ＣＬＰによる致死は細菌負荷と強く関連している(28）（29)。SOCS5Tgマウス
がＣＬＰに抵抗する機序を同定する為に、まず最初にＣＬＰ後の腹腔内細菌負 荷を調べた。CLP６時間後両者の間で細菌負荷に差は無かったが（図無し)、
SOCS5TgマウスはCLP２４時間後の細菌除去が増幅されて、腹腔内のＣＦＵが
少なかった（図3.10)。この時点での末梢血中細菌数は有意ではないが、ＷＴ
に比べSOCS5Tgの方が２３倍少なかった（図3.10)。
好中球やマクロフアージの様な食細胞は細菌を除去する細胞である(45,47,
48)。次に好中球とマクロフアージの殺菌活性を調べた。この目的の為に、ＷＴ、
SOCS5Tgマウスの好中球、マクロファージに、ＣＬＰ後のＷＴの腹腔内から
起こした細菌を感染させた。図3.11Ａに示すように、SOCS5TgマウスからのマクロファージはＷＴに比べ殺菌活性が高く、好中球でも同じような傾向だ った。次に好中球、マクロファージのＬＰＳ刺激後培養上清における殺菌の効
果的分子であるスーパーオキサイド(45)の発生を調べた。SOCS5Tgマウスか
らの好中球、マクロファージはＷＴに比べ高いレベルのスーパーオキサイド
4１
図3.9
1００
君屋旨皀の津
5０
§
○－○一○一○
ＷＴ
0
０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７
DayafterCLP
SOCS5TgマウスのCLP後の生存率改善
CLP後７日間、SOCS5Tgマウス（29匹）とＷＴマウス（30匹）の 生存率を観察した。§p<0001。
4２
図3.10
blood
peritoneum
1０８ ○○○
○○回
1０５
、己自室君のロ◎名①昌一二三一〔岸出〕 107 で。。『二 ○の
○ 戸酉の二口恒①ニーユＣ三［岸出〕 104
●
106 ００
口＊ の
｜●
1０３
○⑪
●の
1０５ ●●●●
1０２ ⑭ ●●
小０１ ｌ〈Ｕ〈Ｕ■１
○ ●
ＷＴＳＯＣＳＳＴｇ ＷＴＳＯＣＳ５Ｔｇ
SOCS5Tgマウスにおける細菌除去能の増幅
CLP24時間後（ＷＴマウス14匹、SOCS5Tgマウス10匹）
CLP24時間後（ＷＴマウス14匹、SOCS5Tgマウス10匹）、マウス
を屠殺し腹腔洗浄液と末梢血を回収した。腹腔洗浄液と末梢血 それぞれ1011を段階的に希釈しＴＳＡ血液培地に撒いた。横線は平均CFU数を表している。＃p<0.05。
4３
図3.11
Ａ neutrophils macrophages
5０ 5０
（ざ）＆日蝕日［［。
2５ 2５
０ ０
ＷＴＳＯＣＳｓＴｇ ＷＴＳＯＣＳ５Ｔｇ
Ｂ neutrophils macrophages
40000 6000
①○口の○ｍ⑪閂○．回
20000 3000
０ ０
ＷＴＳＯＣＳＳＴｇ ＷＴＳＯＣＳＳＴｇ
SOCS5Tgマウスにおける白血球の殺菌活性
ＷＴ、SOCSSTgマウスから好中球、マクロフ
ＷＴ、SOCSSTgマウスから好中球、マクロファージを回収した。
（Ａ）細胞（３xlO9ml）に細菌（１xlO6CFU）を感染させ、殺 活性を調べた。
（B）細胞（ZxlO9ml）をLPS（100,2/ｍｌ）で24時間APFの存花 殺菌
（B）細胞（ZxlO9ml）をLPS（100,9/ｍｌ）で24時間APFの存在下
に刺激した。培養上清中のスーパーオキサイド産生を分光分析 で測定した。幼く００５，＊p<001。
4４
を産生した（図3.11Ｂ)。このように、SOCS5TgマウスはＷＴマウスに比べ
より効果的に細菌を除去した。この事はおそらく食細胞の殺菌活性の増幅に よるものと思われる。ＩＩＩ－２－３ＳＯＣＳ５Ｔｇマウスにおける増幅された局所炎症
次にＣＬＰ後の腹腔内への白血球浸入を調査した結果、ＷＴに比べSOCS5Tg
マウスにおいて好中球は２４時間後で１．５倍、マクロフアージは６時間で２．１ 倍と有意に増加していた（図3.12A)。それ故、ＣＬＰ後の腹腔内サイトカインレベルを測定した。図３．１２Ｂに示すようにIL-12、IFNYはＷＴに比べ増加し
ていた。加えて、TNFαもSOCS5Tgマウスにおいて、ＷＴより有意に増加していた。敗血症｣性腹膜炎を含む様々な感染モデルにおいて、これらのサイト
カインは細菌除去を増幅するという事が知られている(17）（49,50)。抗炎症サ
イトカインも測定したが、ＷＴとSOCS5TgマウスのＣＬＰ後の腹腔内から感
知できるレベルのIL-4、IL-13は検出されず、IL-10は検出されたものの統計
学的な差は無かった（CLP６時間後：ＷT1.0±0.3、SOCS5Tgl3±03,9/cavity、
CLP２４時間後：ＷT2.1±0.5、SOCS5TgL1±0.3,9/cavity、それぞれ８匹ずつ、
有意差無し)。ＬＰＳ刺激によりSOCS5Tgマウスからの腹腔マクロファージは
コントロールに比べ高いレベルのTNFα、IL-12を産生したがIFNYは差が無
かった（表3.3)。IL-4、IL-13は検出されず（図無し)、IL-10レベルは両者の 間に有意差は無かった（表3.3)。次にCLP２４時間後の腹腔浸出細胞におけるSTAT6活性を調べた。その結果、pSTAT6表示はＷＴに比べSOCS5Tgマウス で減少していた（図3.13Ａ)。STAT4活'性は差が無かった（図無し)。STAT6
活性化が見られた細胞は好中球とマクロファージであり、抗ｐＳＴｍｌｇＧによ り染色された（図3.13B)。このようにSOCS5Tgマウスはタイプ１サイトカ イン優勢のサイトカインバランス変化を示し、SOCS5Tgマウスにおける殺菌
能増幅に貢献しているのであろう。
4５
図3.1Ｚ
Ａ neulrophils
macrophages
、
０－ ＊（ご宮⑤。｝も［×）ｍ［一①。
￣Ｅ戸
０６２４（h）
￣￣Ｆ
Ｏ６２４（h）
Ｂ
ＩＦＮＹ
1.0 1０ ＴＮＦａ
＊ ↑
（ら「烏○瓦ロ）ｍ○日雪ｅ【。 つ
0.5 ５
６ 2４ ６２４
TimeafterCLP(h）
2４ ６
SOCS5Tgマウスにおける白血球浸入とサイトカイン産生
CLP6、２４時間後マウスを屠殺し、血液、腹腔洗浄液を回‘CLP６，２４時間後マウスを屠殺し、血液、腹腔洗浄液を回収した。
（Ａ）腹腔内に浸入した白血球数を数えた。○：ＷＴマウス、●
SOCSSTgマウス。
（B）腹腔内IL-12、ＩＦNY、TNFαレベルをELISAで測定した。□
ＷＴマウス、■：SOCSSTgマウス。
:i:p<0.05,＊p<0.01。
4６
表３３腹腔マクロファージによるサイトカイン産生
IL-10
IL-12 lＦＮｇ ＴＮＨｌ
0.38±0．０４ 2.28±0.09 0.20±０．０２ 0.09±0．００
ｍｅｄｉｕｍ
2.29±0.08 339±0.19 0.46±0.02
0.62±0０３ 0.21±0.01
2.37±０．２４
０．１０±0.00 0.10±0.00
ＬＰＳ 3.72±0.20＊ 0.11±0.00 0.83±００４＊ 2.93±0.09
ピＬＰＳ刺激（100,9/ml）で刺激。６，２４時間後
イトカインレベルを測定。ピーク時のサイトカ
を示す（IL-12JFNY、TNFαは２４時間後、ＩＬ－
まＷＴマクロフアージ、下はSOCS5TEマクロ 腹腔マクロファージを
培養上清を回収しサイ
インレベル（､g/ｍｌ）を
１０は６時間後)。上1コ ファージ。＊p<0.01。
上はＷＴ 、下はＳＯＣＳ５Ｔｇマクロ
や<0.01。
￣￣、／○
4７
ＩＩＩ－２－４ＣＤ４+Ｔ細胞移入による自然免疫応答増幅
これらの結果、敗血症性腹膜炎における自然免疫応答に、Ｔ細胞内SOCS５ 過表示が影響を与えている事が示唆された。そこで我々は、ＣＤ４Ｔ細胞が
SOCS5Tgマウスの自然免疫応答増幅に役立っているかどうか調べた。この為 に、ＷＴマウスから得た食細胞をSOCS5Tg、ＷＴマウスから得たＣＤ4+Ｔ細胞
とともに培養し、ＣＬＰ後マウスから起こした細菌を感染させ、食細胞の殺菌 活性を調べた。図3.14Ａのデータのように、好中球、マクロフアージともにSOCS5TgマウスからのＣＤ４Ｔ細胞の存在下で、コントロールよりも殺菌活
`性が増幅された。さらにＣＬＰ中のＣＤ4+Ｔ細胞の役割を調べる為に、SOCS5Tg、
ＷＴマウスから得たＣＤ4+Ｔ細胞をリンパ球欠損マウスであるRAG2KOマウ
スに移入し、ＣＬＰを行った。その結果、SOCS5TgのＣＤ４Ｔ細胞移入群の方
がＷＴ移入群に比べより効率的に細菌を除去した（図3.14B)。腹腔内鯵出細胞数はコントロールに比べSOCS5TgのＣＤ4+Ｔ細胞移入群の方が増加してい た（図314C)。SOCS5TgのＣＤ４Ｔ細胞移入したRAG2KOマウスの方がコ ントロールに比べ、有意にIL-1Z、IFNYの腹腔内産生レベルが高かった。TNFα 産生レベルも有意差は無いものの増加していた（p=0.12）（図314,)。腹腔
内IL-4、IL-13は検出されなかった（図無し)。腹腔内IL-10レベルは両者の間で統計学的な差は無かった（WTLCD4+Ｔ細胞移入群0.62±014、SOCS5Tg‐
CD4+Ｔ細胞移入群0.87±016/cavity、各１０匹、有意差無し)。これらの結果、
この特殊なモデルにおいてＴ細胞内のSOCS5が自然免疫応答を変化させて いる事がはっきりと示された。
SOCS5Tg-CD4T細胞が自然免疫応答に影響を与える機序を理解するため
に､ＷＴマクロフアージをＷＴもしくはSOCS5TgのＣＤ4+Ｔ細胞存在下でＬＰＳで刺激し､その培養上清中の炎症促進サイトカインTNFαレベルを測定した。
図3.14Ｅに示すようにTNFαレベルはSOCS5Tg-CD4+Ｔ細胞存在下での方が WTCD4+Ｔ細胞存在下に比べ増幅されていた。この事はSOCS5Tg-CD4+Ｔ細
胞がTNFα産生を増幅させているのだろうという事を示唆している。transwel］
4９
囚凶』▲
己国lOl4ISamPIes＞CytokineO1g/cavity）ＣＦＵ／
①。③
■■■■■ 1９KiUingrate(兜）
----- ￣￣￣￣￣ し、ユリＵ□、、」
｡s七・
】●
３
諄『『⑫ｏｎ⑫い『脂
Ｓ●
鈩弓 鋺○、⑫ｍ『媚 で⑤ユー。■ね唇『弓
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･雪･ルー
夛弓 韓○の⑫い『鹿 再句皀百。ご三富
｡+･卜 ￣ ￣｡￣
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－ ＣＵＵ
￣ ● ふし
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妻『『⑫○句いい『殖
８．
夛弓⑫ｏｎ践弓、
Killingrate(兜）
ご一ｃ○二
弓写
い○
斜0.-】◎
②①
こつ 孫
目口践【『ご己。鯵瞬伶韓
二「『 ⑫○、晩い『媚
、｣＝ NeutrophiIs (ＸＷ/cavity） ＵＵ
Macrophages (xlO5/cavi呼） Ｕ、
R、、 ￣ ￣
￣ ｡●･
夛弓 ⑫ｏｎ⑫い『、
『Ｚ田負
夛三’、○ｎｍい『、
図3.14
Ｅ
＊ ＊
0８
（「ロｎ口）己」ｚ伊
0.4
controlanti-IFNYcontrolanti-IFNY
SOCS5TgマウスのＣＤ4+T細胞は自然免疫応答を増幅する
（Ａ）食細胞（好中球とマクロフアージ、３xlO6/ｍｌ）とＷ
（Ａ）食細胞（好中球とマクロファージ、３xlO6/ｍｌ）とＷＴ、SOCSSTgマウ
スのCD4+T細胞（lxlO6/ml）をともに培養し、そこにCLP施行後マウスから得た生菌1xlO6CFUを感染させ、食細胞の殺菌活性を調べた。
（B-D）ＷＴ、SOCSSTgマウスのCD4+T細胞をRAG2-/-マウスに移入（3xlO6
細胞/腹腔）し、そのマウスにCLPを施行した。CLP24時間後マウスを 殺し腹腔洗浄液と末梢血を回収した。（B）腹腔洗浄液と血液それぞれ10u]を段階的に希釈しTSA血液培地に撒い
た。横線は平均CFU数を示している。（C）好中球、マクロファージの数を数えた。
（Ｄ）腹腔サイトカインレベルを測定した。
（E）ＷＴマクロファージ（1xlO6/ｍｌ）とＷＴ（□）、SOCSSTg（■）マウス
のCD4+T細胞（OSxlO6/ｍｌ）をともに培養し、そこにコントロールIgGもしくは抗IFNYIgG中和抗体（10Ug/ml）の存在下にLPS刺激（100,9/ml）
を加えた。２４時間後培養上清を回収しTNFαレベルを測定した。
:|:p<005,＊p<001、§p<０００１，１p<00001。
５１
apparatusを用いて培養した場合は、TNFαレベルの増幅は見られなかった