Title マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免

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熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免

疫応答の解析

Author(s) 渡邉, 弘之 Citation

Issue date 2006‑03‑24

Type Thesis or Dissertation

URL http://hdl.handle.net/2298/8125

Right

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学位論文

Doctor1sThesis

マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免疫応答の解析

（Analysisofimmuneresponseduringsepsisusingamunne modelofsepticperitonilis）

渡邉弘之 HiroyukiWatanabe

熊本大学大学院医学研究科博士課程外科系専攻整形外科学

指導：伊藤隆明教授指導：水田博志教授指導：高木克公前教授

２００６年３月

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学位論文

Doctor1sI11esis

論文題名：マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免疫応答の解析 (Analysisofimmuneresponseduringsepsisusingamurine

modelofsepticperitonitis）

著者名：

（単名）

渡邊弘之ＨｉｒｏｙｕｋｉWatanabe

指導教員名伊藤

水田高木

隆明教授博志教授克公前教授

審査委員名細胞病理学担当

微生物学担当病態情報解析学担当免疫職別学担当

裕章雄治元孝喜泰

由

屋池東村竹赤安西授授授授教教教教

２００６年３月

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４６９０１一一一１１一一一一一一一一一一一』Ｐ一一一一一一一一一一一一一一一『一一一一一一一一一一一一一一一一

一一一一一

』一一一一一一一■一一一一一一

一一一一一

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一

』一一』一

一一一一一』一一←一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一『一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一

一一一一一

一一一一一』一一一一一一一』一一一一一一一一一一一一一川一一一昨如一攪鮨』『洲畷

序論一一一一-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－１３敗血症---－---13 免疫機構とThl/Th2ﾊﾞﾗﾝｽｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰ---13 サイトカイン応答を介在する因子---15 研究１について－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－１９研究２について－－－－－一一一一-－－－－－－－－－－－－－－－－－--－－－－１９第Ｉ章

１２３４５

’’一’－１１１ＩＩ

第Ⅱ章実験材料および方法 ---20

Ⅱ－１ﾏｳｽｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰ－－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－２０

Ⅱ－２マウス敗血症性腹膜炎モデル---－－－－－２０

Ⅱ－３細胞分離一---－---22

Ⅱ－４invitroでの白血球の殺菌活性の評価一---23

Ⅱ－５細胞培養一一一一-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－２３

Ⅱ－６スーパーオキサイド産生一一-－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－２４

Ⅱ－７サイトカイン､ＭＰＯの測定一-－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－２５

Ⅱ－８血液生化学---－---25

Ⅱ－９ウエスタンプロット法一-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－２５

Ⅱ－１０免疫細胞化学－－－－－－－－－－---－---26

Ⅱ－１１フローサイトメトリー－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－-－２６

２

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Ⅱ－１２統計解析－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－---26

第Ⅲ章実験結果一-－－－－－－－－－－－－---28

Ⅲ－１研究１の結果---－---－---28

m－１－１マクロフアージによるサイトカイン、ケモカイン産生－－－２８ m－１－２マクロファージがＴ細胞に与える影響一-－－－－－－－－－－２８ m-1-3invitroでのマクロフアージの殺菌活性---－－－－－－－－－３１ m－１－４ＣＬＰにおける殺菌活性の差－－－－－－－－－－---31

m－１－５ＣＬＰにおける局所、全身での炎症反応一---－---34

m－１－６ＣＬＰにおける致死率一一一一一一-－－－－－－－－－－－－－－－－３４ m－２研究２の結果一一一-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－４１ m-2-1SOCS5TgマウスのＣＬＰに対する生存率改善一---41

m-2-2SOCS5Tgマウスにおける細菌除去能増幅一---41

m-2-3SOCS5Tgマウスにおける増幅された局所炎症一---45

ｍ－２－４ＣＤ４+Ｔ細胞移入による自然免疫応答増幅---49

m-2-5SOCS5TgマウスにおけるＴ細胞の`性質一---52

m－２－６SOCS5Tgマウスで弱められた腎障害---52

考察一一一一一一一一一一一－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－５７研究１について－－－－－－－－－－－－－－-一一一一一---57

研究２について一一一一一一－---－－－－５９第Ⅳ章 Ⅳ－１ Ⅳ－２結語---－---63 第Ｖ章

引用文献 ---－---一一一一一一-－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－－６４

３

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￣曰

要

敗血症は重篤な病気であり、その致死率は様々な研究が行われているにも関わらずこの数＋年改善していない。そこで、我々はマウス敗血症性腹膜炎モデルを用いて、敗血症の免疫機序を解明する事により敗血症の新たな治療への展望を開こうとしている。敗血症の宿主に起こるイベントとして特に我々は敗血症性腹膜炎中の自然免疫応答に注目した。すなわち、白血球の動態とそれに影響を与えるサイトカイン、サイトカイン応答を介在するJAK‐

ＳＦXＴ（januskinase-signaltransducerandactivator）経路、JAK-SFKT経路を制御するＳＯＣＳ（suppressorofcytokinesignaling）タンパクについて解析した。

また、従来獲得免疫に関わると考えられていたＴ細胞の自然免疫応答への介入について検討した。

それぞれ典型的なＴｈＬＴｈ２タイプの応答をするマウスであるC57BL/６と BALB/ｃでは、敗血症‘性腹膜炎による致死率が異なる印象がある。まず研究１では、両系統マウスのマクロファージの自然免疫応答の特徴を調べ、敗血症性腹膜炎に対する感受,性に差がある事を証明した。次にＳｍＴ６の活性化を抑制するＳＯＣＳ５に注目した。研究Ｚでは、ＳＯＣＳ５が敗血症性腹膜炎における自然免疫応答に与える影響を調べ、SOCS5のＴ細胞における過表示が宿主にとって有益に働いている事を示した。

研究１について簡潔に述べる。C57BL/６のマクロフアージはＬＰＳ

（lipopolysaccharide）もしくはMALP-2（macrophage-activatinglipopeptide-2）

刺激により、ＢALB/ｃに比べＴＮＦｑ（tumornecrosisfactorq)、ＩＬ（interleukin）

-12を多く産生した。C57BL/６のマクロフアージによるIL-1Z産生の増幅は、

CD4+Ｔ細胞によるＩＦNＹ（interferonY）産生を増加させ、IL-13産生を減少させた。ＬＰＳもしくはMALP-2刺激によりC57BL/６マクロフアージは殺菌分子であるライソゾーム酵素、ＮＯ（nitricoxide）を産生したが、ＢALB/ｃマクロ

ファージでは産生されなかった。殺菌活性はC57BL/６マクロフアージに比べ

４

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BALB/cマクロファージで障害されていた。ＣＬＰ（cecalligationandpuncture）

による敗血症性腹膜炎において、ＢALB/ｃは腹腔内浸出白血球が多く腹腔内サイトカイン、ケモカインレベルも高いにもかかわらず菌を除去できなかった。ＢALB/ｃでは血漿及び肝においてもサイトカイン、ケモカインレベルが増加し、急性期蛋白増加の見られる強い全身`性炎症が起こった。最後に、

BALB/ｃマウスはC57BL/６に比べＣＬＰでの致死率が高かった。このように、

マクロファージの自然免疫反応は両系統において差があり、その事がＴｈＬＴｈ２タイプの獲得免疫の分化に影響しているものと考えられる。C57BL/６マ

ウスは局所応答が優れているため全身の炎症が軽減し、敗血症による死に耐え得るように思われる。

研究２について簡潔に述べる。Ｔ細胞特異的にSOCS5が過表示された

SOCS5Tg(transgenic)マウスはＷＴ（ｗｉｌｄtype）マウスに比べ敗血症性腹膜炎中の致死率が低かった｡ｖｉｖｏでの実験でSOCS5Tgマウスの腹腔内IL-1Z､IFNY、

TNFαレベルはＷＴより増加し、腹腔内細菌負荷がSOCS5Tgマウスの方が有意に低いという結果から、SOCS5Tgマウスにおいて自然免疫応答が増幅にさ

れており、このため生存率が上昇したものと思われた。vitroでの好中球、マクロファージの殺菌活性は、SOCS5Tgマウスにおいて増幅されていた。

SOCS5Tgマウスから得たＣＤ4+Ｔ細胞をＴ､Ｂ細胞欠損RAG-2KO(recombination activatinggene2knockout）マウスに養子免疫伝達した結果、ＣＬＰ後の腹腔内サイトカインレベルはコントロールに比べ増加した。SOCS5TgのＣＤ4+Ｔ細

胞を移入されたマウスは殺菌能が増幅され、その結果ＣＬＰ後の生存率が改善した。このように、Ｔ細胞におけるSOCS5の過表示がＣＬＰによる敗血症１ｆｔ腹膜炎中の自然免疫を増幅させる事が証明された。

敗血症における自然免疫応答でのThl/Th2バランスの理解や新たに分かったＴ細胞の役割は、敗血症の管理を進歩させ、長く改善しなかった致死率を減少させる礎となるだろうと期待している。

５

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ＡＢＳＴＲＡＣＴ

Sepsisisasevereillness,anditsmortalityratehasnotimprovedoverthepastthree decades,whereasmanyprospectivestudieshavebeentriedThere,wemakeeffOrts topresentnewtherapeutichorizonsofinterventiontowardsepsis，usingaseptic peritonitismodelofmice、Ｖａｒｉｏｕｓｅｖｅｍｓｏｃｃｕｒｉｎｓeptichosts,weespeciallytook noticeoninnateimmuneresponseduringsepticperitonitisamongthemNamely，

weanalyzeddynamicstateofleukocytes,cytokinesthathaveimpactsonleukocytes，

JAK-STATOanuskinase-signaltransducerandactivator)pathwaythatmediates cytokineresponse,SOCＳ(suppressorofcytokinesignaling)proteinsthatregulate JAK-STATpathway

C57BL/６ａｎｄＢＡＬＢ/cmiceareprototypicaIThl-andTh2-typemousestrains respectively,andtheirsusceptibilityinsepticperitonitisappearedtobedifferentfrom eachother・Ｉｎｔｈｅｌｓｔｓｔｕｄｙ，ｗｅｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｆｉｍｃｔｉｏｎｏｆmacrophagesfromboth strainsanddemonstratedthedifferentcharacterscreatingalterationofsusceptibility tosepticperitonitisSubsequently，ｗｅａｔｔｅｎｄｅｄｔｏｔｈｅｒｅｇＵｌａｔｉｏｎｏｆＳＴＡT6 activationbySOCS5・Ｉｎｔｈｅ２ｎｄｓｔｕｄｙ，ｗｅｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆＳＯＣＳ５ｉｎｉｎｎａｔｅｉmmuneresponseduringsepticperitonitisanddemonstratedthatSOCS5 overexpressedinTcellsplayabeneficialroleinseptichosts、

Summarizinglststudy,macrophagesfromC57BL/６ｍiceproducedhigherlevels ofTNFq(tumornecrosisfactorq)ａｎｄｌＬ(interleukin)-12thanthosefromBALB/c miceafierstimulationwithMALP-２（macrophage-activatinglipopeptide-2，a syntheticTLR-21igand）ｏｒＬＰＳ（lipopolysaccharide，aTLR-41igand)．The augmentedIL-12productionbyC57BL/6macrophagesincreasedlFNY（interferonY）

and，incontrast,decreasedlL-13productionbyCD4＋Tcells・Onstimulationwith MALP-2orLPS,C57BL/6macrophagesproducedlysosomalenzymeandNO(nitric oxide),effectormoleculesfOrbacterialkilling,whereasBALB/cmacrophagesdid

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not・BactericidalactivityofBALB/cmacrophageswasimpairedrelativｅｔｏＣ５７ＢＬ/６macrophageswhencellswereinfectedwithlivebacteriaノ〃vjrro・Ina murinemodelofsepticperitonitisinducedbyCLP(cecalligationandpuncture)，

BALB/cmicefailedtofacilitatebacterialclearancerelativetoC57BL/６micedespite anaugmentedperitonealleukocyteinfiltrationthatwasassociatedwithincreased peritoneallevelsofcytokines/chemokines．ＢALB/cmiceexhibitedincreased plasmaandhepaticlevelsofcytokines/Chemokines，resultinginanexaggerated systemicinflammationasdeterminedbyacute-phaseproteinsFinally，ＢＡＬB/c micewerevulnerabletoCLP-inducedlethalityrelativetoC57BL/６ｍice・

Ａｌtogether，innateimmuneresponseofmacrophagesisdifferentbetweenthese mousestrains,whichmayaffectthedevelopmentｏｆＴｈｌａｎｄＴｈ２ａｄａｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｔhesestrainsReducedsystemicinflammatoryresponseinC57BL/６ｍｉｃｅｔｈａｔ mayresultfromaneminentlocalresponseappearstobebeneficialduringsepsis．

Summarizing2ndstudy,micewithaceu-specificoverexpressionofSOCS5inT cells(SOCS5transgenic＝SOCS5Tg)wereresistanttothelethalityrelativetothe WT(wild-type)ｍice・Thiswasmostlikelyduetotheenhancedinnateimmunityin SOCS5Tgmice,ａｓｂａｃｔｅｒｉａｌｂｕｒｄｅｎｉｎＳＯＣＳ５Ｔｇｍｉｃｅwassignificantlylowerthan WTmice・AccumulationofneutrophilsandmacrophageswasａｕｇｍｅｎｔｅｄｉｎＳＯＣＳ５Ｔｇｍｉｃｅ,aneventthatwasaccompaniedbyincreasedperitoneallevelsoflL‐

12,IFNYandTNFoLInvitrobactericidalactivitiesofmacrophagesandneutrophils wereenhancedinSOCS5Tgmice・BothneutrophilsandmacrophagesfromWT miceadoptedenhancedbacterialkillingactivitywhenco-culturedwithCD4＋Tcells fromSOCS5Tgmice,relativetoCD4＋TcellsfromWTmice．Ａdoptivetransferof SOCS5Tg-CD4＋TcellsintoTandB-ceudeficientRAG-2-/‐（recombination activatinggene-2knockout)miceresultedinaugmentedleukocyteinfiltrationand increasedperitoneallevelsoflL-12,ＩＦＮＹａｎｄＴＮＦｑａｆｔｅｒＣＬＲａｓｃｏｍｐａｒｅｄtothe controlsFurthermore，CLP-inducedbacterialburdeninＲＡＧ－２－/－miceharboring SOCS5Tg-CD4＋Tcellswassignificantlyreducedrelativetothecontrols・These

７

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findingsprovideevidencethatinterventionofSOCS5expressioninTcellsaffects innateimmunity,whichhighlightanovelroleofTcellsduringsepsis・

DevelopingagraspofThl/ThZbalanceandnovelfindingsofTcellsininnate immuneresponseduringsepsisprovidenewprospectthatprogressthemanagement ofsepsis,filrthermore,serveasafOundationfOrameliorationoflethality．

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発表論文リスト

1.Ｈ・Watanabe,Ｋ・Numata,Ｔ,Ito,KTakagi,ａｎｄＡ・Matsukawa InnateimmuneresponseiｎＴｈｌ‐andTh2-dominantmousestrains

ＳｈｏｄＭ２(5):460-466,2004

2.Ｈ・Watanabe,Ｍ,Kubo,Ｋ・Numata,Ｋ・Takagi,Ｈ・Mizuta,SOkada,Ｔ・Ito,ａｎｄＡ・

Matsukawa

OverexpressionofSuppressorofCytokineSignaling-5inTCellsAugmentslnnate lmmunityduringSepticPeritonitis

JhIi""""oL177:8650-8657,2006

3.Ａ､Matsukawa,SKudo,Ｔ・Maeda,Ｋ､Numata,Ｈ・Watanabe,Ｋ､Takeda,SAkira，

andTIto

Stat3inResidentMacrophagesasaRepressorProteinoflnHammatoryResponse Jhlz〃""oL175(5):3354-3359,2005

４Ｋ.Numata,MKubo,Ｈ・Watanabe,Ｋ・Takagi,Ｈ・Mizuta,Ｓ・Okada,Ｓ・LKunkel，

Ｔ､Ito,ａｎｄＡ､Matsukawa

OverexpressionofSuppressorofCytokineSignaling-3inTcellsExacerbates Acetaminophen-inducedHepatotoxicity

JbIj7Z"0""ＯＬ(inpress）

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謝辞

本研究は、松川昭博教授（岡山大学大学院医歯薬総合研究科病態探究医学分野）のご指導のもとに実施しました。研究の機会を賜り、温かいご指導を頂きました事に心より感謝申し上げます。

研究を実施するにあたり、伊藤隆明教授（熊本大学大学院医学薬学研究部機能病理学分野)、高木克公名誉教授、水田博志教授（同運動骨格病態学分野)、安東由喜雄教授（同,情報解析学分野）にも多大な御指導を頂きました。

心より感謝申し上げます。

また、沼田亨祐先生（機能病理学分野，現国立病院機構熊本医療センター整形外科)、前田貴子氏、加賀矢問元子氏、工藤信次氏（機能病理学分野）

にも、大変お世話になりました。

本研究で使用したＳＯＣＳ５トランスジェニックマウスは久保允人先生（理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センター）より、RAG－２ノックア

ウトマウスは岡田誠治教授（熊本大学エイズ学研究センター予防開発分野）

より御供与いただきました。

御協力を頂きましたすべての方々に、心より御礼申し上げます。

最後に、私の心の支えである家族と両親に、感謝の気持ちを記したいと思います。

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略語一覧

ＡＰＦ：aminophenylfluorescein

BSA：bovineserumalbumin

ＢＵＮ：bloodureanitrogen CFU：colonyfOrmingunit

CLP：cecalligationandpuncture

conA：concanavalinA

ELISA：enzyme-linkedimmunosorbentassaｙ

ＦＣＳ：fetalcalfserum

HRP：horseradishperoxidase lFNY：intelferonY

IL-10,12,13：interleukin-10,12,13 JAK:januskinase

LPS：lipopolysaccharide

MALP-2：macrophage-activatinglipopeptide-2 MIP-2：macrophageinflammatoryproteiｎ－ＺＭＰＯ：myeloperoxidase

NO：ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ

ＰＢＳ：phosphatebufferedsaline PF：peritonealHuid

RAG：recombinationactivatinggene

RPMI1640：RosewellParkMemoriallnstituel6４０培地ＳｍｄＩＴ：signaltransducerandactivatoroftranscription SOCS：suppressorofcytokinesignaling

Tｇ：transgenic

TLR：toll-likereceptor

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TNFα：tumornecrosisfactorq

ＴＳＡ：tryptosesoyagar ＷＴ：ｗｉｌｄtype

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Ｉ序論

１－１敗血症

敗血症は主に肺、尿路、腹部から感染し、毒素産生細菌の血流への流入により引き起こされる重篤な感染症であり予後不良の疾患で、手術や外傷後の

ICUでの死の主要な原因である(1-3)。敗血症は侵入した病原体を不活化し除去する為に強い局所炎症で始まる(4)(5)。感染に対する最初の防御線が自然

免疫応答であり、そこでは好中球やマクロファージの様な白血球が必要不可

欠で、これらの細胞が感染微生物を効果的に除去する(6)。しかし炎症反応が

過剰であると、それは病的な反応となり宿主に損傷を与え死に至らしめる。

すなわち炎症、抗炎症のバランスが重要である(7)。

文献によって多少の違いはあるが、敗血症の致死率は高くこの数十年変わ

らない。特に敗血症性腹膜炎の致死率は60-80％とされている(8,9)。そこでステロイドや抗エンドトキシン抗体治療、抗サイトカイン療法(10)などが試

みられてきたが、いまだ十分な効果は得られていない。現在でも様々な研究が行われているが、その中の一つに当講座前助教授の松川らが行っている、

マウス敗血症の確立されたモデルであるＣＬＰがある(11)。我々は、ＣＬＰによ

り引き起こされた敗血症`性腹膜炎を解析する事により、敗血症の治療の新たな展望を開こうと試みた。

１－２免疫機構とThl/Th2バランス

免疫機構は自然免疫と獲得免疫からなり、様々な感染微生物から体を守る。

自然免疫は非特異的であり、感染を小局所にとどめ宿主を守る第一の防御線として働く(5)。獲得免疫は特定の病原体に対し特異的でありより強力で、二

つのタイプの応答、すなわちＴｈＬＴｈ２という異なるサイトカイン分泌パタ

１３

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_ンに基づいた分類をされている(1Z，１３)。Thl、Ｔｈ２とはヘルパーＴ細胞の

サブファミリーであり、それぞれの分泌するサイトカインをタイプ１，２サイトカインと呼ぶ。またこの分泌パターンの偏りによってタイプ１，２応答と呼ぶ。エピデンスが示すように敗血症においてタイプ１サイトカインであるIL-12、タイプＺサイトカインであるIL-10、１３を含むサイトカインが様々

な炎症反応を制御している(14-17)。Ｔｈｌは炎症を促進する方向に働き、Ｔｈ２

は炎症を抑制する方向に傾く。Thl/Th2バランスは感染症を含む多くの病気

の転帰にとって重要である事が示されてきた(18)。これらのサイトカインの多くはJAK-Sm4XT経路を介して生物学的機能を表す(19）（20)。またサイトカ

イン信号伝達を抑制的に制御するＳＯＣＳのようないくつかの機序が最近同定されてきた。

マウスのThl/Th2バランスにおいて遺伝的背景も重要である(２１，２２)。

C57BL/６のＴ細胞は優先的にＴｈｌサイトカインを産生(IFNｇ↑、ＩＬ－４↓）し、

BALB/ｃのＴ細胞はＴｈ２サイトカインを多く産生(IFNｇ↓、ＩＬ－４↑)する(23)。

このようなＴ細胞の応答はリーシュマニア症でも観察された(24,25)。このよ

うにC57BL/６，ＢALB/ＣはそれぞれＴｈＬＴｈ２優勢マウスとして認められている。異なるＴ細胞応答に加えて最近のvitroの調査で、これらの系統のマウ

スのマクロフアージがＬＰＳに対し異なる応答をする事が証明された(23,26, 27)。マクロフアージは好中球と共に病原体除去における中心的な役割を果たし感染症において必要不可欠なのものなので(5,28,29)、これらの系統のマウ

スの間で細菌感染に対する自然免疫応答が異なる事が推測される。

その後、感染性腹膜炎を用いた一連の検討から、従来、獲得免疫系に貢献するとされるタイプ１.タイプ２サイトカインが、腹膜炎時の自然免疫系においては感染局所で細菌の排除に働くものと、全身での病的炎症の抑制に働

くものの、二つの機能的なサブグループに分類されることを示されてきた。

すなわちマウス敗血症１性腹膜炎モデルにおいて、腹腔IL-12(typeｌ促進サイトカイン)は細菌除去において有益で(17)、腹腔IL-10や臓器に特異的に検出されるIL-13(type2サイトカイン)は全身臓器炎症を調節する機能を持つ(15,16)、

1４

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という事が示された。またｖｉｖｏでのTNFα、IL-16(促進)(10)、IL-4、IL-10(抑制）（30）（31）の阻害により敗血症動物モデルの生存率が改善したという事実

が示すように、免疫機構において炎症促進、抗炎症サイトカインのバランスが重要である。

１－３サイトカイン応答を介在する因子

ｓｍ４Ｉｒはサイトカインレセプターとサイトカインによる遺伝子転写を直接

つなぐ因子である(32)。図１．１の如く、一般にサイトカインはその受容体に

結合し受容体二塁化を導き、ＳTATの活`性化に続いて受容体結合ＪＡＫのタイロシンリン酸化が起こる。リン酸化ＳＴＷＴは二量体を形成し核に移動して、

多くの標的遺伝子の転写を活性化する。その中にはJAK-ST)ＡＩＴ信号伝達阻害蛋白のＳＯＣＳも含まれる。ＳＯＣＳはJAK、ＳＴＷＴに結合しサイトカインの信号伝達を抑制している。

SmAXTのうちＳｍ４ＩＴ３、SmdKI4、STAT6はそれぞれIL-10、IL-12、IL-13への

応答を調節している(32）（33)。我々はこれまで、マウス敗血症性腹膜炎モデ

ルを用いて、マクロファージと好中球のＳｍＴ３遺伝子欠損マウスがサイトカ

イン産生増幅を通した強い局所､全身炎症により死にやすい事を示した(34)。

前に述べたように、IL-12、IL-13はそれぞれ細菌クリアランスの増幅と臓器

損傷の調節という重要な役割を持つ(17）（15)。Stat4-/－，Stat6-/-マウスを用い

た感染性腹膜炎モデルの実験にて、Stat4-/－，Stat6-/-マウスがそれぞれ、細菌クリアランス阻害、臓器損傷増幅へ導かれるという仮説とは逆に、Stat4-/-マウスで臓器損傷が減り、Stat6-/‐マウスで細菌クリアランスが増幅され、どち

らもＣＬＰ後の生存率が改善する事が示された(３５)。すなわち、敗血症における自然免疫の局所(腹腔)と全身(臓器)のＳｍ４ＩＴタンパクを介したサイトカイン

バランスが重要である事が示された。このようにＳｍＡＩＴタンパクは敗血症`性腹膜炎における自然免疫において重要である。

免疫機構における抑制系の働きもまたバランスの取れたサイトカイン応答

1５

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にとって重要である。サイトカイン信号伝達を抑制的に制御するいくつかの機序が最近同定されてきた。サイトカインシグナリングのフィードバック阻

害因子としてＳＯＣＳが同定され(36）（37)、敗血症において抑制的役割を果たしているタンパクである事が知られてきた(36）（38)。ＳＯＣＳタンパクはＳＨ－Ｚ

基を持つ細胞質タンパクファミリーであり、JAK-ST(Ｔ経路を介して働き、

サイトカインからの信号伝達を減じるネガティブフィードバックループを作っている（図1.2)。これまでの研究でSOCS3はＴｈ２細胞で高いレベルで表

示され、STAT4活性化を抑制し(39)、SOCS5はＴｈｌ細胞において優先的に発現し、ＳＰＩＴ６活,性化を抑制することによりＴｈ２免疫応答を阻害している(40）

事が示されてきた。

1６

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１－４研究１について

Ｔｈｌ優勢マウスであるC57BL/６とＴｈ２優勢マウスであるBALB/ｃそれぞれのマクロファージの自然免疫応答における機能的な差はまだ良く分かっていない。我々はThl、ＴｈＺマウスのマクロファージの自然免疫応答の特徴を解析しようとした。我々はBALB/ｃのマクロフアージがC57BL/６に比べ殺菌能が障害されている事を証明した。相応してＢALB/ｃはC57BL/６に比べＣＬＰによる敗血症性腹膜炎において細菌を除去できなかった。このためBALB/ｃ

はＣＬＰ

による生存率が高かった。Ｔ細胞の応答に加えて、自然免疫細胞能力も両系統で異なるように思われた。この差は特異的病原体に対し防御を行う獲得免疫に影響を与えているかもしれない。

１－５研究２について

自然免疫におけるＳＯＣＳ５の役割はほとんど知られていない。Ｔ細胞は腹腔内が安定した状態においても存在するので（我々のフローサイトメトリーに

よるデータではＴｈｙｌ２陽性細胞が11-16％)、Ｔ細胞内のSOCS5はタイプ１

応答が重要な敗血症性腹膜炎における自然免疫に影響を与えるだろう。我々はこれまでの仕事を広げ敗血症における自然免疫でのSOCS5の役割を探求

した。この目的の為に、Ｔ細胞特異的にSOCS5が過表示されたマウス

（SOCS5Tg)を使用した(40)｡我々はこのマウスにCLPを行い､Ｔ細胞のSOCS5

が自然免疫応答を増幅させる事により敗血症性腹膜炎から宿主を守る有益な役割を果たしている事を証明した。このように、自然免疫応答はＴ細胞、部分的にはSOCS5により制御されうる。

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Ⅱ実験材料および方法

１１－１マウス

C57BL/６，ＢALB/c、ＩＣＲはCharlesRiverJapanで購入した。SOCS5Tgマウス（Ｔ細胞においてSOCS5が過表示されている）（40)、RAG－２ノックアウト

マウス（RAG-2KO；Ｔ細胞、Ｂ細胞が欠損している）はC57BL/６系統のマウスで、それぞれ理化学研究所久保允人先生、熊本大学エイズ学研究センター予防開発分野岡田誠治教授より頂いた。研究２のＷＴとしてC57BL/６を用いた。これらのマウスを熊本大学生命資源研究・支援センター動物資源開

発研究部門CenterfOrAnimalResourcesandDevelopment,KumamotoUniversity

で飼育、繁殖し、生後６～８週の雌を使用した。

１１－２マウス敗血症’性腹膜炎モデル

CLPにより敗血症を誘発した(11,29)。CLPとは、まず麻酔をかけ盲腸を露

出し絹糸で縛ってその遠位側を注射針（研究1では21ゲージ、研究2では18ゲージ）で穿刺する。盲腸を腹腔内へ戻しステープルで閉創する（図2.1)。脱水予防に生食1ｍl皮下注し覚醒するまでヒートパッドに乗せておく。このよ

うにして腸管内から細菌が漏出する事により敗血症性腹膜炎が引き起こされる。

それぞれの実験でCLP施行後、７日間の生存率を観察した。

また、CLP後様々な時間で血液を採取し屠殺した。更に腹腔内を生理食塩水Zmlで洗浄し洗浄液は回収した（腹腔洗浄液＝peritonealfluid：ＰＦ)。ＰＦ、血液l0ULをCFU（colonyfOrmingunit）評価に用いた。ＣＦＵによる細菌負荷の評価は、それぞれのマウスのPF及び末梢血101mを連続的に生食で希釈し､５１m(研

究2ではl0Ul）をTSA（tryptosesoyagar）血液培地にまき、一晩37℃で培養し

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(23)

(24)

好気性菌のコロニー数を数え、そのデータをＣＦＭＵｌ（10p,l）で表した。残ったPFを遠心分離した上清と血液から精製した血清を-80℃で保存しサイトカイン、ケモカイン測定に用いた。細胞のペレットは生食で溶いてヘモサイトメーターで細胞数を数えた。細胞の一部をサイトスピン後DiffPuick染色し細胞分画を解析した。残った細胞のペレットを-80℃で保存した。また、

肝と腎を摘出し、液体窒素で急速凍結し-80℃で保存した。組織の一部は4％

バラホルムアルデヒドで固定しヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色を行った。

この他に、研究1ではICRマウスからCLPで得られた生菌10億CFU/S00Ulを C57BL/６，ＢALB/cマウスの腹腔内に注入し生存率を観察した。研究2では通常のCLPの他に、RAG-ZKOマウスの腹腔内にSOCS5TgもしくはＷＴのＣＤ4+Ｔ細胞300万を移入した直後、上記の如くCLPをおこなった。

１１－３細胞分離

マクロファージ

研究1では4％ＴG(thioglycollate)１ｍl腹腔内注射し96時間後腹腔浸出細胞を回

収した。細胞は95％以上がマクロファージで、生細胞の割合はトリパンブルー染色にて96％以上であった｡研究2では未処置マウスの腹腔細胞を回収した。

これらを10％FCS（fetalcalfserum）入りRPMI1640（RosewellParkMemorial lnstituel640）で37℃、１時間培養し付着細胞をマクロフアージとして使用し

た。

好中球

４％ＴＧ１ｍｌ腹腔内注射４時間後の腹腔浸出細胞を回収しFicollgradient centrifUgationで好中球を単離した。その純度は94％以上で、生細胞の割合は

トリパンブルー染色にて97％以上であった。

2２

(25)

CD4T細胞

未処置マウスの脾を回収し単細胞の懸濁液にした。０．１NNH4Clで赤血球を除去し脾細胞をRPMI1640で3回洗った。MACS法（MiltenyiBiotec,Bergisch‐

Gladbach,Germany)を用い脾細胞からＣＤ4+T細胞を精製した。生細胞の割合は

97％以上で、その純度はフローサイトメトリー解析で常に95％以上だった。

II-4invitroでの白血球の殺菌活性の評価

vitroでのマクロファージの殺菌活性を見るためにclassicalCFUassayを小修正した方法を用いた(34,41)。上記の方法で回収したマクロフアージ、好中球を10％FCS入りRPMI1640（抗生剤無し)で懸濁し24ウェルプレートに300万/ウ

ェルまいた。そこにCLP施行後のマウスから得られた生菌100万個/ウェルを

感染させた。コントロールウェルには細菌のみ入れた(細胞無し)。５％CO2インキュベータで4時間培養後、プレートを-80℃で凍結し溶かして細胞を破裂させた。これにより細菌の生存に影響がない事は予備実験で証明済みである。

この溶解液を希釈しTSA血液培地にまいて一晩37℃で培養し、好気`性菌のコロニー数を数えた。殺菌活性を％bacteriadeath（＝（コントロールのCFU-細胞入りウェルのＣＦＵ）／コントロールのＣＦＵ）で表した。研究2ではCD4T細胞存在下（100万/ウェル）でのマクロファージ、好中球の殺菌活性を上記と同様の方法で実験した。

１１－５細胞培養

研究１

C57BL/6、ＢＡＬB/cマウスのマクロフアージを24ウェルプレートに200万/、ｌ

入れ､５％ＣＯ２インキュベータ内で10％FCS、グルタミン､抗生斉１１入りRPMI1640 にＴＬＲ４（toll-likereceptor4）リガンドであるLPS(1Ug/m1,0111,Ｂ４，DifCo Laboratories，Detroit，Ｍ１)もしくはMALP-2（10,9/mLAlexisBiochemicals，

2３

(26)

Montreal，Canada)を加え、２４時間もしくは48時間培養した。培養上清中のサ

イトカイン、ケモカイン、ライソゾーム酵素放出、ＮＯの産生を測定した。

ライソゾーム酵素放出は過去に記述された方法を用いて13-グルクロニダーゼ活性で評価した(42)。ＮＯはＣolorimetricenzymaticNOassaykit（OxfOrd BiomedicalResearch,Oxford，Ｍ１)を用いＮＯの安定した最終産物であるnitriteと

nitrateで評価した。

２４ウエルプレートに脾細胞(500万/ウェル)もしくはCD4+T細胞(100万/ウェル)をまきconA(concanavalinA3Ug/ml)とC57BL/６，ＢALB/cマウスマクロフア

ージのLPS刺激上清を加え培養した。幾つかのウェルにはヤギ抗IL-12抗体

(R&DSystems,Minneapolis,ＭＮ)もしくはコントロールIgG(1Ug/ml)を加えた。

72時間後の培養上清を回収し、遠心にかけ得られた上清をサイトカイン、ケモカイン測定に使った。

研究２

２４ウエルプレートにマクロフアージ100万/、lとＣＤ４Ｔ細胞50万/ml入れ、５％

CO2インキュベータ内で10％FCS、グルタミン、抗生剤入りRPMI1640にLPS を加え、またある実験ではこれに抗マウスIFNYIgGもしくはコントロールIgG を加え、２４時間培養しその上清を回収した。回収した上清を用いサイトカインを測定した。

いくつかの実験では、Dualchambertranswellcultureapparatusを用いマクロフアージを下室、ＣＤ4+T細胞を上室で培養した。

１１－６スーパーオキサイド産生

活性酸素検出用試薬のＡＰＦ（aminophenylFluorescein、第一化学薬品株式会社）を用いてスーパーオキサイド産生を測定した(43)。簡潔に述べると、マクロフアージ、好中球（200万/ｍｌフェノールレッド無しRPMI1640）をLPS

（100,9/ml)、ＡＰＦ（１，mol/l）を入れ24時間後の培養上清を回収した。スー

2４

(27)

パーオキサイド産生をFluorescenceMicroplateReader（Bio-T1eklnstruments,Inc，

Winooski，ＵＳＡ）を用い分光光度法で測定した。励起波長は490,ｍ、蛍光波長は515nｍとした。

１１－７サイトカイン、ＭＰＯの測定

サイトカインをsandwichELISA(15,29)で定量した。－次抗体、二次抗体、

リコンピナントサイトカインはR&DSystems（Minneapolis,ＭＮ）から購入した。腎ＭＰＯレベルはELISAkit（CalbiochemSanDiego,ＣＡ）を使って測定した。腎を0.1％TYitonX-100、コンプリートプロテアーゼインヒピター（Roche，

MannheimGermany）入りPBSで均質化し、遠心分離後上漬を回収した。この抽出液のタンパク濃度をprotein-dyebindingassay（Bio-RadHercules,ＣＡ）を

用いて測定した。

Ⅱ－８血液生化学

血清アミロイドＡ蛋白（SAA)をhumanassaysystemsで測定した。血漿フイブリノゲンを抗マウスフィブリノゲンIgG（NordiclmmunologicalLaboratory，

Tilburg，Netherlands)、マウスフィブリノゲン（Molecularlnnovationslnc.，

Southfield,Ｍ１)を用いsandwichELISAで測定した。血清BUN、クレアチニンを

標準的手技で測定した。

１１－９ウェスタンプロット法

白血球をLaemmliバッファーに溶解（100万細胞/Soul)、超音波破砕、煮沸、

SDS-ポリアクリルアミドゲル（101m）上で断片化し、ニトロセルロース膜に転写した。そのニトロセルロース膜5％スキムミルク入りＴBST（TBS＋0.1％

TWeen-20）で1時間室温でブロッキングし、STAT6もしくはタイロシンリン酸

2５

(28)

化SmA【T6に対する抗体（CellSignalinglnc,Beverly,ＭＡ）とともに4℃で一晩培

養した。ニトロセルロース膜をTBSTで洗浄、HRP抗体とともに1時間室温で

培養、化学発光システム（CellSignaling）で可視化し写真に撮ってデジタル

化、バンドの濃度をＮＩＨイメージで測定した。

11-10免疫細胞化学

CLP24時間後の腹腔浸出細胞をサイトスピンにかけすぐに100％メタノール

で固定した。そのスライドを0.3％H202入りメタノールで内因性ぺルオキシダ

ーゼをブロッキングした後、TBSで再水和し10％正常ヤギ血清を用い1時間室

温でブロックした。これを抗タイロシンリン酸化抗体（CellSignaling）もしくはコントロールウサギIgGを加えた1％BSA入りTBSで一晩4℃で培養した。

スライドをTBSTで洗った後、HRP標識デキストランポリマー（EnVisionplus，

Peroxidase:DakoCytomatioLCarpinteria,ＣＡ）と結合した抗ウサギIgGとともに 30分室温で培養した。洗浄後ジアミノベンジジン（Sigma,StLuis,ＭＯ）で反応させた。対象にヘマトキシリンで染色した。

１１－１１フローサイトメトリー

未処置ＷＴ、SOCS5Tgマウスの腹腔内細胞を回収し、２％FCS、0.1％アジ化ナトリウム入りPBSに浮遊させた（細胞100万/ml)。細胞をマウスCD4、CD8、

CD44、CD6ZL、ＣＤ6９（BDPharMingen,SanJose,ＣＡ）特異的モノクローナル抗体で染色した。染色した細胞をFACScalibur（BDBiosciences,SanJose,ＣＡ）

を用いて解析した。

Ⅱ－１２統計解析

統計学的有意差をANOWLで解析した｡サバイバルとCFUはそれぞれlog-rank

２６

(29)

テストとMam-Vmtneyテストで行った解析した。ｐ〈

定した。全ての数値は、平均±標準偏差で表示した。

p<0.05を統計学的有意と判

2７

(30)

Ⅲ実験結果

111-1研究１の結果

１１１－１－１マクロファージによるサイトカイン、ケモカイン産生

C57BL/６とBALB/ｃのマクロファージ活性の差を比較するために、マクロフアージをＬＰＳもしくはMALP-2で刺激した。図３．１の如くLPS、MALP-2 刺激によりC57BL/６マクロファージはTNFα、IL-12をBALB/ｃマクロフアージより有意に多く産生したが、抗炎症性サイトカインIL-10は変わらなか

った。これらのデータはこれまでの報告と同じで(23）（26）（２７)、C57BL/６マクロファージがBALB/ｃマクロファージよりtype-1サイトカイン産生が増幅

されている事が示された。

'１１－１－２マクロフアージがＴ細胞に与える影響

IL-12は早期自然免疫と続いて起こる獲得免疫の機能的掛け橋をしている

(44)｡図３．１に示した如くIL-12産生はC57BL/6マクロフアージの方がBALB/ｃ

マクロフアージより高い。そこで我々はこのマクロフアージのIL-12産生の違いがＴ細胞によるサイトカイン産生に影響を与えるかどうか調べた。

C57BL/６，ＢALB/ｃの脾細胞をＣｏｎＡ刺激下にC57BL/６，ＢALB/ｃマクロフア

ージのＬＰＳ刺激培養上清(C57BL/６MF-SUP、BALB/cMF-SUP)と共に培養した。C57BL/6、BALB/cマクロファージはＬＰＳ刺激でIFNY、IL-13を産生できなかった(図無し)のに対し、図3.2Ａに示したようにC57BL/６MF-SUPで刺激した脾細胞はBALB/cMF-SUPで刺激したＴ細胞より多くIFNYを産生し､IL-13 産生は逆に低かった。ＢALB/ｃから得たＣＤ４Ｔ細胞を用いた同じ実験でも同

様の結果が得られた(図3.2B)。ＢALB/cMF-SUPに比べC57BL/6MF-SUPで

2８

(31)

図3.1 ^ＴＮＦａ

（一［巳ｍｅ＄眉】○民。 2０

1０ Mcdium LPSMALP-2 IL-12

（一日へ“Ｓｍ⑭昌署◎罠。

４

２

■~~￣

Mcdium LPSMALP-2

IL-10

（｛Ｅヘ四ｓ＄■運。萬。

1０

0.5 Medium LPSMALP-2

C57BL/6マウスのマクロフアージによるサイトカイン産生 (□）、C57BL/６（■）マウスの腹腔マクロファージをLPS

ＢＡＬＢ/C、

BALB/ｃ（□）、C57BL/６（■）マウスの腹腔マクロフアージをLPS

（1ｍｇ/ｍＬ）もしくはMALP-2（long/ｍＬ）で37℃、２４時間刺激。培養中のTNFα､IL-12､IL-10を損U定した｡p<0.05,p<0.01､〃<0.0001｡ ^培養上清

2９

(32)

図3２

IL-13

ＡＩＦＮＹ

＊ ^ｎs．

「。

^＊

^1０

、

0３ （一日へｍｓｍｏ巨星◎罠①

0.2 ０５

0１ ＢＡＬＢ/ＣＣＳ７ＢＵ６ＢＡＬＢにC57BL/６ＢＡｌＢ/cCS7BL/６

Splccncells ^BALB/ｃ ^{Ｃ５７ＢＤ６} Ｍ中soupBALB/cC57BD6BALB/ｃＧｉ７ＢＬ/６

ＢＩＦＮＹ、､1３

ｎＳ＊＊＊

｢］

ｎs．

、

0０３ _０４

（一目へ函ｓ８臣一二．忌○

００２

0３

００１

０２

￣■■-－

CS7BU6

■

＋

BＡＬＢに CS7BIﾉ６

■

＋

BＡＬＢに

Ｍ○soup

anU-IL-l21gG ^＋ ^＋

マクロフアージの差は、Ｔ細胞によるThl、Th2サイトカイン産生に影響を与える

BALB/c、C57BL/6マウスの腹腔マクロファージをIPS（1ｍｇ/ｍＬ）で 37℃、２４時間刺激し培養上清を回収。

（Ａ）ＢALB/c、C57BL/6マウスの脾細胞をconA（3ｍｇ/ｍＬ）と回収した培養上清で刺激。

（B）ＢALB/cマウスの脾細胞から得たCD4+T細胞をconA（3ｍｇ/ｍＬ）、

回収した培養上清、抗IL-121gGもしくはコントロールIgG

（1ｍｇ/mL）で刺激。７２時間後培養上清を回収し、IFNYとIL-13を測定

した。点線はメデイウムのみでのデータを示している。培養上清中のTNFα、IL-12、L10を測定した。

*p<005,＊p<0.01.

30

(33)

の刺激の方がＩＦNYレベルを増加させる傾向にあり、一方IL-13レベルは BALB/cMF-SUPに比べC57BL/６MF-SUP刺激の方が有意に低かった。興味深い事に抗IL-12抗体を投与すると、C57BL/6MF-SUP刺激群では劇的なIFＮＹ産生の低下もしくはIL-13産生の増加が見られたがBALB/cMF-SUP刺激群では有意な変化は見られなかった。C57BL/６のＣＤ4+Ｔ細胞を使った実験で

も同様のデータが見られた(図無し)。この結果、C57BL/６マクロフアージに

よるＴｈｌ促進サイトカインIL-12産生増加は、Ｔ細胞によるサイトカイン産生に影響を与えていると言う事を示唆している。

III-1-3invitroでのマクロフアージの殺菌活性

次に両系統のマクロファージの殺菌能を調べた｡腹腔マクロファージのLPS、

MALP-2刺激培養上清中の殺菌分子であるライソゾーム酵素(６－グルクロニダーゼ)放出、ＮＯ産生（45)を測定した。図３．３に示したようにC57BL/６マクロ

ファージは刺激により6-グルクロニダーゼ、ＮＯを産生したが、ＢALB/ｃマクロファージは産生しなかった。この事はBALB/ｃマクロファージの殺菌能が低下している事を示唆している。次に両系統のマクロファージの殺菌活性を vitroで評価した。C57BL/６とBALB/ｃのマクロフアージにＣＬＰでC57BL/６とBALB/ｃから得た生菌を感染させた。その結果、いずれの生菌を感染させてもマクロフアージの殺菌活性はC57BL/６に比べＢALB/ｃの方が弱かった。

このようにＢALB/ｃマクロフアージの殺菌活I性はC57BL/６マクロフアージに比べ障害されていた。

ＩＩＩ－１－４ＣＬＰにおける殺菌活性の差

マクロファージはＣＬＰによる敗血症性腹膜炎を含む感染症において、細菌

の除去に必要不可欠である(28）（29)。ここまでに述べた所見は、ＣＬＰにおい

てＢALB/Cの細菌除去が障害される事を示唆している。図３．４に示すように、

3１

(34)

図３３

ＡＣ

7５ 1００

一百

己（鼠（さ）ら自ら○句⑪日ヨ】

（百口｛叩二）①由巴日日己。■乱‐』

5０ 5０

■r■

2５

0 ＭｅｄｉｕｍＬＰＳＭＡＬＰ－２ BＡＬＢ/cC57BL/６

Ｂ，

1００

択口ｎ

Ａ：

■一再

弓 300 （ざ）ら宮疸。③即ロヨ向凹

（三二）の』ロ菖二巴四三

5０

200 ＭｅｄｉｕｍＬＰＳＭＡＬＰ－２０ BＡＬＢ/cC57BL/６

MLB/c、C57BL/6マウスのマクロフアージの殺菌活性

BALB/ｃ（□）、C57BL/６（■）マウスから腹腔マクロファージを回収した。

（Ａ、Ｂ）マクロファージをLPS（1ｍｇ/ｍＬ）もしくはMALP-2

（long/mL）で24時間（B）、４８時間（Ａ）刺激した。培養上清中のライソゾーム酵素放出（Ａ、６－グルクロニダーゼ）とＮＯ産

生（Ｂ）を測定した。

（ＣＤ）マクロフアージにBALB/ｃ（C）、C57BL/６（Ｄ）マウスから起こした細菌を感染させ、殺菌活性を調べた。

幼く００５，＊p<001。

3２

(35)

図3.4

1０８ 107 Ｏ

￣￣

蕗揖淨、ロー口山国ロ］■且［１ｍへ口阻、

1０６ 1０５ ^ＣＯ

1０４

● ●●

ＣｏｏＣＯ

1０３

^￣

＊

● ●●

1０２ ●

0 BＡＬＢ/ｃＣ５７ＢＬ/６

CLPにおける腹腔内の細菌負荷 CLP18時間後の腹腔洗浄液を回収

CLP18時間後の腹腔洗浄液を回収（○：ＢＡＬB/c、●：C57BL/6）。

サンプル5mlを段階的に希釈しTSA血液寒天培地に撒いた。横線は平均CFUを表している。＊p<005。

3３

(36)

CLP１８時間後の腹腔内細菌数はC57BL/６に比べＢALB/ｃの方が多かった。平均値で言うとBALB/cの方が約1000倍多かった。このようにＢALB/cマウス

はＣＬＰにおいてうまく細菌を除去する事ができなかった。

ｍ－１－５ＣＬＰにおける局所、全身での炎症反応

ＣＬＰにより腹腔内に白血球が浸入し、宿主は細菌を除去する。両系統マウスの白血球浸入を見た。図３．５の如くＣＬＰ後の好中球、マクロファージの浸入はC57BL/６に比べＢALB/ｃの方が多かった。サイトカインレベルを測って

みると、腹腔内のTNFα、IL-12、IFNYはC57BL/６に比べＢALB/ｃで有意に多く産生された(表3.1)。ＣＸＣケモカインMIP-2、ＫＣ、ＣＣケモカインMCP-1 も同様にBALB/ｃで高かった(表3.1)。増幅した局所の炎症は強い全身の応答

を導くだろう。表３．２では血漿でのサイトカイン、ケモカインレベルを測り、

TNFα以外が腹腔内と同様ＢALB/Cで多く産生される事を示した。加えてＣＬＰ

の主な標的臓器である肝(34）（35)内のサイトカイン,ケモカインレベルもやはり、C57BL/６に比べＢALB/ｃの方が高かった(図3.6)。次に全身の炎症の重症度を急性期蛋白を用いて評価した(46)。SAA、フイブリノゲンともC57BL/６に比べＢALB/ｃで劇的に増加した(図3.7)。このようにＢALB/ｃマウスでは局

所と全身の炎症反応が増加した。この事は生存率に影響するだろうと思われる。

ＩＩＩ－１－６ＣＬＰにおける致死率

これらのマウスのＣＬＰ後の生存率を調べた。図３８Ａの如く、ＣＬＰ施行後 BALB/ｃマウスの生存率はC57BL/６マウスに比べ有意に低かった。ＢALB/ｃマウスは３日目までに全て死んだのにC57BL/６マウスは５６％が７日目まで生存した。この生存率の差はそれぞれのマウスの細菌叢が違うからかもしれない｡この可能性を排除するためにICRマウスから得た生菌をBALB/c､C57BL/６

3４

(37)

マウスに腹腔内注射し生存率を見た。図3.8Ｂの如くＢALB/ｃマウスは100％

死んだのに対しC57BL/６マウスは３８％しか死ななかった。この結果、細菌叢の違いに関係なく、ＢALB/ｃマウスの方がC57BL/６マウスよりもＣＬＰにより死にやすい事が証明された。

3５

(38)

図3.ｓ

NeutrophiIs Macrophages

（ｂ『蔦。へら貝）＄民○○出口の曰 T＊

Tt

10

５５

､＝

０

０ ￣￣￣

0 ６

TimealIerCIP(h）

0 ６ 1８

TimealierCLP(h）

1８ CLPにおける腹腔内白血球浸入

CLP6時間、１８時間後、腹腔内に浸入した好中球、マクロフアージを数えた。○：ＢＡＬB/c、●：C57BL/6。幼く005,＊P<001。

3６

(39)

表３．１ＣＬＰにおける腹腔内サイトカイン、ケモカイン産生

cytokinc (､g/Cavity）

６ｈｏｕｒａｆｌｃｒＣＬＰＢＡＬＢ/ＣＣ５７ＢＬ/６

１８ｈｏｕｒａｆｔｃｒＣＬＰＢＡＬＢ/ｃＣ５７ＢＬ/６０．２８±0.05.

4.1±1.0*

０．１０±0.02.

５３±０．４．

４２．１±１２．２＊

138.0±41.9＊

ＴＮＦａ０．３５±0.08 ５．２±1.2*

0.13±0.03＊

３．６±0.4＊

４３．２±6.2 391.5±８３．６

７

１

８

０５０３０６

００００４５

＋一＋一＋一＋一＋一＋一

０３７１２７

３２０３丘４０

０２２３

0.10±０．０２１．１±0.3 0.04±０．０１

２．８±０．５３．１±１．５３９９±９．６Ｉしl２

１ＦＴＷ

ＭＩＰ－２ＫＣＭＣＰ－１

CLP後腹腔洗浄液を回収し、腹腔内サイトカイン(TNFα、IL-12、ＩＦNY)、

CXCケモカイン(MIP-2、ＫＣ)、ｃｃケモカイン(MCP-1)レベルを測定した。

幼く0.05、やく001。

表３．２ＣＩＰにおける血中サイトカイン、ケモカインレベル

cytokinc (､9ｍ）

６ｈｏｕｒａｆｔｃｒＣＬＰＢＡＬＢ/ｃＣ５７ＢＬ/６

l8houraftcrCLP BALB/ＣＣ５７ＢＬ/６ＴＮＦｕ

ｌｌ－ｎ

ｌＦＮＹ

ＭＩＰ－２ＫＣＭＣＰ－１

０．０１±０．０１１５．７±1.7＊

０．０４±0.01§

28.6±5.5土 36.2±5.6＊

64.5±６．５

２１

０４０１７１

●●●●●●

０１０２１５

＋一＋一＋’＋一十一十一

３５１９１５

０９０３２４０

０１２５

０．０２±０．０１

１７．３±2.07 0.03±０．０１．

１１．３±1.1§

48.4±4.111 33.8±6.1。

１１

０４０００８

●●●●●●

０００１２２

＋一＋一十一十一十一十一

１８１３５２

０４０４９２００１

CLP後マウスの血液を回収し血漿サイトカイン(TNFα、IL-12、ＩＦNY)、ＣＸＣケモカイン(MIP-2、ＫＣ)、ｃｃケモカイン(MCP-1)レベルを測定した)。

沖く0.05,＊p<0.01,§p<0.001,1p<0.0001。

3７

(40)

図3.6

IFＮＹ

ＴＮＦａ 1Ｌ､1２

2０＊ _§

§ 2０

（自重○己⑭目前目）＄ロ璽○員○

６

1０

４

ロ■■●■■■■■

ＢＡＬＢ/ＣＣ５７ＢＬ/６ＢＡＬＢ/ｃＣ５７ＢＬ/６ＢＡＬＢＣＣ５７ＢＬ/６

ＭＣＰ１ＫＣ

MIP-２

1.25 ４２

（■『⑪』○泊□

*

、日別ロ）８口型○日⑪二○

1．００

２

０７５ ＢＡＬＢｃＣ５７ＢＬ/６ＢＡＬＢｃＣ詞ＢＬ/６

ＢＡＬＢ/ＣＣ５７ＢＬ'６

CLP後の肝内サイトカイン、ケモカインレベル

CLP18時間後、ＢALB/ｃ（□）、C57BL/６（■）マウスの血液を回収し屠殺した。肝を摘出し肝抽出液中のサイトカイン、ケモカインレベル

を狽ﾘ定した｡*p<005,§p<0001､叩く0.0001.点線は未処置肝から得

たデータの平均値である。

3８

(41)

図3.7

Ａ _Ｂ

2０ 6０

白目両日）ロ乱。■眉△垣

（【日瓦二くくめ

4０

1０

2０

００ BＡＬＢ/ｃＣ５７ＢＬ/６ BＡＬＢ/ｃＣ５７ＢＬ/６

CLPにおける急'性期タンパク

CLP18時間後血液を回収し、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）レベルと血漿フィブリノゲンレベルを測定した（□：ＢＡＬB/c、■：

C57BL/6）。点線は未処置マウスから得たデータの平均値であ

る｡*p<005,叩<００００１｡

3９

(42)

図3８

Ａ

100

7５

｛２百】目庫

釦西０

001

５６７

３４ ２１ 0

DayafterCLP (｡）

Ｂ

100

7５ 別ち０

－２涙目的ざ

＜0

５ Z3 ４

DayafterCLP(｡）

０１ 敗血症性腹膜炎におけるマウスの生存率

（Ａ）CLP後７日間：ＢＡＬB/ｃ（○）、C57BL/６（●）マウスの生存率を観察した。（Ｂ）未処置BALB/ｃ（□）、C57BL/６（■）

マウスの腹腔内に生菌lxlO9CFU注入し、生存率を観察した。

4０

(43)

Ⅲ－２研究２の結果

III-2-1SOCS5TgマウスのＣＬＰに対する生存率改善

Ｔ細胞でのSOCS5の過表示がＣＬＰでの宿主防御に影響を与えるかどうか理

解する為に、まずＣＬＰ後のSOCS5TgとＷＴマウスの生存率を調べた。図３９に示すようにSOCS5Tgマウスの生存率はＷＴに比べ有意に高かった。

SOCS5Tgマウスは７日間で２９匹中１５匹（51.7％）生存したにもかかわらず、

ＷＴは３０匹中７匹（23.3％）しか生存しなかった。このようにSOCS5TgマウスはＣＬＰによる致死性に抵抗した。その結果Ｔ細胞におけるSOCS５過表示は敗血症性腹膜炎中の宿主防御に有益である事が示された。

III-2-ZSOCS5Tgマウスにおける細菌除去能増幅

ＣＬＰによる致死は細菌負荷と強く関連している(28）（29)。SOCS5Tgマウス

がＣＬＰに抵抗する機序を同定する為に、まず最初にＣＬＰ後の腹腔内細菌負荷を調べた。CLP６時間後両者の間で細菌負荷に差は無かったが（図無し)、

SOCS5TgマウスはCLP２４時間後の細菌除去が増幅されて、腹腔内のＣＦＵが

少なかった（図3.10)。この時点での末梢血中細菌数は有意ではないが、ＷＴ

に比べSOCS5Tgの方が２３倍少なかった（図3.10)。

好中球やマクロフアージの様な食細胞は細菌を除去する細胞である(45,47, 48)。次に好中球とマクロフアージの殺菌活性を調べた。この目的の為に、ＷＴ、

SOCS5Tgマウスの好中球、マクロファージに、ＣＬＰ後のＷＴの腹腔内から起こした細菌を感染させた。図3.11Ａに示すように、SOCS5Tgマウスからの

マクロファージはＷＴに比べ殺菌活性が高く、好中球でも同じような傾向だった。次に好中球、マクロファージのＬＰＳ刺激後培養上清における殺菌の効

果的分子であるスーパーオキサイド(45)の発生を調べた。SOCS5Tgマウスか

らの好中球、マクロファージはＷＴに比べ高いレベルのスーパーオキサイド

4１

(44)

図3.9

1００ 君屋旨皀の津

5０ §

○－○一○一○

ＷＴ

0 ０１２３４５６７

DayafterCLP

SOCS5TgマウスのCLP後の生存率改善

CLP後７日間、SOCS5Tgマウス（29匹）とＷＴマウス（30匹）の生存率を観察した。§p<0001。

4２

(45)

図3.10

blood

peritoneum

1０８ _○○○

○○回

1０５ 、己自室君のロ◎名①昌一二三一〔岸出〕 107 で。。『二

○の

○ 戸酉の二口恒①ニーユＣ三［岸出〕 104

● 106 ００

口＊ ^の｜●

1０３ ○⑪ ●

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1０５ ^●●●●

1０２ ⑭ ^●●

小０

１ｌ

〈Ｕ〈Ｕ

■１

○ ●

ＷＴＳＯＣＳＳＴｇＷＴＳＯＣＳ５Ｔｇ

SOCS5Tgマウスにおける細菌除去能の増幅

CLP24時間後（ＷＴマウス14匹、SOCS5Tgマウス10匹）

CLP24時間後（ＷＴマウス14匹、SOCS5Tgマウス10匹）、マウスを屠殺し腹腔洗浄液と末梢血を回収した。腹腔洗浄液と末梢血それぞれ1011を段階的に希釈しＴＳＡ血液培地に撒いた。横線は平均CFU数を表している。＃p<0.05。

4３

(46)

図3.11

Ａ neutrophils macrophages

5０ 5０

（ざ）＆日蝕日［［。

2５ 2５

００ ＷＴＳＯＣＳｓＴｇＷＴＳＯＣＳ５Ｔｇ

Ｂ neutrophils macrophages

40000 6000

①○口の○ｍ⑪閂○．回

20000 3000

００ ＷＴＳＯＣＳＳＴｇＷＴＳＯＣＳＳＴｇ

SOCS5Tgマウスにおける白血球の殺菌活性ＷＴ、SOCSSTgマウスから好中球、マクロフ

ＷＴ、SOCSSTgマウスから好中球、マクロファージを回収した。

（Ａ）細胞（３xlO9ml）に細菌（１xlO6CFU）を感染させ、殺活性を調べた。

（B）細胞（ZxlO9ml）をLPS（100,2/ｍｌ）で24時間APFの存花殺菌

（B）細胞（ZxlO9ml）をLPS（100,9/ｍｌ）で24時間APFの存在下に刺激した。培養上清中のスーパーオキサイド産生を分光分析で測定した。

幼く００５，＊p<001。

4４

(47)

を産生した（図3.11Ｂ)。このように、SOCS5TgマウスはＷＴマウスに比べより効果的に細菌を除去した。この事はおそらく食細胞の殺菌活性の増幅によるものと思われる。

ＩＩＩ－２－３ＳＯＣＳ５Ｔｇマウスにおける増幅された局所炎症

次にＣＬＰ後の腹腔内への白血球浸入を調査した結果、ＷＴに比べSOCS5Tg マウスにおいて好中球は２４時間後で１．５倍、マクロフアージは６時間で２．１倍と有意に増加していた（図3.12A)。それ故、ＣＬＰ後の腹腔内サイトカインレベルを測定した。図３．１２Ｂに示すようにIL-12、IFNYはＷＴに比べ増加していた。加えて、TNFαもSOCS5Tgマウスにおいて、ＷＴより有意に増加し

ていた。敗血症｣性腹膜炎を含む様々な感染モデルにおいて、これらのサイト

カインは細菌除去を増幅するという事が知られている(17）（49,50)。抗炎症サイトカインも測定したが、ＷＴとSOCS5TgマウスのＣＬＰ後の腹腔内から感

知できるレベルのIL-4、IL-13は検出されず、IL-10は検出されたものの統計

学的な差は無かった（CLP６時間後：ＷT1.0±0.3、SOCS5Tgl3±03,9/cavity、

CLP２４時間後：ＷT2.1±0.5、SOCS5TgL1±0.3,9/cavity、それぞれ８匹ずつ、

有意差無し)。ＬＰＳ刺激によりSOCS5Tgマウスからの腹腔マクロファージはコントロールに比べ高いレベルのTNFα、IL-12を産生したがIFNYは差が無かった（表3.3)。IL-4、IL-13は検出されず（図無し)、IL-10レベルは両者の間に有意差は無かった（表3.3)。次にCLP２４時間後の腹腔浸出細胞における

STAT6活性を調べた。その結果、pSTAT6表示はＷＴに比べSOCS5Tgマウスで減少していた（図3.13Ａ)。STAT4活'性は差が無かった（図無し)。STAT6

活性化が見られた細胞は好中球とマクロファージであり、抗ｐＳＴｍｌｇＧにより染色された（図3.13B)。このようにSOCS5Tgマウスはタイプ１サイトカイン優勢のサイトカインバランス変化を示し、SOCS5Tgマウスにおける殺菌

能増幅に貢献しているのであろう。

4５

(48)

図3.1Ｚ

Ａ neulrophils

macrophages

、 ^０－ ^＊

（ご宮⑤。｝も［×）ｍ［一①。

￣Ｅ戸

０６２４（h）

￣￣Ｆ

Ｏ６２４（h）

Ｂ

ＩＦＮＹ

1.0 1０ＴＮＦａ

＊ ↑

（ら「烏○瓦ロ）ｍ○日雪ｅ【。 _つ

0.5 ５

６ 2４６２４

TimeafterCLP(h）

2４６ SOCS5Tgマウスにおける白血球浸入とサイトカイン産生 CLP6、２４時間後マウスを屠殺し、血液、腹腔洗浄液を回‘

CLP６，２４時間後マウスを屠殺し、血液、腹腔洗浄液を回収した。

（Ａ）腹腔内に浸入した白血球数を数えた。○：ＷＴマウス、●

Title マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免

熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免

疫応答の解析

Author(s) 渡邉, 弘之 Citation

Issue date 2006‑03‑24

Type Thesis or Dissertation

URL http://hdl.handle.net/2298/8125

Right

学位論文

Doctor1sThesis

マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免疫応答の解析

（Analysisofimmuneresponseduringsepsisusingamunne modelofsepticperitonilis）

渡邉弘之 HiroyukiWatanabe

熊本大学大学院医学研究科博士課程外科系専攻整形外科学

指導：伊藤隆明教授 指導：水田博志教授 指導：高木克公前教授

２００６年３月

学位論文

Doctor1sI11esis

論文題名：マウス敗血症性腹膜炎モデルを用いた敗血症における免疫応答の解析 (Analysisofimmuneresponseduringsepsisusingamurine

modelofsepticperitonitis）

著者名：

（単名）

渡邊弘之 ＨｉｒｏｙｕｋｉWatanabe

指導教員名 伊藤

水田 高木

隆明教授 博志教授 克公前教授

審査委員名 細胞病理学担当

微生物学担当 病態情報解析学担当 免疫職別学担当

裕章雄治 元孝喜泰

２００６年３月

目次

４６９０１ 一一一１１ 一一一一一 一一一一一 一』Ｐ一一 一一一一一 一一一一一 一一一『一 一一一一一 一一一一一 一一一一一

』一一一一 一一一■一 一一一一一

一一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一一一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一

一一一一一 』一一←一 一一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一 『一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一 一一一一一

一一一一一』一一一一 一一一』一一一一一一 一一一一一 一一川一一 一昨如一攪 鮨』『洲畷

’’一’－ １１１ＩＩ

第Ⅱ章実験材料および方法 ---20

Ⅱ－１ﾏｳｽｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰｰ－－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－２０

Ⅱ－２マウス敗血症性腹膜炎モデル---－－－－－２０

Ⅱ－３細胞分離一---－---22

Ⅱ－４invitroでの白血球の殺菌活性の評価一---23

Ⅱ－５細胞培養一一一一-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－２３

Ⅱ－６スーパーオキサイド産生一一-－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－２４

Ⅱ－７サイトカイン､ＭＰＯの測定一-－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－２５

Ⅱ－８血液生化学---－---25

Ⅱ－９ウエスタンプロット法一-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－２５

Ⅱ－１０免疫細胞化学－－－－－－－－－－---－---26

Ⅱ－１１フローサイトメトリー－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－-－２６

２

Ⅱ－１２統計解析 －－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－---26

第Ⅲ章実験結果一-－－－－－－－－－－－－---28

Ⅲ－１研究１の結果---－---－---28

m－１－５ＣＬＰにおける局所、全身での炎症反応一---－---34

m-2-2SOCS5Tgマウスにおける細菌除去能増幅一---41

m-2-3SOCS5Tgマウスにおける増幅された局所炎症一---45

ｍ－２－４ＣＤ４+Ｔ細胞移入による自然免疫応答増幅---49

m-2-5SOCS5TgマウスにおけるＴ細胞の`性質一---52

m－２－６SOCS5Tgマウスで弱められた腎障害---52

考察一一一一一一一一一一一－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－５７ 研究１について－－－－－－－－－－－－－－-一一一一一---57

研究２について一一一一一一－---－－－－５９ 第Ⅳ章 Ⅳ－１ Ⅳ－２ 結語---－---63 第Ｖ章

引用文献 ---－---一一一一一一-－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－－６４

３

￣ 曰

要

ＳＦXＴ（januskinase-signaltransducerandactivator）経路、JAK-SFKT経路を制 御するＳＯＣＳ（suppressorofcytokinesignaling）タンパクについて解析した。

また、従来獲得免疫に関わると考えられていたＴ細胞の自然免疫応答への介 入について検討した。

研究１について簡潔に述べる。C57BL/６のマクロフアージはＬＰＳ

（lipopolysaccharide）もしくはMALP-2（macrophage-activatinglipopeptide-2）

刺激により、ＢALB/ｃに比べＴＮＦｑ（tumornecrosisfactorq)、ＩＬ（interleukin）

-12を多く産生した。C57BL/６のマクロフアージによるIL-1Z産生の増幅は、

CD4+Ｔ細胞によるＩＦNＹ（interferonY）産生を増加させ、IL-13産生を減少さ せた。ＬＰＳもしくはMALP-2刺激によりC57BL/６マクロフアージは殺菌分子 であるライソゾーム酵素、ＮＯ（nitricoxide）を産生したが、ＢALB/ｃマクロ

ファージでは産生されなかった。殺菌活性はC57BL/６マクロフアージに比べ

４

BALB/cマクロファージで障害されていた。ＣＬＰ（cecalligationandpuncture）

BALB/ｃマウスはC57BL/６に比べＣＬＰでの致死率が高かった。このように、

マクロファージの自然免疫反応は両系統において差があり、その事がＴｈＬ Ｔｈ２タイプの獲得免疫の分化に影響しているものと考えられる。C57BL/６マ

ウスは局所応答が優れているため全身の炎症が軽減し、敗血症による死に耐 え得るように思われる。

指導：伊藤隆明教授指導：水田博志教授指導：高木克公前教授

渡邊弘之ＨｉｒｏｙｕｋｉWatanabe

指導教員名伊藤

水田高木

隆明教授博志教授克公前教授

審査委員名細胞病理学担当

微生物学担当病態情報解析学担当免疫職別学担当

裕章雄治元孝喜泰

４６９０１一一一１１一一一一一一一一一一一』Ｐ一一一一一一一一一一一一一一一『一一一一一一一一一一一一一一一一

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’’一’－１１１ＩＩ

Ⅱ－１２統計解析－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－－－－－－－－－---26

考察一一一一一一一一一一一－－－－－－－－－－－－－－－-－－－－－－－－－－－５７研究１について－－－－－－－－－－－－－－-一一一一一---57

研究２について一一一一一一－---－－－－５９第Ⅳ章 Ⅳ－１ Ⅳ－２結語---－---63 第Ｖ章

￣曰

ＳＦXＴ（januskinase-signaltransducerandactivator）経路、JAK-SFKT経路を制御するＳＯＣＳ（suppressorofcytokinesignaling）タンパクについて解析した。

また、従来獲得免疫に関わると考えられていたＴ細胞の自然免疫応答への介入について検討した。

CD4+Ｔ細胞によるＩＦNＹ（interferonY）産生を増加させ、IL-13産生を減少させた。ＬＰＳもしくはMALP-2刺激によりC57BL/６マクロフアージは殺菌分子であるライソゾーム酵素、ＮＯ（nitricoxide）を産生したが、ＢALB/ｃマクロ

マクロファージの自然免疫反応は両系統において差があり、その事がＴｈＬＴｈ２タイプの獲得免疫の分化に影響しているものと考えられる。C57BL/６マ

ウスは局所応答が優れているため全身の炎症が軽減し、敗血症による死に耐え得るように思われる。

SOCS5Tg(transgenic)マウスはＷＴ（ｗｉｌｄtype）マウスに比べ敗血症性腹膜炎中の致死率が低かった｡ｖｉｖｏでの実験でSOCS5Tgマウスの腹腔内IL-1Z､IFNY、

TNFαレベルはＷＴより増加し、腹腔内細菌負荷がSOCS5Tgマウスの方が有意に低いという結果から、SOCS5Tgマウスにおいて自然免疫応答が増幅にさ

れており、このため生存率が上昇したものと思われた。vitroでの好中球、マクロファージの殺菌活性は、SOCS5Tgマウスにおいて増幅されていた。

SOCS5Tgマウスから得たＣＤ4+Ｔ細胞をＴ､Ｂ細胞欠損RAG-2KO(recombination activatinggene2knockout）マウスに養子免疫伝達した結果、ＣＬＰ後の腹腔内サイトカインレベルはコントロールに比べ増加した。SOCS5TgのＣＤ4+Ｔ細

胞を移入されたマウスは殺菌能が増幅され、その結果ＣＬＰ後の生存率が改善した。このように、Ｔ細胞におけるSOCS5の過表示がＣＬＰによる敗血症１ｆｔ腹膜炎中の自然免疫を増幅させる事が証明された。

敗血症における自然免疫応答でのThl/Th2バランスの理解や新たに分かったＴ細胞の役割は、敗血症の管理を進歩させ、長く改善しなかった致死率を減少させる礎となるだろうと期待している。

not・BactericidalactivityofBALB/cmacrophageswasimpairedrelativｅｔｏＣ５７ＢＬ/６macrophageswhencellswereinfectedwithlivebacteriaノ〃vjrro・Ina murinemodelofsepticperitonitisinducedbyCLP(cecalligationandpuncture)，

本研究は、松川昭博教授（岡山大学大学院医歯薬総合研究科病態探究医学分野）のご指導のもとに実施しました。研究の機会を賜り、温かいご指導を頂きました事に心より感謝申し上げます。

また、沼田亨祐先生（機能病理学分野，現国立病院機構熊本医療センター整形外科)、前田貴子氏、加賀矢問元子氏、工藤信次氏（機能病理学分野）

本研究で使用したＳＯＣＳ５トランスジェニックマウスは久保允人先生（理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センター）より、RAG－２ノックア

最後に、私の心の支えである家族と両親に、感謝の気持ちを記したいと思います。

MALP-2：macrophage-activatinglipopeptide-2 MIP-2：macrophageinflammatoryproteiｎ－ＺＭＰＯ：myeloperoxidase