クロロマイセチン耐性腸チフス菌に就て

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著〕 （東京女医大剛・第25巻第5号頁171−176。日召禾030年5月）

クロロマイセチン耐性腸チフス菌に就て

東京女子医科大学細菌学教室（主任 平野憲正教授） 緒 言 小 コ 林 パΨシ 千 チ 鶴 ズ （受イ寸 昭和30・年1月10日）

クPロマイセチン（以下CMと略）はBurkh−

older等（1947）により発見されて以来，グラム 陰性及び陽性菌の双方に効果ある新抗生物質とし て多数の学者によって研究され，臨床的にも数々 の疾患に効果のある事が知られてきた。しかし抗 生物質の予想される運命として耐性菌の問題があ る。既に多くの入・々によりこの問題は検討されて 来たが私も試験管内でCM耐性腸チフス菌をつく り，これに似て種・々研究したので以下実験の結果 を報告する。 実験材料 実験に用いた菌は当教室保存の腸チフス菌相原株 （VW型）で使用培地は山羊血清培地及び普通ブイヨン である。CMはPark−Davis社製のものである。 実験方法及び案験成績 1． 感性試験 各種細菌のCM感性に就てR． M． Smith（1）は

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1．0μ9／m1と報告している。又寺田，設楽（2）はS． typhi 10∼20 7／ccと報じてv、る。 私は山羊血購培地（無菌的に採取した山羊血塊 を滅菌蒸溜水でユ0倍にうすめ100℃15分滅菌した もの。以下血清培地と略）及び普通ブイヨンを用 いて腸チフス菌のCMに対する感性を測定した。 CMは滅菌蒸溜水でユmg／cc∼5007／ccにな厨叢 に稀釈し，100。C30分重：湯煎で加熱し：更に滅菌蒸 溜水で稀釈して．血清培地には1CC，ブ■ヨンには 0．5cc加えて所定濃度になる様にした。培地の総 量はいすれも5ccである。菌は相原株の斜面培養 を血溝培地及びブイヨンに夫k“ 3代継代し，これ からCMを所定濃度に含む培地に一白金目（渦巻） 宛移植した。かくして10日聞培養し培地の溺濁し たものを発育と見徹した。その結果は第一表の如 くゴ昆清培地に於ける相原株の感性は57であリブ ■ヨンに於ける感性は10 ・／であった』但し菌ば 100 7／cc含有の．［fi．T．清培地巾でも発育を阻T．1：された のみで伺生存していた。 第一表腸チフス菌のCMに対する感性

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の多く，中に空子を有するものもあった。集落は 50γ耐性株ではCM入斜面では小さく透明で，菌 苔も薄かったが，普通斜面では原株との差は認め られなかった。3eo 7耐性株ではCM入斜面でも 普通斜面でも原株より発育が悪く，非常に小さな 正円形の透明な集落であった。 4． 耐性株の生物学的性状 国章青培地の50 7耐性株11代，ブイヨンの300γ 耐性株3代に就て原音と生物学的性状の比較を行 った。各種糖のO．5 ％含有ペプトン水，ラクムス 岬町，中性紅塞天，牛乳培地，無蛋白培地に移植 して14日間培養してその変化を観察し，叉ペプト ン水に培養してインドール反応を検査した。その 結果は第二表に示すように，耐性株は原株と異っ てシルビットを分解せす叉旧株に比してグリセリ ンの分解が遅れた。 第二表 CM耐性腸チフ3菌の生物学的性状 乳 糖 葡 萄 糖 デ キ ス ト リ ン ソ 7レ ビ ツ ト マ ノレ ．ト 1 ゼゴ ラ フ イ ノ 1 ゼ ヨ 喜 で ゼ エ リ ト リ ツ ト イ ヌ リ ン サ ツ カ ロ 1 ゼ マ ソ ツ ト

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5． 耐性株の運動性及び鞭毛 前と同じ耐性株に就て運動性を懸滴標本で比較 した結果，原株の運動が非常に活譲であるのに比 して，耐性株では殆ど運動が見られなかった。 0．7％半流動寒天に穿刺培養を行った結果，原論 は穿刺線に沿う強v・漏濁は勿論，周囲にも強v・溺 濁を示したが，507耐性株は周囲の酒濁が原株に 比してすっと少く300γ耐性株では殆んど穿刺線 に沿う発育を示したにすぎなかった。鞭毛染色 （Lδffler氏子）では原株が周囲多毛性の長v・鞭毛 を多数有しているのに反して50γ耐性株は殆ど鞭 毛を認めす稀にもっているものがあっても短く2 ∼3本程度であった。 6．耐性株の免疫学的性状 チフス菌のCM耐性株の抗原構造の変化に去て 設楽（3及び4）はH抗原の消：失を報じている。私は原 品及び血清培地の50γ耐性株11代の生菌及び1000 C1時閥加熱菌による家兎免疫血清を作りその各 汝に就て凝集反応，交叉凝集反応，吸収試験を行 った。 （i） 抗体吸収を行わざる交叉凝集反応 原株及び50．γ耐性株の生菌及び死菌免疫血清に 対する凝集反応は第三表の如くである。即ち生菌 及び加熱菌免疫血清に対する凝集価は原株と耐性 株との間に著しい差は認められなかった。 第三表 吸収試験を行ぽざる交叉凝集反応 1．原画生菌免疫血清について Itt−tt”’ti［iooti．ki−io16

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4．耐性株加熱菌免疫血清について

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（ii） 抗体吸収試験 原株生菌：免血清を耐性株生菌で吸収した揚合そ の上清は原株を3200倍迄凝集したが，耐性株生菌 免疫血清を子株生菌で吸収した場合その上清は耐 性株を凝集しなかった。又第四表2に示すように 原株加熱菌免疫血清を耐性株で吸収した場合その 上清は二二を凝集せす，耐性株加熱菌免疫血清を 稲株で吸収した場合もその上清は耐性株を凝集し ながった。原子生菌免疫血浩を耐性株生菌で吸収 した場合，その上清が原株を凝集するのは，耐性 第四表 抗体吸収後の交叉凝集反応 1．生菌免疫血清について

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2．加熱菌免疫血清について

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株に於てはH抗原が減少しているためと考えられ るのでd因子血清との凝集反応を行ってみた。即 ち戸田の100。C2時間加熱菌にて原株生菌免疫一血 清を吸収し，その一上清で耐性株及び原株の凝集反 応を行った。その結果原株は1600倍凝集されたが 耐性株は凝集されなかった。即ち耐性急に於ては d抗原の消：失若しくは減少が推定されるa 7．耐性株のマウスに対する毒性 13∼159のマウスを1群4匹とし，原株及び耐 性株の18時間斜面培養を0．05mg，0．1 m￡，0．2 mg，0．7 mg宛腹腔内に注射し3日半襯察した。 その結果は第五表の如く耐性株の毒性は二二に比 して著しく低下してv・たことを認めた。 8． 耐性株の発育曲線 中塚等（りによれば腸チフス菌のCM耐性菌の発

育は1ag Phaseが延長しlogarithmic phase

第五表 CM耐性菌のマウスに対する毒性 72時間後の窪霧・

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9．耐性株のマウスに対する免疫原性 ’ 耐性株は前述の様にH抗原の減少を示すがこの 菌でウサギを免疫した場合H抗体を産生するので マウスに対する免疫原性を原株とエ00γ耐性7代 に就て比較した。免疫方法は原株及び耐性株の普 通寒天斜面24博聞培養により菌液をつくり13∼・ 159のマウスの腹腔内に注射した。1回免疫群で は原株致死：量の1／10：量の菌を1回だけ注射し， 2∼3回免疫群では1週間隔で漸次増量して注射 しk。攻撃は最後の免疫より7証拠目に致死量 の1．5−2．5倍の原株を腹腔内に注射した。攻撃後

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画 5日以上生存したマウスの数の比を求めて原株と 耐性株の比較を行った結果，第六表に示す様に， 1回免疫群では明らかに原株の免疫力が強かった が，2回3回と免疫回数を重ねるにつれて耐性株 も相当多量の攻撃に耐える事が出来原株と略同様 の免疫力を示した。 10．耐性株の復帰に就て CM耐性株の復帰に関して宮川絢は， E． coli のCM 500γ耐性株は普通寒天に30代継代しても 原株感性（2∼ユ0γ）の5∼10倍迄しか復帰しなが った事を報じ，叉鵜飼（6）はパラチフスA菌のCM 一 J74 一

第六表 CM耐性株のマウスに対する免疫原1性 原点とCM 100γ耐性株との比較 電 撃 菌 畑 原 株 免

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第七表 CM50γ耐性36代言の復帰の感性

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10／10……平板に分離した集落10ヶについて耐性度を見た所，10ヶ全部がよく発育した事を示す 十1………1Nで澗濁した事を示す 耐性菌について略同様の威績を発表している。又 設楽（4）は2GOγ耐性腸チフス菌は3十三30代でH 抗原が復帰したと報告している。私は血清培地の 50γ耐性36代株を普通早天斜面に24時聞培養し， 以後全くCMを含まない斜面に継代して5代毎に 感性を測定した。1代の培養時間は約20時間であ る。感性測定の方法は三代の斜面培養からブ■ヨ ン20時間培養をつくり，この1白金耳を各種濃度 のCM入ブイヨンに移植培養iする方法と，斜面培 養の菌を寒天平板に分離して集落10（・20ケを三 三し，夫k’のブ・イヨン培養に就て各種濃度のCM 入斜面にそれを塗抹する方法とを用いた。成績は 第七表の如くで，判定は大体72時聞後のものであ る。ブイヨンで測定した揚合は約20代で耐性度が 一ノtP一一

低下し始め，復帰55代では原株感性の倍迄低下し た。単個集落に就て斜面で測定した場合1日目は 陰性でも2日，3日と培養すると1∼数10ヶの小 さい集落を生じたものがあり，ブイヨン測定の揚 合より復帰が遅かった。 叉試験管内のみの復帰だけでなくマウスの体内 通過による復帰実験も行ってみた。即ちSOγ1耐性 53代，100γ耐性7代株をブ・イヨンに1白金耳宛 うえ，その20時間培養の0．5ccを139前後のマウ スの腹腔内に注射し，翌日麗死したマウスの心臓 より菌を分離しこれをブイヨンで増殖して2代目 のマウスに注射し，同時に分離した菌の耐性度を 測定した。0，5ccで死なない揚合はエーテルで殺 して直ちに菌を分離した。その結果tli 507耐性株 では20代よIJ，100γ耐性株では19代より耐性が 低下し始めたが試験管内に於ける復帰の揚合との 間に差は認められなかった。 伺50γ耐性U代の復帰35代株に就て形態，生 物学的性状を検査したのに，集落にはR型が多く 一般に大きく，耐性株特有の小さib S型は少なか った。菌体はやや膨大し，染色性は一様ではない が，L6ffler氏鞭毛染色により原株と略同様の周 囲多毛性の鞭毛を認めた。運動は懸滴標本で比較 した結果，原株、と同程度に活濃であ1，0．7％半 流動寒天に穿刺培養を行った結果，強い溺濁を示 した。糖分解試験では原株と同様にソルビットを 分解しグリセリンの分解も速くなった。 総括及び結講． 1． CM耐性腸チフス菌は雑株に比して菌体がや や膨大し両端やや濃染し，運動性著しく弱まIP且 つ鞭毛は減少するか若しくは消失する。 2。 耐性株は糖分解試験に於てソルビットを分解 せす且つグリセリンの分解が遅れる。 3．蓋耐性株は抗体吸収試験によりH抗原が減少し ていると思われ，る。 4．耐性株は発育が悪く，Iag phaseが延長し， stationary phaseに於ける発育も原株の約65 ％ である。集落は一般に小さく透明である。 又耐性株はCM入培地でも普通培地より発育悪 く依存菌になP難いと思われる。 5．耐性株のマウスに対する毒性は原株より弱 V）0 6． 耐性株のマウ．スに対する二免疫原性は1回免疫 では原株よIP劣るが高度に免疫すれば原株と同程 度に高くなる様に思われる0 7． 507耐性菌の復帰は普通寒天斜面に継代した 揚合理20代で始まり，55代でも省原株感性の2倍 を有している。単個集落に就ての復帰は集落間に 相当な差が認められる。マウスの体内通過による 復帰は約20代で始』まったがそれは試験管内に於け る復帰との間に差を認められない。 8． 復帰株は鞭毛を再現し活露な運動を行い，生 物学的性状も原口と同様となった。 終りに臨み，終始御懇篤な御指導と御校閲を賜わり ました平野教授，並びに種々御助力を賜わりました中 西助教授に衷心より感謝致します。 〈1） （2） C3） C4） （5） ｛6） 文 献 R． M． Smjth：J． Bact． 55， 425． （1949） 寺田，設楽：東京医事新誌68，3，7．（昭26） 申塚，荒谷1ペニシリンと抗生物質皿∼13，834． 設楽：’_{恆蜴G誌66，3，63．（昭27）} 宮’li ：慈大渠筐誌66，3．18． （日当27） 鵜飼：慈大雑誌66，3．96．（昭27） 一一 176 一一