E1マウスの海馬におけるグルタミン酸,γ-アミノ酪酸及び glial fibrillary acidic protein の免疫組織化学的研究

岡 山 医 誌 (1994) 106, 103-115

Elマ

ウ ス の 海 馬 に お け る グ ル タ ミ ン酸, γ-ア ミノ酪 酸

及 びglial

fibrillary

acidic

proteinの

免 疫 組 織 化 学 的 研 究

岡 山大 学 医 学部 分 子 細 胞 医 学研 究施 設神 経 情 報 学部 門(指 導:森

昭胤 教 授)

徐

文

錫

(平成5年11月9日

受 稿)

Key words: Elマ ウ ス,グ ル タ ミン酸, γ-ア ミノ酪酸,免 疫 組 織化 学,海 馬

緒 言 Elマ ウ ス は, 1954年 国 立 予 防 衛 生 研 究 所 の 今 泉 ら が 床 換 え 中 に,偶 然 痙 攣 発 作 を起 し た マ ウ ス に 着 目 し て 選 抜 育 種 し た 純 系 変 異 種 で あ る1). 発 見 当 初 はepと 呼 ば れ て い た が, 1964年 に 国 際 的 にElと し て 登 録 さ れ た2).生 後4週 齢 よ り 一 週 間 に 一 回 ほ う り上 げ 刺 激 や シ ー ソ ー 運 動 刺 激 を す る と,さ ら に4週 間 ご ろ よ り こ れ ら の 刺 激 を 与 え る だ け で 容 易 に 発 作 を起 す よ う に な る. 最 近 は,ほ う り上 げ 刺 激 を し な くて も 尾 を掴 む だ け で 発 作 を起 す よ う な 感 受 性 の 高 ま っ たElマ ウ ス が 増 え て き た.発 作 の 型 は す で に 詳 細 に 報 告 さ れ て い る3).こ の マ ウ ス は 発 作 後 も死 亡 し な い こ と,遺 伝 的 に 痙 攣 準 備 性 が 規 定 さ れ て い る こ と1),取 扱 い や す い こ と,及 び ヒ トの 側 頭 葉 て ん か ん,あ る い は 二 次 全 般 化 複 雑 部 分 発 作 の モ デ ル とみ な さ れ て い る4,5)こ とか ら,数 多 くの 研 究 が な さ れ て き た3). Elマ ウ ス の 痙 攣 発 現 機 構 に 関 して は,ア セ チ ル コ リ ン6-9),ア ン モ ニ ア10),ア ミ ノ 酸11-14),ア ミ ン15-19),核 酸20-22),蛋 白 質23),ペ プ タ イ ド24) 及 び 金 属25)な どの 異 常 が 報 告 され て い る.特 に 興 奮 性 ア ミ ノ酸 神 経 伝 達 物 質 に 関 し て は, Nー メ チ ル-D-ア ス パ ラ ギ ン酸 レ セ プ ター の 拮 抗 薬 で あ る [(+)-5-methy]-10, 11-dibenzo[a, d] cyclohepten-5, 10-imine maleate(MK-801), 2-amino-5-phosphonopropionic acid及

び2-amino-7-phosphonopropionic acidは, Elマ ウ ス の 発 作 を 抑 制 す る こ と26,27), Elマ ウ ス の 大 脳 皮 質,海 馬 及 び 小 脳 の グ ル タ ミ ン 及 び ア ス パ ラ ギ ン 酸 値 は 痙 攣 素 因 の な いddYマ ウ ス に 比 べ て 高 い が,ほ う り上 げ 刺 激 に よ り痙 攣 が お こ る よ う に な っ た も の の 安 静 時 に は,こ れ ら の ア ミ ノ 酸 値 はElマ ウ ス 無 処 置 群 に 比 べ て 低 下 す る こ と が 知 られ て い る28).ま た, Elマ ウ ス の 大 脳 皮 質 及 び 海 馬 切 片 か らの グル タ ミ ン酸 の 放 出 量 は, ddYマ ウ ス に 比 べ て 高 値 で あ る が,ほ う り上 げ 刺 激 に よ り痙 攣 が 起 る よ うに な っ た も の の 安 静 時 に は, Elマ ウ ス 無 処 置 群 に 比 べ 低 い こ と29), Elマ ウ ス の 大 脳 皮 質 か ら の ア ス パ ラ ギ ン 酸 の 放 出 量 はddYマ ウ ス に 比 べ 低 値 で あ る が,ほ う り 上 げ 刺 激 に よ り痙 攣 が 起 る よ う に な っ た も の の 安 静 時 に は, Elマ ウ ス 無 処 置 群 に 比 べ て ア ス パ ラ ギ ン 酸 の 放 出 量 は 高 値 で あ る こ と が 認 め ら れ て い る30).さ ら に, Elマ ウ ス の 痙 攣 を抑 制 す る ジ プ ロ ピ ル 酢 酸 は,海 馬 か ら の カ リウ ム 依 存 性 及 び 非 依 存 性 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 の 放 出 を抑 制 し て い る31).他 方,抑 制 性 の ア ミ ノ 酸 神 経 伝 達 物 質 に つ い て は,ほ う り上 げ 刺 激 に よ り痙 攣 が 起 る よ う に な っ た も の の 安 静 時 に お け るElマ ウ ス の 大 脳 皮 質,海 馬 及 び 線 条 体 の γ-ア ミ ノ 酪 酸 値 は, Elマ ウ ス 無 処 置 群 に 比 べ て,低 値 で あ る こ と28),お よ び, Elマ ウ ス の 大 脳 皮 質 と 海 馬 か ら の γ-ア ミ ノ 酪 酸 の 放 出 はElマ ウ ス 無 処 置 群 と ほ う り上 げ 刺 激 群 と の 間 に は 有 意 差 は な い が, 103

γ-ア ミ ノ 酪 酸 の 取 り込 み 量 は 海 馬 に お い て 低 値 で あ る こ とが 知 ら れ て い る32).こ れ ら のElマ ウ ス に お け る 興 奮 性 並 び に 抑 制 性 ア ミ ノ 酸 の 異 常 は 発 作 発 現 と密 接 に 関 与 して い る こ と を 示 唆 し て い る.し か し な が ら, Elマ ウ ス の グ ル タ ミ ン 酸, γ-ア ミ ノ 酸,グ リ ア 線 維 性 酸 性 プ ロ テ イ ン(glial fibrillary acidic protein, GFAP)の 局 在 に 関 す る 免 疫 組 織 化 学 的 検 索 は 少 な い36). 本 研 究 に お い て は,免 疫 組 織 化 学 的 方 法 を 用 い て, Elマ ウ ス の 海 馬 に お け る グ ル タ ミ ン 酸, γ-ア ミ ノ酪 酸 及 びGFAPの 局 在 に つ い て,同 週 齢 のddYマ ウ ス と詳 細 に 比 較 検 討 し,て ん か ん 原 性 と の 関 係 に つ い て 検 索 を行 な っ た. 材 料 と 方 法 1.実 験 動 物 生 後3カ 月 齢 のElマ ウ ス及 びddYマ ウ ス(雄) を使 用 し た. Elマ ウ ス は,実 験 動 物 中 央 研 究 所 (川 崎)よ り, ddYマ ウ ス は エ ス エ ル シ ー 株 式 会 社(静 岡)よ り購 入 した. ddYマ ウ ス はElマ ウ ス の 母 系 で あ り,痙 攣 素 因 が な い こ とか らElマ ウ ス の 対 照 と し て 使 用 し た.実 験 動 物 は12時 間 明 暗 サ イ ク ル の も と で 飼 育 し た.飼 料 は オ リエ ン タ ル 酵 母 製(MF) を使 用 し,水 は 給 水 瓶 で 自 由 に 摂 取 さ せ た. 2.試 薬 グ ル タ ミ ン 酸 抗 体, γ-ア ミ ノ 酪 酸 抗 体 は, Chemicon社(米 国)よ り購 入 し, GFAPは Progen社(米 国)よ り購 入 し た. 3.免 疫 組 織 化 学 的 方 法 1)灌 流 固 定 方 法 固 定 液 の 組 成 は4% paraformaldehyde及 び 0.1% glutaraldehyde solutionを 含 む0.1M phosphate buffer(pH 7.4)で あ る.固 定 液 の 作 製 は ま ず, 40gのparafrormaldehydeを 蒸 留 水 (60℃)に 攪 拌 し て 溶 解 し, 500mlと し た.次 い で1N NaOHを3∼5滴,白 濁 が 消 失 す る ま で 加 え,さ ら に25% glutaraldehydeを4.0dl加 え た.最 後 に, 0.2M phosphate buffer(pH 7.4) 500mlを 加 え て1000mlに し,最 終 的 に は0.1M HCl と0.2M NaOHでpH 7.4に 調 整 し た. 灌 流 固 定 法 は 次 の よ う に 行 な っ た.ま ず,エ ー テ ル に よ り動 物 を麻 酔 し た_{.開 胸 は,横 隔 膜} 部 付 近 に 横 切 開 を 入 れ,次 に 横 隔 膜 を破 り,左 右 助 骨 部 に 従 切 開 を 入 れ て,胸 腔 を 露 出 し た. 大 動 脈 の 明 示 の た め,大 動 脈 周 囲 の 胸 腺 及 び 軟 組 織 を 除 去 し た.次 い で 縫 合 糸 を 大 動 脈 の 下 に 入 れ, Oリ ン グ をつ く り結 紮 を 用 意 し た.左 心 室 尖 部 を 切 開 し,左 心 室 尖 部 よ り大 動 脈 ヘ カ ニ ュ ー レ を 挿 入 後,縫 合 糸 で カ ニ ュ ー レ を結 紮 し, 固 定 し た.次 い で0.1M phosphate bufferを 流 入 し,右 心 房 を切 開 し 血 液 を 流 出 さ せ た.全 血 液 の 流 出 を確 認 後, 0.1M phosphate bufferか ら 固 定 液 へ 活 栓 を切 り換 え,約15∼20分 間 灌 流 (灌 流 量8∼10ml/min)し,脳 を 固 定 し た.次 い で 脳 を 摘 出 し,大 脳 皮 質 及 び 海 馬 部 を 前 頭 断 方 向 に3分 割 し,同 一 固 定 液 で4℃ に て1昼 夜 浸 漬 固 定 し た. 2)光 学 顕 微 鏡 試 料 作 製 方 法 常 法 に 従 い ア ル コ ー ル 系 列 で 脱 水 後,脳 組 織 を パ ラ フ ィ ン包 埋 し た.次 い で 厚 さ約3μ の パ ラ フ ィ ン切 片 を作 製 し,ヘ マ ト キ シ リン ・エ オ ジ ン 染 色 を施 し,光 学 顕 微 鏡 的 に 観 察 し た. 3)免 疫 組 織 化 学 的 検 索 方 法 切 片 を 脱 パ ラ フ ィ ン 後, 0.3%過 酸 化 水 素 メ タ ノー ル 溶 液 に30分 浸 漬 し,以 下 の 染 色 を行 な っ た. ポ リ ク ロ ナ ー ル 抗 体 の グ ル タ ミン 酸 と γ-ア ミ ノ酪 酸 はperoxidase antiperoxidase(PAP) 法 を,モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 のGFAPはavidin biotin complex(ABC)法 を 用 い た. Table 1 に 示 す 一 次 抗 体 は4℃ で16時 間 反 応 さ せ た.二 次 抗 体 は30分 反 応 後, PAP複 合 体 ま た は ア ビ ジ ン ー ビ オ チ ン 複 合 体 を30分 室 温 で 反 応 させ た. 希 釈 は す べ て0.005Mト リスー 塩 酸 緩 衝 生 理 食 塩 液 で 行 な っ た(Table 2).発 色 基 質 は, 0.001% H2O2含 有0.02% 3.3ー ジ ア ミ ノベ ン チ ジ ン4塩 酸 塩(0.05Mト リス ー 塩 酸 緩 衝 液pH 7.6)を 用 い た.発 色 後, Mayerの ヘ マ トキ シ リ ン で 後 染 色 を 行 な い,光 顕 的 に 観 察 し た.

PAP法 とABC法 の 染 色 はTable 1に 示 す 方 法 に よ っ た.抗 原 抗 体 反 応 は 湿 箱 中 で 行 な い, ア ビ ジ ン-ビ オ チ ン複 合 体 は,反 応 を行 な う30分 前 に 作 製 し た.対 照 標 本 は 一 次 抗 体 を 省 略 して 同 様 に 行 な っ た.

Elマ ウ スの 海 馬 に お け る免 疫 組織 化 学 的 研 究

105

結 果

1.グ ル タ ミ ン 酸 の 局 在

Fig. 1にddYマ ウ ス(D)とElマ ウ ス(E)の 海 馬 領 域 に お け る グ ル タ ミン 酸 免 疫 陽 性 細 胞 を示 す. グ ル タ ミ ン 酸 は 錐 体 細 胞 層 全 体 に 認 め ら れ,そ の 強 さ はElマ ウ ス に 強 陽 性 で あ る.さ ら に 倍 率 を あ げ て 観 察 す る と, Elマ ウ ス のCA1, CA2, CA3及 びCA4の グ ル タ ミ ン酸 陽 性 反 応 は 錐 体 細

胞 の 細 胞 質 に 認 め ら れ,そ れ らは い ず れ もddY マ ウ スに 比 べ て 細 胞 の 形 が 膨 らん でい た(Fig. 3). 特 にElマ ウ ス のCA1に お い て は,細 胞 と細 胞

と の 間 に 隙 間 が 観 察 さ れ,ま た核 の 形 も大 き い こ とが 認 め ら れ た(Fig. 3El).さ らにElマ ウ ス のCA1の 陽 性 細 胞 の 腹 側 部str. radiatum (放 射 状 層)へ の 突 起 に 断 裂 性 が 認 め られ た(Fig. 4 El).ま た, Elマ ウ ス の 歯 状 回 に お い て も グ ル タ ミン 酸 陽 性 細 胞 数 も 多 く そ して 核 の 形 は ddYマ ウ ス に 比 べ て 大 きか っ た(Fig. 5). 2. γ-ア ミノ 酪 酸 の 局 在

Fig. 2にddY(D)マ ウ ス とElマ ウ ス(E)の 海 馬 領 域 に お け る γ-ア ミノ酪 酸 免 疫 陽 性 細 胞 を示 し た(Fig. 5).両 者 に 陽 性 反 応 の 差 は み ら れ な か っ た. γ-ア ミ ノ酪 酸 陽 性 大 細 胞 がddYマ ウ ス の 歯 状 回 の 近 辺 に 認 め ら れ た が, Elマ ウ ス に は Table 2  抗 体 と希 釈 率 Table 1  免 疫 組 織 化 学 染 色 法

認 め ら れ な か っ た(Fig. 6). 3. GFAPの 局 在

Fig. 7はElマ ウ ス 及 びddYマ ウ ス の 海 馬 領 域 に お け るGFAPの 免 疫 陽 性 細 胞 を示 す が, El に 陽 性 細 胞 が 増 加 し て い る. Fig. 8とFig. 9 はElマ ウ ス 及 びddYマ ウ ス のCA1に お け る GFAP免 疫 陽 性 細 胞 を 示 し た.明 らか にElマ ウ ス の 背 側 部 のstr. oriens(上 昇 層)と 腹 側 部 のstr. radiatum(放 射 状 層)に お い て, ddYマ ウ ス に 比 べ て 樹 枝 状 の 免 疫 陽 性 細 胞 の 数 の 増 加 が 認 め ら れ た.

考

察

鈴 木 ら5)は, 2-デ オ キ シ グ ル コー ス を 用 い た オ ー トラ ジ オ グ ラ フ に よ り_{, Elマ ウ ス の 発 作 の 際,} 大 脳 皮 質,海 馬 が 強 く興 奮 し,視 床,中 心 灰 白 質,青 斑 核,不 確 帯 を 含 む 諸 間 質 核,被 蓋 な ど の 活 動 が 低 下 す る こ と を 認 め,さ ら に,不 全 発 作 の 際 に 一 側 性 海 馬 歯 状 回,海 馬 台, CA1, CA3 な ど に ま た が る小 部 分 が 他 に 比 して 異 常 に 興 奮 す る こ と を観 察 し た こ とか ら,こ の 部 分 が て ん か ん 原 性 焦 点 で あ る と示 唆 し て い る.今 回 著 者 は,グ ル タ ミ ン酸 免 疫 陽 性 細 胞 と γ-ア ミ ノ 酪 酸 免 疫 陽 性 細 胞 を特 に 海 馬 領 域 に つ い て 詳 細 に 検 討 し た.グ ル タ ミ ン 酸 陽 性 細 胞 はCA1, CA2, CA3, CA4及 び 歯 状 回 の い ず れ の 部 位 に お い て も細 胞 の 形 が 大 き く, CA1の 細 胞 間 に 隙 間 が 認 め ら れ た. 海 馬 領 域 の 形 態 学 的 研 究 に つ い て,鈴 木 ら33)は Elマ ウ ス の 海 馬 切 片 を ニ ッ ス ル ま た はHE染 色 し, ddYマ ウ ス と詳 細 に 比 較 検 討 し て い る. そ れ に よ る と, ddYマ ウ ス のCA1及 びCA2の 錐 体 細 胞 層 が 整 然 か つ 緊 密 に 配 列 し て い る の に 対 し て, Elマ ウ ス で は 全 般 に 緊 密 で は な く,乱 れ て 見 え,こ の 層 が 少 し広 が っ て 見 え る こ と を 観 察 して い る.ま た, CA1か らCA2に か け て と, CA3か らCA4や 歯 状 回 に か け て の 細 胞 群 に 染 色 性 の 低 下,不 円,不 正 形 と い っ た 軽 度 の 萎 縮 像 を 認 め て い る.水 川 ら34)は,鍍 銀 法 に よ りElマ ウ ス の 海 馬 領 域 の 細 胞 構 築 をddYマ ウ ス と比 較 し て い る.そ れ に よ る と, Elマ ウ ス のCA1と CA2の 錐 体 細 胞 の 数 が 減 少 し て お り,個 々 の 細 胞 か ら で る 突 起 の 数 が 少 な く,充 分 に 発 達 し て い な い こ と を 認 め て い る.さ ら に, CA3に お い て は,錐 体 細 胞 はCA1とCA2に 比 べ て ま ば ら に 分 布 し,突 起 の 形 態 も 異 な り,数 も少 な い こ と を 見 い だ し た. 鈴 木 ら33)のニ ッ ス ル 染 色 に よ るElマ ウ ス の 海 馬 領 域 の 錐 体 細 胞 の 形 態 と,本 研 究 に お け るEl マ ウ ス の 海 馬 領 域 の グ ル タ ミン 酸 陽 性 細 胞 の 形 態 とが 似 て い た.グ ル タ ミ ン 酸 は 海 馬 の 錐 体 細 胞 の 興 奮 伝 達 物 質 で あ る.最 近 の ア ミ ノ 酸 の 抗 体 の 出 現 に よ り,グ ル タ ミ ン 酸 は ほ と ん ど す べ て の 海 馬 領 域 の 錐 体 細 胞 に 含 有 さ れ て お り,そ の 他 ア ン モ ン角 の 各 層 の 非 錐 体 細 胞,歯 状 回 の 非 顆 粒 細 胞 に も存 在 して い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る.ま た,グ ル タ ミ ン 酸 は 顆 粒 細 胞 に も 存 在 し,歯 状 回 門 に は 少 な い.こ れ ら の グ ル タ ミ ン 酸 を含 有 す る 錐 体 細 胞 は 外 側 中 隔 野 に 興 奮 性 の 投 射 をす る と さ れ て い る35).先 に,平 松 ら28) は, Elマ ウ ス の 海 馬 に お け る グ ル タ ミ ン酸 量 は ddYマ ウ ス に 比 べ て 高 い こ と を 報 告 し て い る. ま た,ほ う り上 げ 刺 激 に よ り痙 攣 が 起 る よ うに な っ た も の の 安 静 時 で は 低 下 し, ddYマ ウ ス と 同 じ レ ベ ル に な る こ とを 認 め て い る.小 山36)は コ バ ル ト金 属 末 を ラ ッ トの 大 脳 皮 質 に 投 与 し て 作 成 した コ バ ル ト誘 導 て ん か ん 焦 点 野 の グ ル タ ミ ン 酸 を 免 疫 組 織 学 的 に 染 色 して い る が,そ れ に よ る と,グ ル タ ミン 酸 陽 性 細 胞 の 数 が 減 少 して い た.こ の 知 見 は コバ ル ト焦 点 部 位 の グ ル タ ミ ン 酸 量 の 低 下37)と 一 致 し て い る.今 回 著 者 の 実 験 結 果 で は, Elマ ウ ス の 海 馬 領 域 の グ ル タ ミン 酸 陽 性 細 胞 の 数 が 多 か っ た.こ れ ら の 結 果 は て ん か ん マ ウ ス に お い て,け い れ ん の 有 無 と グ ル タ ミン 酸 量 が 相 関 し て い る こ と を 示 して い る.今 回 の 結 果 か ら 本 研 究 に お い て 用 い たElマ ウ ス は,ほ う り上 げ 刺 激 を し な い で も容 易 に 痙 攣 を 起 す マ ウ ス で あ り,動 物 の 条 件 は 異 な る がEl マ ウ ス に お い てddYマ ウ ス に 比 べ て 明 らか に 陽 性 細 胞 が 多 い こ と は 平 松 ら の 分 析 報 告 を 支 持 す る も の で あ る. 海 馬 の 篭 細 胞 や 錐 体 細 胞 層 の 軸 索 細 胞 は γ-ア ミ ノ 酪 酸 作 動 性 で,錐 体 細 胞 に 抑 制 を か け る こ と が 知 ら れ て い る.歯 状 回 で は 顆 粒 細 胞 層 の4 つ の 篭 細 胞 が γ-ア ミノ酪 酸 作 動 性 で 顆 粒 細 胞 に 抑 制 を か け る.歯 状 回 門 の γ-ア ミ ノ 酪 酸 含 有 細

Elマ ウス の海 馬 にお け る免疫 組 織 化 学 的研 究

107

胞 は 対 側 の 海 馬 に 交 連 線 維 を送 る と さ れ て い る. ま た γ-ア ミ ノ 酪 酸 線 維 も各 層 に 見 ら れ,ア ン モ ン 角 で は 錐 体 細 胞 層 や 綱 状 層 に,歯 状 回 で は 顆 粒 細 胞 と分 子 層 の 外 層 に 多 く分 布 す る と さ れ て い る35).今 回 は,ア ミ ノ酪 酸 の 局 在 に つ い て は 海 馬 に お い て差 を認 め な か っ た が, ddYマ ウ ス の 歯 状 回 近 辺 の 放 射 状 層 に 散 在 性 の ア ミ ノ酪 酸 陽 性 大 細 胞 を 認 め た.し か も こ の 陽 性 細 胞 はElマ ウ ス に は 認 め ら れ な か っ た.さ き に, Elマ ウ ス の 無 処 置 群 及 び ほ う り上 げ 刺 激 に よ り痙 攣 を 起 す よ うに な っ た も の の 安 静 時 に お い て,大 脳 皮 質 と海 馬 の γ-ア ミ ノ 酪 酸 量 はddYマ ウ ス に 比 べ て 低 い こ とが 認 め ら れ て い る28)_{.ま た,発 作 発} 射 起 始 時 に 重 要 な 役 割 を持 つ 頭 頂 皮 質 の γ-ア ミ ノ酪 酸 濃 度 と グ ル タ ミ ン 酸 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ の 活 性 が 低 い こ と が 知 られ て い る37,38)_{.こ れ らの} 成 績 は,歯 状 回付 近 の γ-ア ミ ノ 酪 酸 の 細 胞 の 数 の 減 少 と一 致 し て い る 可 能 性 も あ る. 側 頭 葉 て ん か ん に は ア ン モ ン 角 の 硬 化 が 認 め ら れ る39,40).本実 験 を お い て は, Elマ ウ ス のCA1 に お い て グ ル タ ミ ン 酸 陽 性 細 胞 間 に 隙 間 が 認 め ら れ,陽 性 細 胞 の 放 射 状 層 に お け る 突 起 に 断 裂 性 が 認 め られ た.そ れ に 一 致 し て, GFAP免 疫 陽 性 細 胞 の 増 加 が 認 め ら れ た.こ の 成 績 はElマ ウ ス が 側 頭 葉 て ん か ん の モ デ ル で あ る こ と を 示 し て い る. Brigande et al.41)も 同 様 に, Elマ ウ ス の 海 馬 のGFAP免 疫 陽 性 細 胞 を対 照 のC57 BL/6Jマ ウ ス と 比 較 検 討 し て い る.そ れ に よ る と, Elマ ウ ス の 海 馬 のGFAP免 疫 陽 性 細 胞 は マ ウ ス に 比 べ て15∼40倍 も増 加 して い る が,錐 体 細 胞 の 脱 落 は 認 め ら れ て い な い.ま た,ほ う り上 げ 刺 激 を して い な い 成 熟Elマ ウ ス と ほ う り上 げ 刺 激 を し,痙 攣 を 起 す よ う に な っ たElマ ウス の 海 馬 のGFAP免 疫 陽 性 細 胞 は 著 明 に 増 加 し て い る が,ま だ 発 作 を起 さ な い 生 後43日 に お い て はGFAP免 疫 陽 性 細 胞 は,対 照 マ ウ ス の 成 熟 時 と 同 レ ベ ル で 非 常 に 少 な い こ と を 認 め て い る.こ の こ とか ら,彼 ら はElマ ウ ス の 海 馬 の GFAP免 疫 陽 性 細 胞 の 増 加 は 発 作 の 結 果 に よ る もの で は な い こ と を指 摘 し て い る.さ き に,鈴 木 ら33)は, Elマ ウ ス の 海 馬 に お け る錐 体 細 胞 の 不 整 列 は 痙 攣 を一 度 も起 し て い な いElマ ウ ス に も 見 ら れ る こ と か ら,こ の 現 象 は 発 作 の 結 果

に よる もの で は ない こ とを示唆 して い る.

GFAP

に 関す る本 研 究 の免 疫 組 織 化 学 的 方 法 に よ る病

理 学 的 所 見 は, Elマ ウ ス のGFAPの

局 在 が 遺

伝 性 の て ん か ん 原性 と関 係 す る可能 性 を充 分 に

示 唆 す る もの で あ る が,現 在,幼 若 な痙 攣 を経

験 して い ないElマ

ウス を用 い て検 討 中で あ る.

結 論 免 疫 組 織 化 学 的 方 法 を 用 い て, Elマ ウ ス の 海 馬 に お け る グ ル タ ミン 酸, γ-ア ミ ノ 酪 酸 及 び GFAP免 疫 陽 性 細 胞 に つ い て 同 週 齢 のddYマ ウ ス と比 較 検 討 し た. 1) ddYマ ウ ス とElマ ウ ス 海 馬 の グ ル タ ミ ン 酸 はElマ ウ ス に お い て 強 い 陽 性 反 応 を 認 め た. Elマ ウ ス のCA1, CA2, CA3及 びCA4の グ ル タ ミ ン 酸 陽 性 細 胞 は い ず れ もddYマ ウ ス に 比 べ て 細 胞 の 形 が 膨 ら ん で お り, CA1に お い て は 細 胞 間 に 隙 間 が あ り,核 も 大 き か っ た.ま だ,歯 状 回 に お い て は 陽 性 細 胞 数 も 多 くそ し て 核 の 形 は 大 き い.さ ら にElマ ウ ス のCA1の 腹 側 部 放 状 層 に は グ ル タ ミン 酸 陽 性 細 胞 の 突 起 の 断 裂 性 が 認 め ら れ た. 2) ddYとElマ ウ ス の γ-ア ミ ノ 酪 酸 は ほ ぼ 同 様 の 弱 陽 性 を示 し,差 は 認 あ な か っ た.し か し, γ-ア ミ ノ 酪 酸 陽 性 大 細 胞 がddYマ ウ ス の 歯 状 回 の 付 近 に 認 め ら れ, Elマ ウ ス に は 認 め ら れ な か っ た こ とが 注 目 さ れ た. 3) Elマ ウ ス の 背 側 部 と腹 側 部 のGFAP免 疫 陽 性 細 胞 は, ddYマ ウ ス に 比 べ て 明 らか に 増 加 し て お り,ア ン モ ン角 硬 化 の 状 況 が 示 唆 さ れ た. 稿 を終 るに 当 り,御 指 導,御 校 閲 を賜 っ た森 昭 胤 教 授 に 深 甚 な る謝 意 を表 す と共 に,直 接 御 指 導 い た だ い た 平 松 緑 講 師,免 疫 組 織 化 学 方 法 を御 教 授 い た だ い た 歯 学 部 永 井 教 之 教 授 及 び長 塚 仁 助 教 授 に深 謝 致 し ます.

文 献

1) 今 泉 清,伊 藤 昭 吾,沓 掛 源 次 郎,滝 沢 竜安,藤 原 公 策,土 川 清:マ ウ ス の て ん か ん様 異 常 に つ い て.実 験 動 物(1959) 8, 6∼10.

2) Imaizumi K and Nakano T: Mutant Stocks,

Strain:

El.

Mouse News Letter

(1964) 31, 57.

3) Mori A: El mice:

Neurochemical

approach to the seizure mechanism.

Neurosciences

(1988) 14,

275-285.

4) Suzuki J: Peroxysmal

discharges in the electroencephalogram

of the El mouse. Experientia

(1976)

32, 336-338.

5) Suzuki J, Nakamoto

Y and Shinkawa

Y: Local cerebral glucose utilization

in epileptic seizures of

the mutant El mouse.

Brain Res (1983) 266, 359-363.

6) Fujiwara M: Acetylcholine

level of mouse brain in preconvulsive

states.

Neurosciences

(1980) 6,

192-202.

7) Kurokawa

M, Machiyama

Y and Kato M: Distribution

of acetylcholine

in the brain during various

states of activity.

J Neurochem

(1963) 10, 341-348.

8) Kurokawa

M,

Nuruse H and Kato M: Metabolic

studies on ep mouse,

a special strain with

convulsive position.

Prog Brain Res (1966) 21A, 112-130.

9) 藤 原 正 昭,松 本 路 子,森 昭 胤: El系, CBA系 お よ びA系 マ ウ ス 脳 内 ア セ チ ル コ リ ン 含 有 量 に つ い て. 脳 研 究 会 誌(1977) 3, 124-125.

10) Naruse H, Kato M, Kurokawa M, Hara R and Yabe T: Metabolic defects in a convulsive strain

of mouse. J Neurochem (1960) 5, 359-369.

11) Suzuki S and Mori A: Regional distribution of tyrosine, tryptophan and their metabolites in the

brain of epileptic El mice. Neurochem Res (1992) 17, 693-698.

12) Hattori H, Ito M and Mikawa H: ƒÁ-Aminobutyric acid binding sites and ƒÁ-aminobuyric acid

concentrations in epileptic El mouse brain. Eur J Pharmacol (1985) 119, 217-223.

13) Iwata H, Yamagami S, Lee E, Matsuda T and Baba A: Increase of brain taurine contents of El

mice by physiological stimulation. Jpn J Pharmacol (1979) 29, 503-507.

14) Hiramatsu M, Ogawa K, Kabuto H and Mori A: Reduced uptake and release of 5-hydrox

ytryptamine and taurine in the cerebral cortex of epileptic El mice. Epilepsy Res (1987) 1, 40-45.

15) Hiramatsu M: Brain monoamine levels and El mouse convulsions. Folia Psychiatr Neurol Jpn

(1981) 35, 261-266.

16) Hiramatsu M: Brain 5-hydroxytryptamine level, metabolism, and binding in El mice. Neurochem

Res (1983) 8, 1163-1175.

17) Hiramatsu M and Mori A: Brain catecholamine concentrations and convulsion in El mice. Folia

Psychiatr Neurol Jpn (1977) 31, 492-495.

18) Hiramatsu M and Mori A: Distribution of 5-hydroxytryptamine and 5-hydroxyindoleacetic acid in

brains of El and ddY mice. IRCS Med Sci (1977) 8, 84.

19) Hiramatsu M and Mori A: El mouse seizure and 5-hydroxytryptamine in the brain. IRCS Med Sci

(1980) 8, 719-720.

20) Yamagami S, Ohno K, Tsuji M, Mori K and Kawakita Y: Devopmental alteration in RNA

metabolism of El mouse brain. Folia Psychiatr Neurol Jpn 35, 253-260.

Elマ ウ スの 海 馬 に お け る免 疫 組 織 化学 的研 究

109

heterogenous nuclear RNA associated with polyadenylate and oligoadenylate sequences from El

mouse brain as a convulsive strain. Exp Neurol (1984) 83, 98-107.

22) Yamagami S, Onishi H, Ohno K, Mori K and and Kawakami Y: Alteration of RNA synthesis in

vivo in intact cerebral cortex nuclei induced by convulsions in seizure susceptible El mice. Exp

Neurol (1987) 95, 167-177.

23) Mody I, Baimbridge K G and Miller J J: Distribution of calbindin-D28k (CaBP) in the cerebral cortex

and hippocampus of the epileptic (El) mouse. Epilepsy Res (1987) 1, 46-52.

24) Ochi J, Ito M, Okuno T and Mikawa H: Immunoreactive leucine-enkephalin content in brains of

epileptic El mice. Epilepsia (1988) 29, 91-96.

25) Fukahori M, Itoh M, Oomagari K and Kawasaki H: Zinc content in discrete hippocampal and

amygdaloid areas of the epilepsy (El) mouse and normal mice. Brain Res (1988) 455, 381-384.

26) Sato K, Morimoto K, Hiramatsu M, Mori A and Otsuki S: Effect of noncompetitive agonist (MK

- 801) of NMDA receptors on convulsions and brain amino acid level in in El mice. Neurochem Res

(1989) 14, 741-744.

27) Shimada M, Kabuto H and Yokoi I: The effect of ƒÖ-phosphono-ƒ¿-aminocarboxylic acids on

seizures and brain amino acid levels in El mice. Res Commun Chem Pathol Pharmacol (1987) 57,

359-373.

28) Hiramatsu M, Edamatsu R, Suzuki S, Shimada M and Mori A: Regional excitatory and inhibitory

amino acid levels in epileptic El mouse brain. Neurochem Res (1990) 15, 821-825.

29) Osaki Y, Hiramatsu M and Mori A: Uptake and K+stimulated release of glutamate from cerebral

cortical and cippocampal slices in El mice, and dose effect of glutamate. Neurosciences (1990) 16,

561-567.

30) Higashihara Y, Hiramatsu M and Mori A: Aspartic acid release from cerebral cortical slices of El

mice with high seizure susceptibility. Res Commun Chem Pathol Pharmacol (1990) 70, 155-171.

31) Hiramatsu M, Kinno I, Kanakura K, Sato K and Mori A: Increased aspartate release from brain

nlices of epileptic experimental animals and effect of valproate on it. Jpn J Psychiatr Neurol (1992)

46, 541-543.

32) Janjua NA, Mori A and Hiramatsu M: Gamma-aminobutyric acid uptake is decreased in the

hippocampus in a genetic model of temporal lobe epielpsy. Epilepsy Res (1991) 8, 71-74.

33) 鈴 木 二 郎,松 下 正 明,中 本 百 合 江: Elマ ウ ス脳 の病 理 組 織 学 的 研 究,厚 生 省 神 経 疾 患研 究 委 託 費 「て ん か ん の 成 因 と治 療 に 関 す る研 究 」(#82-01).昭 和57年 度 報告 書(1982) pp 27-33.

34) 水 川 公 直,平 松 緑,森 昭 胤: Elマ ウ ス 海 馬 領 域 に お け る鍍 銀 法 に よ る細 胞 構 築 学 的 研 究. Neurociences (1989) 14, 204-206.

35) 篠 田 晃:海 馬;化 学 的 神 経 機 能 解 剖 学,遠 山正 彌,塩 谷 弥 兵衛 編,厚 生 社,大 阪(1987) pp 302-312.

36) Koyama I: Amino acids in the cobalt-induced

epileptogenic

and non epileptogenic

cat's cortex.

Can

J Physiol Pharmacol

(1972) 50, 740-752.

37) Murashima

YL, Kasamo K and Suzuki J: Distribution

of GABA concentrations

and GAD activities

in the parietal cortex and hippocampal

CA1 in the El mouse. Jpn J Psychiatry

Neurol (1990) 44,

442-444.

38) 村 島善 也,笠 松 公 弘,鈴 木 二 郎:難 治 てん か ん の 成 因 に 関 わ る発 達 生 化 学 的 研 究-発 達 過 程 に お け るElマ ウ ス頭 頂 皮 質. GABA作 動 系 異 常 領 域 の 成 熟 と形 成,厚 生省 精 神.神 経 疾 患研 究 委 託 費(元 指-1)難 治 て ん か ん の病 態 と治 療 に 関 す る研 究.平 成 元 年 度 研 究 報 告 書(1990) pp 23-31.

Drugs;

Mechanisms

of Action,

Glaser GH, Penry J K and Woodbury D M eds, Raven Press, New

York (1980) pp 49-62.

40) Babb T L and Brown W J: Pathological

findingds in epilepsy:

in Surgical

Treatment

of the Epi

lepsies,

Engel J Jr ed, Raven Press,

New York (1987) pp 101-114.

41) Brigande J V, Wieraszko

A, Albert M D, Balkema GW and Seyfried T N: Biochemical

correlates

of epilepsy in the El mouse: Analysis of glial fibrillary acidic protein and gangliosids.

J Neurochem

Elマ ウ ス の海 馬に お け る免 疫 組 織 化 学 的研 究

111

Fig. 1 The distribution of glutamic acid positive cells in the hippocampus of ddY (D) and El (E) mice. •~ 25 bar=400ƒÊm

Fig. 2 The distribution of ƒÁ-aminobutylic acid positive cells in the hippocampus of ddY (D) and El (E) mice. •~25 bar=400ƒÊm

Fig. 3 The distribution of glutamic acid positive cells in CA1, CA2, CA3 and CA4 of ddY and El mice. (D1•`D4, E1•`E4)•~260 bar=40ƒÊm

Elマ ウス の海 馬 にお け る免疫 組 織 化 学 的 研 究

113

Fig. 4 The distribution of glutamic acid positive cells in CA1 (left) (right) of ddY (Dl) and El (E1) mice. •~120 bar=100ƒÊm

Fig. 5 The distribution of glutamic acid positive cells in the gyrus dentatus of ddY (Da) and El (Ed) mice. •~120 bar=100ƒÊm

Fig. 6 The distribution of ƒÁ-aminobutyric acid (GABA) positive cells in gyrus dentatus ddY (Dd) and El (Ed) mice. •~120 bar=100ƒÊm

Fig. 7 The distribution of glial fibrillary acidic protein positive cells in the hippocampus of ddY (D1 and El (E1) mice. •~25 bar=400ƒÊm

Fig. 8 (a, b, c, d) The distribution of glial fibrillary acidic protein positive cells in CA1 of ddY(D1) a nd El (E1) mice. •~60 bar=200ƒÊm

Fig. 9 The distribution of glial fibrillary acidic protein positive cells (Enlargement of Fig. 8. ddY (D1) and El (E1)•~120 bar=100ƒÊm

Elマ ウ スの 海 馬 にお け る免疫 組織 化 学 的 研 究

115

Immunohistochemical analysis of glutamic acid, ƒÁ-aminobutyric acid, and glial fibrillary acidic protein positive cells

in the hippocampus of El mice Moon-Suk SUH

Department of Neuroscience, Institute of Molecular and Cellular Medicine, Okayama University Medical School,

Okayama 700, Japan (Director: Prof. A. Mori)

Glutamic acid, ƒÁ-aminobutyric acid and glial fibrillary acidic protein positive cells in the hippocampus of El mice and ddY mice were examined immunohistochemically. The shape of glutamic acid positive cells in CA1, CA2, CA3 and CA4 of hippocampus were expanded compar ed to that of ddY mice. There was a space between cells and cells containing glutamic acid and the nucleus of such cells was larger in the CA1 of El mice than that of ddY mice. The glutamic acid cells were irregular and the nucleus was larger in the gyrus dentatus of El mice than that of ddY mice. There was an intermittence in the process of glutamic acid cells in the area of str. radiatum of El mice. ƒÁ-Aminobutyric acid-positive cells seemed to be expanded in CA1, CA2, CA3, and CA4 and gyrus dentatus and there was space between such cells in the CA1 of El mice. Large ƒÁ-aminobutyric acid positive cells, which were located close to the gyrus dentatus in ddY mice, were not found in El mice. The number of ƒÁ-aminobutyric acid-positive cells was lower in El mice than in ddY mice. A greater number of glial fibrillary acidic protein positive cells was found in the area of the hippocampus in El mice than in ddY mice. These results suggest that El mice are genetically epileptic mice.