成 膜 大 学 理 工 学 研 究 報 告 J.Fac.Sci.Tech.,SeikeiUniv. X701.50Not(2013)pp113-114 (特 別 研 究 費 に 係 る 論 文)
リゾホ ス ファ チ ジ ン酸 の 酵 素 的 調 製 とそ の抗 炎 症 作 用
山 本
幸 弘*1,高
田
聡 志*2,原
節 子*3
Enzymaticpreparationoflysophospholipidsandtheiranti-inflammatoryeffect
YukihiroYAMAMOTO*',SatoshiTAKADA*Z,andSetsukoHARA*s
(ReceivedSeptember13,2013)
1.は じ め に リ ン 脂 質 の 一 種 で あ る リ ゾ ホ ス フ ァ チ ジ ン 酸(LPA)は 、 細 胞 増 殖 作 用 や 創 傷 治 癒 作 用 な ど を 示 す 生 理 活 性 脂 質 と し て 知 ら れ て い る1)。LRへ に は 、sn-1位 が 水 酸 基 で あ る1-lyso型(1-LRへ,Fig.1)と 、sn-2が 水 酸 基 で あ る2-lyso型(2-LRへ)が あ る が 、1-lyso型LRへ 受 容 体 が 発 見 さ れ て 以 降 、そ の 生 理 活 性 が 注 目 さ れ て い る2)。現 在 、LPAの 酵 素 的 調 製 に 関 す る 報 告 は ほ と ん ど な く 、化 学 的 で は 多 段 階 を 要 し 、 ま た 生 成 物 の 利 用 に も 制 限 が あ る3)。 そ こ で 、 本 研 究 で は 大 豆 由 来 ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン(pc,Fig.1)を 出 発 原 料 と し 、リパ ー ゼ と ホ ス ホ リパ ー ゼD(PLD)を 利 用 した 加 水 分 解 反 応 に よ る 、1-LPAの 調 製 条 件 の 検 討 に つ い て 検 討 し 、 さ ら に 各 リ ン 脂 質 種 の 抗 炎 症 作 用 に つ い て も 併 せ て 評 価 し た 。 0∴∴ 亮:㌧ 、
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Fig.1.Chemicalstructureof1‐LPA(left)andPC(right) 2.2PCか らlysoPC(LPC)の 調 製 PCl.Ogを 酢 酸 エ チ ル10mLに 溶 解 し 、0.lMフ タ ル 酸 塩 緩 衝 液(pH4.0)5mL、LipaseA(0.Ol-0.04g)を 力口え350C、 600rpmで24-92h撹 拝 し た 。 収 率(mol%)は 反 応 混 合 物 の TLC-FID分 析 に よ り 、LPC中 の1-LPCの 含 有 率 は31P-NMR分 析 に よ り 算 出 し た 。 2.3LPCか らLPAの 調 製 LPCl.Ogを 酢 酸 エ チ ル10mLに 溶 解 し 、0.2M酢 酸 緩 衝 液(pH5.6)8mL、1.5M塩 化 カ ル シ ウ ム(CaCl2)水 溶 液 2mL、PLD粗 酵 素 溶 液400ｵLを 加 え350C、250rpmで48 h撹 拝 した 。 収 率 とLRへ 中 の1-LPA含 有 率 は2-2.と 同 様 に 算 出 し た 。 2.4各 リ ン脂 質 種 の 抗 炎 症 作 用 マ ウ ス 由 来 の マ ク ロ フ ァ ー ジ(RAW264.7)に 対 し 、 リポ ポ リ サ ッ カ ラ イ ド(LPS、0.1ｵg/mL)と 各 リ ン 脂 質 種 を そ れ ぞ れ10ｵM添 加 し 、24h後 の 炎 症 性 サ イ トカ イ ン(IL-1 β 、IL-6)な らび に 酵 素(COX-2、NOS2)のmRNA発 現 量 を RT-PCR法 に よ り相 対 的 に 定 量 し た 。 2.実 験3.結
果 と 考 察
2.1試 料 と 酵 素 PCは 大 豆 由 来(>95%)の も の を 用 い た 。 リ パ ー ゼ は 、 Aspergi//usnige油 来 リ パ ー ゼA「 ア マ ノ 」6(6.0×105U/g、 LipaseA,1,3位 特 異 性)を 用 い た 。PLDは 常 法4)に よ り キ ャ ベ ツ か ら 抽 出 し 、 粗 酵 素 溶 液(16.Omg/mL)と し た 。 *1:理 工 学 部 助 教(yyamamoto@st .seikei.ac.jp) *2:理 工 学 研 究 科 物 質 生 命 コ ー ス 修 士 課 程 *3:理 工 学 部 教 授 3.1PCか らLPCの 調 製 各 酵 素 量 を加 え た 条 件 下 に 、 経 時 的 にLPC収 率 を 調 べ た と こ ろ 、 い ず れ の 条 件 で も 時 間 と 共 に 収 率 は 上 昇 し 、 特 に 酵 素 量0.02gの と き48hでLPC収 率 は99.3mol%に 達 し た(Fig.2)。 こ の 時LPc区 分 を 分 取TLcに て 回 収 し 、31P-NMRに 供 した と こ ろ 、 各 ピ ー ク の 積 分 値 の 比 か ら 、LPC 中 の1-LPCの 含 有 率 が78.0%で あ る と 判 明 し た 。 同 条 件 で24hの と き 、 収 率 は53.9mol%と 低 い も の の1-LPCの 含 有 率 は93.0%と 高 く 、高 純 度 で1-LPCを 得 る た め に は 、 一113一成 跨i大 学 理 工 学 研 究 報 告
Vo1.50No.2(2013.12)
短 時 間 反 応 が 有 効 と 考 え ら れ た 。 ま た 、 反 応 時 間 が 長 く な る と い ず れ の 酵 素 量 に お い て も 収 率 は 減 少 した 。 酵 素 量0.02g、 反 応 時 間48hで の 反 応 混 合 物 をTLCに 供 し、 Dittmer試 薬 に よ り リ ン の 検 出 を 行 っ た と こ ろ 、 主 要 成 分 と し てLPCが 検 出 され た 。 一 方 、酵 素 量0.04g、 反 応 時 間 48hで はLPCに 加 え 、sn-1,2位 が と も に加 水 分 解 さ れ 水 酸 基 と な っ た 分 子 種 で あ る グ リセ ロ ホ ス ホ コ リ ン が 検 出 さ れ た 。 こ れ よ り、 長 時 間 反 応 や 、 酵 素 量 が 過 剰 で あ る と 、 生 成 さ れ た1-LPCが2-LPCへ と 変 換 後 、 加 水 分 解 さ れ る こ と や 、LipaseAの1,3位 特 異 性 が 完 全 で は な く 、 PCか ら2-LPCが 生 成 さ れ て い る こ と が 推 察 さ れ た 。 ioo 尋80 a60 L、 。華
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rレー0.01g 十 〇.02g fO.03g fO.04g '㌔◆ 0 024487296 Time(h) Fig.2.EffectoftheamountofenzymeonLPCpreparation 3.2LPCか らLPAの 調 製 LPCか らLRへ の 調 製 に 先 立 ち 、 ま ず 、PCを 用 い て コ リ ン が 遊 離 した 分 子 種 で あ る ホ ス フ ァ チ ジ ン 酸(PA)の 調 製 条 件 をPLD粗 酵 素 溶 液 を 用 い て 検 討 し た 。 ま ず 、PCl.Og に 対 しPLD粗 酵 素 溶 液 を200ｵLあ る い は400ｵL添 加 し 、 経 時 的 にPAの 収 率 を 測 定 し た 。 そ の 結 果 、400ｵL添 加 し た 時 、 反 応 開 始 か ら72hで ほ ぼ 平 衡 に 達 し 、96hで 最 高 と な っ た 。200ｵL添 加 で は 、 こ の 反 応 時 間 内 で は 収 率 は 平 衡 と な ら ず 、96hに お い て も400ｵL添 加 した 場 合 の 方 が 高 か っ た 。 次 い で キ ャ ベ ツ 由 来PLDの 活 性 はCa2+濃 度 の 影 響 を 受 け る こ と が 知 ら れ て い る た め 、PLD粗 酵 素 液 量 を400ｵL、 反 応 時 間96hと し 、 反 応 系 に お け るCaCl2濃 度 の 影 響 を 調 べ た 。CaCl2濃 度 を0.5M-2.OMと し てPA収 率 を 調 べ た結 果 、1.5Mで 最 大 と な っ た 。 以 上 の 結 果 に 基 づ き 、3-2.で99.3mol%の 収 率 で 得 られ たLPCl.Ogを 用 い 、PLD粗 酵 素 溶 液400ｵL、 反 応 時 間96 h、1.5MCaCl2の 条 件 でLPCか らLRへ を 調 製 し た 。 そ の 結 果 、82.5mol%の 収 率 でLPAが 得 ら れ た 。 し か しLRへ 中 の 1-LRへ の 含 有 率 は8.1%で あ っ た 。 最 終 的 にTablelに 示 し た よ うに 、PCを 出 発 原 料 と し てLPC収 率81.9%、1-LPA収 率6.3%を 得 る こ と が 出 来 た 。 な お 、1-LRへ の 収 率 は 、 短 時 間 反 応 、回 収 後 の 酸 性pHの 保 持 お よ び 調 製 後 の 迅 速 な 測 定 に よ り向 上 す る も の と 考 え た 。 Table1.YieldofPLsand1‐lysocontentateachstep PC→LPC LPC→LRへ PC→LRへ
