2 0 0 W ， 3 0分 間 超 音 波 処理 を行^っ た^． 超 音波 処理液

に つ い て ， 先 ず 末 破 砕^の 細 胞 片を除 去す る た め 8 0 0 X g， 2 0分 間遠 心し た^． 次に上清 液を遠心分離機 5 0⁻A く佐 久 間製 作 所， 東 京I ^{にて 1 0}，0 0 0X g，20 分間遠 心し， 得ら れ た 上清 液を Sup⁻S C ， 沈 漆を Sed^．S C と し て滅 菌 生理食 塩 水^に懸 濁し実 験^に供し た^．

3 ^． Sup⁻S C のエ タノ ^ー ル画 分 く^etha n ol fr a ctio n，

E円 ^の調 整

Sup⁻S C に純^エタノ ^ー ルを浪 度が 6 0％と な る よ うに

加え， 充 分 捷 拝 後^{4 0}C下で ^一夜 静 置し た^． 静置 後， 無 菌 的^に 1 0，0 0 0 X g， 2 0分 間 遠 心し， 得ら れ た沈漆を E F と し て滅 菌 生理食 塩 水に懸 濁し実 験^に供し た^．

4 ． 等電 点 沈殿 法によ る分 画

E F 2．2_gく湿 重量1 ^{に 1}11 5 M 燐 酸 緩 衝 液tpH 7．Ol くpho sphate buffe r，P BI 5 0ml を加え， 充 分捜 拝し溶解 し た後1 0 N H C l を加え て溶 液^の pH を6^．0^に調整し た^{． 40}C下で ^一 夜 静 置し た後1 0，0 0 0x g， 2 0分間冷却 遠 心を行^い， 得ら れ た沈 濃 く湿 重量1^．2gl をp王16^．0画 分と し て P B に懸 濁し て実 験に供し た^． 分 離し た遠心 上清 液^に， 更に 1 0 N H C l を加え pH 4 ^．0 と な る よ う^に 調 整し た^． 擾 拝後^{4 0}C^{に 一} 夜静 置し， 再 度1 0，00 0 xg^． 2 0分 間 遠心 し， 得ら れ た沈 溶 く湿重 量0^．7gl をpH 4．0 画 分と し て P B ^に懸濁し て実 験^に供し た^． 同様^に

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ntr atu m o ral_i L P S， 1i_pop^ol_ys a c chari deニ M eth A ， M eth A fibr o s ar C O m a三 P B， pho sphate

b uffe rニS⁻1 8 0， S a r c o m a 1 8 0 _i S^ed⁻S C， S ed in1 e nt Of s o nic ated c ellsニSup⁻C ， S up^{e rn a}ta nt Of

c ultu r ei Sup⁻S C， S up^{e m a}tan t Of s o nic ated c ellsi T F_， T a m ai⁻Fuk uda