乳牛ふん尿の嫌気性自己分解によるメタン発酵スタートアップ方法およびその過程における微生物群集構造の変化

【 論

文 】

乳牛ふん尿の嫌気性自己分解によるメタン発酵スタートアップ方法

およびその過程における微生物群集構造の変化

安 田 大 介 * ・ 小 林 拓 朗 * ・ 李

玉 友 *

原 田 秀 樹 * ・ 岡 庭 良 安 **

【要 旨】 Continuous Stirred Tank Reactor (CSTR) 型反応槽を用いて，乳牛ふん尿の自己分解に よるメタン発酵のスタートアップ過程を検討した。有機酸蓄積と pH 低下を防ぐため，ふん尿を TS 1.5% に希釈して初期には 37 日間回分培養を行った。運転開始 18 日目に顕著なガス生成がみられ， それまで増加していた Volatile Fatty Acid (VFA) は減少に転じた。VFA 濃度が十分低下した 37 日以 降，ふん尿を連続的に投入しはじめ，HRT を 100 日，50 日と段階的に短縮することで，約 70 日間で 目標の HRT30 日に到達した。古細菌群集のクローン解析では，運転開始時には検出されなかった Methanosarcina 属古細菌が徐々に増殖し，自己分解が進行した期間において，ライブラリの 83.3% を占めるようになった。Real-time PCR の解析では，回分馴養中におけるガス生成速度の増大が Methanosarcina 属古細菌の増殖と相関していることを示唆した。本研究の方法で，乳牛ふん尿の自己 分解による良好なスタートアップが可能であり，回分培養期間のメタン生成速度の増大と VFA 除去に は Methanosarcina 属古細菌の増殖が寄与していることが示唆された。 キーワード：メタン発酵，スタートアップ，乳牛ふん尿，種汚泥馴致，微生物群集構造

1．は じ め に

循環型社会形成を推進するため，家畜排せつ物は農村 地域における主要な廃棄物系バイオマス資源の一つとし てその利活用が期待されている1)_{。メタン発酵技術は有} 機性廃棄物からバイオエネルギーを回収できる技術とし て注目を集め，その応用拡大が推進されている2)_。メタ ン発酵のスタートアップ方法は，メタン発酵消化汚泥の ような外部由来の植種源を使用する方法と，基質に内在 する微生物群を内来植種源として利用する方法の 2 通り がある。しかし，農村地域において消化汚泥の取得・運 搬コストは大きな負担であり，地域性から取得が困難な ケースも考えられる。したがって，外来植種源を自己調 達する後者のスタートアップ方法が有効な手段となる。 家畜排せつ物の中でも乳牛ふん尿にはメタン生成古細菌 が存在しており，農村地域において自己調達できかつ植 種源として利用できると考えられる。そこで，家畜排せ つ物からメタン発酵種汚泥の馴致および安定的なスター トアップを行うための技術的手法の確立が必要となる。 しかしながら，こうした手法に関して科学的解析が行わ れておらず，学術的な現象理解が不足している。 メタン発酵の種汚泥馴致・スタートアップ過程は，微 生物学的には植種微生物群集からの嫌気性メタン発酵生 態系の構築過程であるため，馴致過程の運転性能は微生 物群集の変化と関連していることが予想される。メタン 発酵のスタートアップ過程における微生物群集の変化に 注目した研究はいくつか報告されている3-6)_{。こうした} 研究において，植種源の微生物群集構造の運転性能に対 する影響が示唆されている。一例として，植種源内の古 細菌が少ない場合，有機物を低分子化して有機酸を生成 する酸生成細菌と比較して，有機酸を分解してメタンを 原稿受付 2008. 1. 21 原稿受理 2008. 6. 24 * 東北大学大学院工学研究科 土木工学専攻 ** (社)地域資源循環技術センター 連絡先：〒 980-8579 宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉 6-6-06 東北大学大学院工学研究科 土木工学専攻 李 玉友 E-mail : [email protected]

生成するメタン生成古細菌は増殖速度が遅く，一時的に アンバランスな微生物系となるため，メタン発酵の不安 定化を招く危険性があるといわれている。本研究では乳 牛ふん尿から嫌気自己分解によってメタン発酵汚泥を培 養し，乳牛ふん尿を基質とするメタン発酵の連続運転の スタートアップを行い，その過程における微生物群集の 変遷を，分子生物学的手法を用いてモニタリングするこ とで，運転性能との関係を考察した。

2．実 験 方 法

2.1 実験装置 実験装置には図 1 に示すように基質タンクと，有効容 量 5 L (全容量 8 L) の機械攪拌方式の Continuous Stir-red Tank Reactor (CSTR) 型発酵槽を用い，中温発酵 条件 (35℃) で実験を行った。温度制御は，加温装置・ 冷却装置から発酵槽に付属されたウォータージャケット への温水・冷水循環により，発酵槽は 35± 1 ℃，基質 タンクは 4 ± 1 ℃にそれぞれ設定した。基質投入および 消化廃液の引抜きに関しては，ローラーポンプチューブ を用い，タイマー制御により行うことで HRT に応じた 量を投入し，発酵槽内容量を一定にした。生成したバイ オガスは，湿式ガスメーターにより計測を行った。 2.2 実験材料および条件 乳牛ふん尿は北海道 M 牧場の貯蔵タンクから取得し た。敷料などの長繊維粗大物を除去するために，前処理 として 5 mm メッシュふるいを通したものを使用した。 取得した乳牛ふん尿は，貯蔵タンクでの保存期間中に酸 生成反応の進行から有機酸が蓄積していた。表 1 に示す ように，前処理をしたふん尿は TS 濃度が 6.6% であり， Volatile Fatty Acid (VFA) 濃 度 は 酢 酸 換 算 で 1,866

mg/L と高濃度であった。メタン発酵における VFA 阻 害は非解離有機酸濃度に依存し，低 pH かつ高い総有機 酸濃度の下で非解離有機酸濃度が増加し，メタン生成古 細菌に阻害影響が生じるとされている。バイアル瓶を用 いたバッチ実験において，TS6.6% と 1.5% の 2 系列で 培養を行ったところ，メタン生成が開始するまでに前者 では VFA が最高 20,000 mg-HAc/L まで蓄積したのに 対し，後者では最高 2,500 mg-HAc/L の蓄積に留まっ た。このことから TS 調整による VFA 蓄積抑制効果を 確認した。そこで VFA による阻害を起こさないように， 乳牛ふん尿を水道水で TS 濃度約 1.5% に希釈し，VFA 濃度を 620 mg/L まで低下させたものを内来植種源とし て用いた。これを 5 L 発酵槽へ投入し，運転を開始した。 また，VFA の生成・蓄積を抑制するため，ガスの生成 が見られるまで基質の投入は行わず，37 日間は回分的 に培養した。それ以降は，前処理した乳牛ふん尿を基質 として投入し，連続培養へと移行した。ガスの生成量を 指標として HRT を 100 日，50 日，30 日と段階的に短 縮し，徐々に有機物負荷を上昇させた。なお，全運転期 間を通して pH 等の調整は行わず，運転は 160 日間行っ た。 2.3 水質分析方法 ガス組成 (N2, CH4, CO2) は TCD ガスクロマトグラ フ (SHIMADZU, GC-8A) を用いて測定した。pH は， GST-5421C 電 極 を 装 備 し た pH メ ー タ ー (TOA, M-30V) を用いて測定した。アルカリ度，TS, VS の分 析 は 下 水 道 試 験 法7)_に，COD Crは 米 国 の Standard Method8)_{に準拠して測定した。VFA 濃度は，FID ガス} クロマトグラフ (Agilent6890 型) 法，アンモニア性窒

素濃度 (NH4+-N) は，キャピラリー電気泳動分析器

(Photal, CAPI-3200, OHTSUKA) を用いて測定を行っ た。 2.4 クローン解析の方法 運転 0 日目，30 日目，150 日目におけるメタン発酵槽 図 1 実験装置概要図 Total-COD (g/L) Soluble-COD (g/L) 620 1,866 VFA (mgHAc/L) 309 767 NH4+-N (mg/L) 7.7 9.3 分析項目 取得ふん尿 植種源 C/N 比 表 1 取得ふん尿および植種源の性状 7.09 pH 1.47 1.03 6.60 5.00 TS (%) VS (%) 15.2 7.3 84.6 24.3 7.20

の 消 化 汚 泥 か ら，Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit (MO-BIO) に よ り DNA を 抽 出 し た。古 細 菌 の 16S rDNA を対象とするプライマーペアである A109F9)_と A1059R10)_{を用いて，TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice} により PCR を行った。PCR の条件は，94℃，5 分 −(94 ℃， 30 秒 −50℃， 40 秒 −72℃， 2 分)×30 cycles−72 ℃，7 分とした。PCR 産物は S-300 (GE ヘルスケア) を用いて精製し，TOPO TA Cloning Kit (invitrogen) に よりクローン化した。形成されたコロニーから無作 為 に 釣 菌 し，16S rDNA 断 片 を 回 収 し て CEQ8000 (BECKMAN COULTER) を用いて塩基配列を決定し た。 2.5 Real-time PCR による解析方法 分析に用いた DNA は運転中の発酵槽において，運転 0，5，11，17，20，24，27，30，150 日目に採取した汚 泥から，それぞれ Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit (MO-BIO) を用いて抽出した。 Real-time PCR は Light Cycler (Roche) により，Fast Start DNA Master SYBR GREEN I Kit (Roche) を用いて行った。プライマーは， い ず れ も 古 細 菌 の 16S rRNA 遺 伝 子 を 標 的 と し て， 古細菌 は ARC787F10)_{& ARC1059R，Methanosaetaceae} は Mst702F & Mst862R， Methanosarcina 属 は Msar-450f11)_&Msar-589r11)_{，Methanomicrobiales は MMB282F} & MMB832R，Methanobacteriales は MBT857F & MBT1196R，の プ ラ イ マ ー ペ ア を そ れ ぞ れ 用 い た。 PCR 条件は，94℃，10 分 −(94℃，5 秒 − 表に示し たア ニ ー リ ン グ 温 度，10 秒 −72℃，8〜20 秒) ×45 cycle と し た。検 量 線 作 成 の た め の 標 準 DNA と し て，古細菌と Methanosarcina は，以前の研究で得られ た Methanosarcina thermophila の ク ロ ー ン を M13f & M13r のプライマーで増幅したものを精製して使用 した。Methanosaeta 属 古 細 菌 は 以 前 の 研 究 で 得 ら れ た Methanosaeta concilli の ク ロ ー ン を A109F & ARC1059R のプライマーで PCR したものを精製して用 いた。Methanomicrobiales は牛ふん由来の DNA から MBT857F & MBT1196R のプライマーで増幅した PCR 産物をクローニングし，得られた Methanobrevibacter 属のクローンを M13f & M13r のプライマーで PCR した ものを精製して用いた。Real-time PCR を行った後で， 増幅した PCR 産物を電気泳動し，目的のサイズで増幅 していないサンプルは検出限界以下の濃度とした。

3．実験結果と考察

3.1 スタートアップ期間の経日変化 図 2 にメタン発酵槽連続運転の結果を示す。バッチ運 転の 17 日目までバイオガスの発生はほとんど見られな かった。18 日目から急激にガス生成が増大し，バイオ ガスのメタン含有率は約 75% となった。運転開始 22， 23 日目にガス生成速度が 0.3 L/L.d となり，ピークを示 した。 VFA は，運 転 開 始 か ら 徐々 に 増 加 し，14 日 目 に 2,300 mg-HAc/L まで蓄積した。しかし，活発なバイオ ガスの生成が観察された 18 日目以降に急激に減少に 転じ，23 日目には酢酸がほぼ消費された。バイオガス 生成のピーク後は 37 日目までガス生成は 0.13〜0.15 L/L.d で推移した。この結果，植種源の TS を 1.5% に 希釈したことにより，VFA 濃度は阻害を受けるとされ 図 2 スタートアップ過程における発酵廃液性状の経日 変化

る 3,000 mg/L 以上まで蓄積することなく良好にメタン 生成反応が開始されたことがわかった。30 日目にはプ ロピオン酸以外はほとんど残留せず，37 日目にはプロ ピオン酸も分解され，ほとんど VFA の残留が見られな くなった。 VFA の蓄積が見られなくなった 37 日目以降， HRT 100 日で基質の投入を開始し，連続培養へと移行した。 HRT100，50，30 日とそれぞれバイオガス生成は 0.20， 0.42，0.72 L/L.d で安定して推移し，HRT を短縮した 直後から比較的迅速に有機物負荷に応じたバイオガスの 生成が見られた。また，メタン含有率は 70〜75% で あった。VFA 濃度は蓄積が進行することなく安定して 分解され，150〜250 mg-HAc/L で推移し，主成分は酢 酸であった。pH は，メタンガス生成が開始される 18 日目までは 7.0〜7.2 で推移し，回分培養期間の VFA の 蓄積時においても pH の低下は見られなかった。18 日 目以降は 7.9 程度まで上昇し，HRT の短縮後も 7.8〜7.9 の間を維持し続けた。TS 濃度，アンモニア性窒素濃度， アルカリ度はそれぞれ，有機物負荷の増加に伴って上昇 し，HRT30 日の運転開始 100 日目以降は安定して推移 した。 3.2 HRT30 日の運転結果 図 2 より，メタン発酵において運転管理指標となる TS，アルカリ度，アンモニア性窒素の推移から，値が 安定した 100 日目以降を定常状態と判断した。この期間 における各分析項目の平均値を表 2 に示す。また本研究 と同様の装置を用い，高濃度搾乳牛ふん尿を基質として， 櫻井ら14)_{が消化汚泥を外来植種源としてスタートアップ} した連続運転定常状態の分析結果も併せて示した。外来 植種源ありと外来植種源なし，それぞれのスタートアッ プを経た連続運転結果は，分解率，VFA 濃度，バイオ ガス生成収率といった主要な分析項目において顕著な違 いはなかった。また，良好に運転されるメタン発酵の pH は 6.5〜8.2 の範囲にあるとされているが12)_，乳牛ふ ん尿からスタートアップさせた消化汚泥は最適 pH の範 囲内にあり，pH 調整剤等の添加なしに良好に運転を行 うことができた。運転 90 日目以降においては，基質を 新たに採取したものに変更したため，前処理等の過程で 有機物負荷が TS6 % と若干低下し，ガス生成速度に違 いが出ている。一般的に，アンモニア性窒素濃度が 1,500〜3,000 mg-N/L に達すると阻害が生じる可能性が 報告されているが13)_{，本研究では，VFA の高濃度残存} などの影響は見られなかった。 3.3 クローン解析による古細菌群集の構成変化 メタン発酵槽運転結果から，スタートアップ過程にお いて，17 日目以降急激にメタン生成が活発化し，VFA が分解されるようになると，安定したメタン発酵が継続 して行われるようになることがわかった。そのため，牛 ふん内部に存在するメタン生成古細菌群集の馴致が，安 定したスタートアップにとって重要な因子であると考え られる。本研究では，自己分解過程の特殊な運転状況を， 古細菌群集構造の変化と関連付けて理解するため，ス タートアップ過程における古細菌群集構造の変化をモニ タリングした。 クローン解析は，古細菌群集の構成が変化するプロセ スを把握する目的で行った。分析したサンプルは，運転 0 日目 (牛ふん)，回分培養中にメタン生成がピークを 過ぎて安定した運転 30 日目，連続運転の定常状態期間 である運転 150 日目の 3 つである。表 3 に 3 つの古細菌 クローンライブラリの比較を示す。全体的な傾向として は，牛ふん中には水素資化性メタン生成古細菌である Methanobrevibacter 属の古細菌が 80.7% を占め優勢で あったのに対して，運転 30 日目には酢酸を利用する Methanosarcina 属古細菌が 83.8% を占める主要な菌と なった。運転 150 日目には Methanosarcina 属古細菌は 36.3% であり依然として主要な構成を成しているものの， 水素資化性である Methanoculleus 属の古細菌が 56.3% を占め最も優勢となった。運転 37 日目までは回分培養 であることを考えると，これらの結果は，自己分解過程 において元から優勢であった古細菌は増殖せず，優勢で はなかった Methanosarcina 属等の古細菌が著しく増殖 して優占化したことを示している。 酢 酸 を 巡 っ て Methanosarcina 属 と 競 合 関 係 に あ る Methanosaeta 属 古 細 菌 は，0 日 目 に お い て 7 % 検 出され て い る が，そ れ 以 降 は 検 出 さ れ な か っ た。 Methanosarcina 属 古 細 菌 は 同 じ 酢 酸 資 化 性 の Methanosaeta 属 古 細 菌 と 比 較 し て 酢 酸 が 高 濃 度 の 環境では競合有利であるといわれている。そのため， VS 分解率 (%) COD 分解率 (%) 0.207 0.259 ガス生成収率 (L/g-投入 COD) 63.7 35.2 68.0 31.0 CH4 CO2 外来植種有 外来植種無 ガス組成 (%) 項目 表 2 定常状態における各分析項目の比較 30 2.7 HRT (日) VS 容積負荷 (kg/m3_{. d)} 8.24 12,300 7.87 11,000 pH アルカリ度 (mg CaCO3/L) 253 2,290 180 1,700 VFA (mg-HAc/L) NH4+-N (mg-N/L) 46 45 46 47 30 1.7

酢酸 が 蓄 積 し た 自 己 分 解 過 程 の 発 酵 槽 の 環 境 が Methanosarcina 属古細菌にとって有利であったため， 優先的に増殖したと考えられる。牛ふん内で優勢で あ った Methanobrevibacter 属 古 細 菌 は，ル ー メ ン 生 態系において主要な古細菌であることが多く報告され ている15-17)_{。しかし，固形性有機物のメタン発酵生態} 系において優占化しているという報告はほとんどな い。したがって，Methanobrevibacter 属古細菌はメタ ン発酵の環境には適さず，増殖しなかったと考えられる。 Methanobrevibacter 属古細菌はセルロース分解細菌と 共生関係を作ることが報告されているが18,19)_，本研究 に用いた牛ふんは，混入しているわらを取り除いてお り，基質の性状からもわかるようにメタン発酵の反応 はセ ル ロ ー ス の 分 解 が 中 心 で は な い。そ の た め， Methanobrevibacter 属古細菌とセルロース分解細菌によ る分解経路は重要ではなくなったと考えられる。以上の ことから，牛ふんの自己分解過程においては，元々牛ふ ん内で優勢であった古細菌は増殖せず，元々は優勢では なかった古細菌がメタン発酵の環境に適応して顕著に増 殖したことが示唆された。 連続運転の定常状態になると，それまでは検出され なかった水素資化性の Methanoculleus 属が優勢とな る。表 4 には外来植種源なしでスタートアップを行った 本研究と，外来植種源ありでスタートアップを行い，本 研究と同じ乳牛ふん尿を基質とする中温発酵バイオガ スプラントにおける連続運転定常状態の古細菌クローン ライブラリの比較結果を示す。Methanosarcina 属と Methanoculleus 属の古細菌が主要な構成を成している 点で両者は一致している。故に，外来植種源なしのス タートアップを行った場合でも，同じ基質での連続運転 時において形成される古細菌群集は，外来植種源ありの 場合と類似の構造であるといえる。 3.4 Real-time PCR 解析による古細菌群集の popula-tion dynamics 上述のように自己分解現象で特徴的であるのは，培 養初期にメタンがほとんど生成せず，17 日目以降に 急激なメタン生成が見られたことである。また，クロー ン 解 析 の 結 果 か ら，元々 牛 ふ ん 内 で 優 勢 で あ っ た Methanobrevibacter をはじめとした古細菌は増殖せず， 元々優勢ではなかった Methanosarcina 属古細菌が顕 著に増殖していることが示された。これらの結果から， 培養初期にメタンが生成しなかったのは，元々牛ふん 内に多く存在したメタン生成古細菌が機能しなかった ためであり，牛ふんからクローン解析で検出できない ほど低濃度で存在していた Methanosarcina が増殖す るのに時間を要するためであると推察した。そこで， Methanosarcina 属古細菌増殖の運転状況変化への寄与 を理解するため，Real-time PCR による解析を，自己分 解過程における各種古細菌の population の変化と発酵 槽運転状況の変化との関連付けを目的として行った。 図 3 には古細菌の 16S rRNA 遺伝子 (rDNA) を標的 とする各種プライマーにより Real-time PCR を行った結 果を示す。まず，古細菌の rDNA 濃度は 0 日目から 30 日目までの間に 2 オーダ程度増加し，150 日目になって も同程度の濃度であった。したがって，30 日間の培養 により，古細菌が連続運転定常状態と同程度の濃度に達 したといえる。クローン解析の結果 0 日目において優勢 で あ っ た Methanobrevibacter は Methanobacteriales に 含まれる。Methanobacteriales の rDNA は 0 日目におい 12.3 未分類 55 68 57 検出頻度 (%)* クローン数合計 * 左欄の属の古細菌種に対し相同性 95% 以上のクローンで分類 表 3 古細菌 16S rRNA 遺伝子のクローンライブラリの比較 ― 83.8 Methanosaeta Methanosarcina Methanosarcinales ― 56.3 11.8 ― ― ― Methanocorpusculum Methanoculleus Methanomicrobiales ― ― 80.7 Methanobrevibacter Methanobacteriales 7.3 4.5 7.0 ― 150 日 0 日 サンプリング日 ― 36.3 30 日 外来植種有 * 外来植種無 65.1 2.3 32.6 ― 36.3 ― 56.3 7.3 Methanosarcina Methanomicrococcus Methanoculleus Unclassified 43 55 クローン数合計 検出頻度 (%) * 北海道 M 牧場バイオガスプラントからサンプリング 表 4 外来植種源なしとありの連続運転発酵槽における クローンライブラリの比較

ては全古細菌の約 9 割の濃度であったが，その後も一貫 して顕著な変化は観察されなかった。Methanosaeta も ま た，運 転 日 数 経 過 に よ る 顕 著 な 変 化 が な か っ た。 Methanosarcina については，運転 0 日目と 5 日目にお いては規定の PCR サイクル数 (45 サイクル) で増幅が 見られなかったため検出限界以下と判断した。11 日目 から検出できるようになり，14 日目まで 106_copies/μg のオーダで推移した。メタン生成が増大した 17 日目以 降には 107_{copies/μg のオーダに達し，それ以降増加を} 続け，30 日目には 1.2×108_{copies/μg に達した。この結} 果から，Methanosarcina 属古細菌は運転日数経過と ともに増殖を続けていることがわかった。図 4 には古 細菌の rDNA に占める Methanosarcina の rDNA の割 合 (population) と メ タ ン 生 成 速 度 と の 関 係 を 示 す。 Methanosarcina の population はメタン生成速度の増加 に伴って増大している。図 5 には Methanosarcina の population と メ タ ン 生 成 速 度 と の 相 関 を 示 し た。R2 =0.91 であり，Methanosarcina の population とメタン 生成速度の間には正の相関があることを示唆している。 これらの結果は，自己分解の特徴であるガス生成増大 までのラグ時間は，Methanosarcina が増殖して古細菌 群集の中で主要な構成員になるまでの過程であり， Methanosarcina が群集内で約 30% 以上を占める構造と なってからは安定したメタン発酵が行われていることを 示している。 表 5 にはメタン発酵スタートアップ過程における古細 菌群集の population dynamics を検討している他の論文 と，本研究との比較結果を示す。有機物負荷に注目する と，本研究の HRT30 日では 0.83 gVS/L.d であることか ら，ここにあげた各プロセスは，いずれも高負荷でのス タートアップを検討したものである。外来植種源に注目 すると，No. 3, 5, 6 は外来植種なしでのスタートアップ を行っている。スタートアップ過程の運転状況は，No. 1, 2, 3, 5, 6 では本研究と同じように培養初期に VFA が 蓄積し，ある時点で急激な減少に転じるといったパター ンである。No. 4 のみは VFA が蓄積することなく，安 定して推移した。外来植種源の投入量は No. 4 が 67% と最も高く，No. 1, 2 はそれぞれ 17%, 19% で同等だっ た。これらのことから，VFA 蓄積の起こらなかった No. 4 は外来植種源の投入量が多いため，メタン発酵で 活躍するメタン生成古細菌の初期絶対量が大きかったと 考えられる。

古細菌群集の population dynamics は，VFA 蓄積の 起こった No. 1, 2, 3, 4, 5, 6 プロセスで同様の現象が観 察されている。一度 VFA が蓄積した後，急激に減少す る時期に Methanosarcina 属古細菌の population の増大 が共通して起こっている。一方，VFA 蓄積の起こらな 図 3 回分培養期間における古細菌 16S rRNA 遺伝子の population dynamics 図 4 回分培養期間における Methanosarcina 属古細菌 の population とメタン生成速度との関係 図 5 回分培養期間における Methanosarcina 属古細菌 の population とメタン生成速度との相関性

かった No. 4 では Methanosarcina の population 増大は 見られず，Methanosaeta の増加が継続した。この結果 は，本研究と同様に Methanosarcina 属古細菌の増殖が VFA の急激な除去に関わっている可能性を示唆してい る。また，それぞれのプロセスにおけるスタート時の Methanosarcina の population はいずれも 4 % 以下であ り，優勢ではなかった。そのため，本研究と同様に Methanosarcina の増殖のために時間を要したと考えら れる。これらのことから，有機物負荷が大きく，外来植 種源投入量が少ないまたは外来植種源なしのプロセスで は，メタン発酵で働く古細菌の初期濃度が少ないため， 酸生成速度と比較してメタン生成速度が小さくなり， VFA が 蓄 積 す る と 考 え ら れ る。そ し て，蓄 積 し た VFA の除去には Methanosarcina の寄与が大きいと推察 されるが，Methanosarcina の初期濃度はいずれのプロ セスにおいても小さいため増殖までに時間を要する。 以上をまとめると，牛ふんの自己分解過程においてバ イオガス生成速度の増大と Methanosarcina の増殖によ る population の拡大とは相関関係にある。そのため， 自己分解期間における急激な VFA 除去とメタン生成に とって，Methanosarcina を中心とした古細菌群構造の 形成が重要な因子であったと推察される。また，他の研 究例との比較から，スタートアップ初期に VFA の蓄積 を起こすプロセスでは，Methanosarcina の population 増加と VFA 減少が連動して起きている。したがって， 自己分解期間においてメタン生成が開始するまでラグ時 間があったことは，Methanosarcina の増殖に時間を要 したことに起因すると考えられる。

4．結

論

乳牛ふん尿からのスタートアップの特徴として，運転 開始 1〜17 日目まではほとんどメタンが生成されず，酸 生成が進行して VFA が最高 2,300 mg-HAc/L まで蓄積 した。18 日目以降は急激にメタン生成が開始され， VFA が除去された。このことから，内来植種源を用い たスタートアップにおいて，TS 濃度の希釈により VFA の蓄積が 3,000 mg-HAc/L 以下の低濃度に抑制で き，安全な運転が可能であった。37 日目以降，連続運 転を開始してからは pH 低下，VFA 蓄積のない安定 したメタン発酵の運転が達成できた。古細菌群集のク ローン解析の結果から，自己分解が進行した 30 日目 においては 0 日目に優勢であった古細菌は検出されず， 0 日目には検出されなかった Methanosarcina 属古細菌 がライブラリの 83.8% を占めていた。古細菌群集の Real-time PCR による解析結果から，自己分解期間にお いて，Methanosarcina 属古細菌の rDNA 顕著に増加し ており，ガス生成速度の増大は Methanosarcina 属古細 菌の population 増大と相関していた。定常状態では， 処理性能，微生物群集構造ともに，消化汚泥を外来植種 源としてスタートアップさせたときの運転結果と類似し た。本研究の方法で，乳牛ふん尿の自己分解による良好 なスタートアップが可能であり，定常状態において外来 植種源を用いた場合と同等の運転性能および菌叢が形成 された。回分培養期間のメタン生成速度の増大と VFA 除去には Methanosarcina 属古細菌の増殖が寄与してい ることが示唆された。 0% 10.3 gVS/L. (Batch) 乳牛ふん尿 なし 6 外来植種 基質 有機物負荷 外来植種投入量_{(対槽容積)} 運転状況概要 古細菌群集の population dynamics 参照 No. 表 5 メタン発酵スタートアップ過程における population dynamics の比較 67% 3.7 gVS/L. d 生ごみ+汚泥 消化汚泥 4 15) VFA の減少開始後 Methanosarcina の population が増加 11 日目をピークとして 約 1,500 mg-HAc/L ま で増加し，その後減少 0% 11.9 gVS/L. (Batch) 余剰汚泥 なし 5 本研究 VFA の減少開始後 Methanosarcina の population が増加 19 日目をピークとして 約 2,500 mg-HAc まで 増加し，その後減少 19% 1.7 gVS/L. d swine waste 消化汚泥 2 14) VFA の減少開始後 Methanosarcina と Methanobacteriaceae の population が増加 10 日目をピークとして VFA 約 6,000 mg/L ま で増加し，その後減少 0% 3.7 gVS/L. d 生ごみ+汚泥 なし 3 14) 運転開始後 Methanosaeta の population 増加が継続 VFA200 mg/L 以下で 推移 12) VFA の減少開始後 Methanosarcina の population が増加 13 日目をピークとして VFA 約 7,000 mg/L ま で増加し，その後減少 17% 3.1 gVS/L. d 生ごみ+汚泥 消化汚泥 + 乳牛ふん尿 1 13) VFA の減少開始後 Methanosarcina の population が増加 45 日目をピークとして VFA 約 5,000 mg/L ま で増加し，その後減少

参 考 文 献

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21) L. T. Angenent, S. Sung and L. Raskin : Methanogenic Population Dynamics during Startup of a Full-scale Anaerobic Sequencing Batch Reactor Treating Swine Waste, Water Res., Vol. 36, pp. 4648-4654 (2002) 22) K. D. McMahon, D. Zheng, A. J. Stams, R. I. Mackie and

L. Raskin : Microbial Population Dynamics during Start-up and Overload Conditions of Anaerobic Digesters Treating Municipal Solid Waste and Sewage Sludge, Biotechnol. Bioeng., Vol. 87, pp. 823-834 (2004) 23) 小林拓朗，安田大介，久保田健吾，李 玉友，原田秀樹，

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Start-up Method for Methane Fermentation through the Anaerobic Self-degradation

ofCattle Manure and Microbial Community Change during Self-degradation

Daisuke Yasuda*, Takuro Kobayashi*, Yu-You Li*, Hideki Harada* and Yoshiyasu Okaniwa**

* Department of Civil and Environmental Engineering, Graduate School of Engineering, Tohoku University ** The Japan Association of Rural Resource Recycling Solutions

† _{Correspondence should be addressed to Daisuke Yasuda :} (6-6-06 Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai, Miyagi 980-8579 Japan)

Abstract

A start-up procedure for mesophilic methane fermentation digestion from dairy cattle manure without inoculum was investigated using a laboratory-scale continuously-stirred tank reactor. The reactor was first operated in batch mode by diluting the cattle manure to TS 1.5%. Gas production greatly increased from day 17 to 22 and then decreased. VFA first increased and reached a peak on day 22, then gradually decreased. After 37 days of batch mode operation, the reactor was changed to continuous mode operation, and the HRT was shortened in increments from 100 days to 50 days, and then to 30 days on day 70. The start-up period consists of two characteristic phases. In the first phase, VFA accumulation was observed because the methane production rate was low. In the second phase, rapid VFA degradation with an increase in methane production was observed. Microbial community shift during the start-up period was monitored using molecular techniques. Results of clone library analysis suggest that during self-digestion, Methanosarcina grew gradually and became predominant at day 30, though they were not detected at the beginning. Population dynamics of the archaeal community were investigated with real-time PCR. During the transition from the first phase to the second phase, the digester showed significant increase in the Methanosarcina rRNA gene. The population of Methanosarcina correlates with the biogas production rate. A start-up method by self-digestion of dairy cattle manure was established in this research.