動物組織における焦性ブドウ酸の脱炭酸と酸化の機構について

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（東京女医大回第26巻第9号頁441−444 巨召禾031年9月）

動物組織における焦性ブドウ酸の脱炭酸ご

酸化の機構について

東京女子医科大学生化学教室（主任松村義寛教授）

助教授

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ホソ

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憲

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マサ

（受付昭和31年8月20日）

焦性ブドウ酸（ピフレビン酸）CH3。CO e COOHは糖質代謝の中間に生ずる重要な物質である。無酸素状一こおいて筋肉を収縮させるような場合，云い換えると動物組織によって酸素を消費しないで糖の分解現象が起る場合には解糖（glycolysis）の結果生ずる焦性ブドウ酸は乳酸となる。酸素が存在し，酸化現象が見られる場合には，焦性ブドウ酸はクエン酸回路（又は Tricarbox亨lic Acid Cycle略してTCA−cycle）にはいって炭酸ガスと水とに迄完全酸化されてしまう。ビール酵母にみられる糖の醗酵現象では，焦性ブドウ酸から脱炭酸してアセトアルデヒドを生じ，更に還元されてエチルアルコールになる。また細菌においては焦性ブドウ酸から酢酸，オキザ・酢酸，ギ酸，アセトイン等が生ずることが観察されている。筆者は歴史的経過を略述すると共にここ数年聞（CoAの発見以後）急速に進歩した焦性ブドウ酸の代謝過程及び機構を筆者の得た鄭見を併せて記述したい。アセトアルデヒドの生成（carboxylaseの作用）焦性ブドウ酸が生体によって代i謝されることを始めて観察したのはNeuberg， K：arczag（1911）である。焦性ブドウ酸がビール酵母により脱炭酸されてアセトァフレデヒドを生ずる。この反応を触媒する酵素をピー 7レ酵母中に見出して，Carboxylaseと名づけた。 CH3．CO e COOH一一＞CH3 e CHO十COL，

Anhargen （，1932）はビール酵母をアルカリ性燐酸塩で洗うとCarboxylase作用が消失し，あとに酵素の蛋白部分のみが残り，源條によって失われるものは， Mg＋＋と鮒熱性有機化合物であることを確め，このものを翻えると酵素活性が復活することを観察した。そしてこの耐熱性の有機化合物をCocarboxylaseと名づけた。Simola（1932）はこのものにビタミンB］作用のあることを見出したが，Lohmann， Schuster（1937） 2）は結晶状に取り出し，ビタミンBlのピ・燐酸エステル（Thiamine・pyrophosphate TPPと略す）であることを明らかにした。

N＝C−NHo H

・・

焉E畷：ユ。＿。瓢覧．

N−CH 1 ［i II

CH， O O

この仕事は水溶性ビタミンがBaseとなり，これに燐酸がNucleotlde様｝こエステt）レ結合して，酵素の助酵素になるという現在の酵素化学の先駆となった。酵母Carboxylaseの精製はGreenら（1941）5）， Kubowitzら（1941）4）によって行われた。ピー7レ酵母から純粋の状態にとり出され，0．46％のTPPと0，13 ％のMg＋＋を含む蛋白質で，分子量約7S， eoo， Aag H−

19原子がTPP19分子と蛋白質部分との結合を媒介

している複合蛋白質であると考えられた。しかし焦性ブドウ酸を脱炭酸してアセトアルデヒドを生ずるCarboxylaseは酵母に証明され，きらに植物界にも証朋されたが，動物組織には証朋されていない。ケトールの生成（Carbo！igaseの作用）

Greenら（1942）はCarboxylaseが動物界に見ら

れないことから，動物体ではこのような反応はあっても脱炭酸された結＝果はアセトアルデヒドが生ずるのではなく，別のものが生ず．るのであろうと考えた。焦性ブドウ酸が無酸素的反応で脱炭酸がおこるときは，ケ

Norimasa HOSOYA （Dept． of Biochemistry， Tokyo Women’s Med． Coll．）： Mechanism of Decarbox− ylation and Oxidation of Pyruvic Acid in Anirnal tissues．

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トドル（アセトイン）CH3。CO・CHOH・CH3

を生ずることを確めた。しかし，この反応は以前から酵母や細菌では見られていた。最初にこの反応を記載したのはNeuberg（1921）で，酵母により焦性ブドウ酸とベンズアルデヒドとからphenyl−acetylcarbino1の生成を証明し，この反応は焦性ブドウ酸にcarboxylaseが作用して発生機のアセトアルデヒドを生じ，これがベンズアルデヒドと縮合するものと考え，この後者の反応を触媒する酵素をcarboligaseと名ずけ， carboxylaseとは異なるものと考えた。

CH3・CO・COOH→〔CH3・CHO〕十CO2

（CH3’CHO）十C6Hr，“CHO．CH3．CO．COCH．C6H．r しかし，この種の反応はベンズアルデヒドに限らず，一般のアルデヒドともケトールを生ずる，焦性ブドウ酸とアセトアフレデヒドとからアセトインを生ずるのみでなく，2分子の焦性ブドウ酸からもアセトインを生成する。

cH3．co．cooH十cH3．cHo−cH3．coecHoH．cH3

十CO2 2．CH3・CO・COOH→CH3・CO。CHOH。CH3十2 CO2 Dirscherl（1930）はCarbojigaseの存在を否定した。そしてCarboligaseなる特殊酵素が存在するか．否かは多くの研究者によって論争されて来たが，今日では一般に焦性ブドウ酸からケトールの生成を触媒する酵素をCarboligaseと考えている。 Green ら（1942）5）は動物組織にはCarboxylaseはなくCarboligaseの存在することを確めたのである。しかし，この酵素もCarbOXylaseと同じ様に助酵i素としてTPPを必要とし，またMg＋＋をも必要とすることを立証した5）6）。酢酸の生成（酸化的脱炭酸）実際動物体内では酸素が存在して酸化される場合には焦性ブドウ酸は炭酸ガスと水とになってしまう。この意味で焦性ブドウ酸の酸化現象が観察され，この時にはまず酢酸が生ずるであろうと考えられていた。 Barron， Miller（1932）7）は淋菌浮游液につき，焦性ブドウ酸が酸化されるときに，メチレン青（M，B．）が還元されて・イコメチレン青（L．M。B。）になることを観察し，この反応を触媒する酵素を焦性ブドウ酸脱水酸素Pyruvic dehydrogenaseと呼んだ。

CH3．CO．COOH十＞60，一CH，．COOH十CO，，

CHB．CO．COOHx ／MB

l

CH3．COOH ／i X＞，LMB

CO2 Krebs， Johnson（1937）8ノは動物組織においても焦性ブドウ酸の酸化的脱炭酸によって酢酸と炭酸ガスとの生成することを認め，このとき好気的条件下では酸素が，嫌気的条件下では焦性ブドウ酸そのものが水素の受容体になると述べたQ

CH3．CO．COOH十r260，一CH3．COOH十CO2

2cH30co．cooH十H20一．cH3eCOoH十CO2

十cH，．cHoH．cooH

しかしこの酵素がCocarboxy工aseを必要とする B1酵素であるかどうかは分らなかった。こうした時にLipmann（1941）9は…ダや人であるために祖国ドイツを追われ，オランダ・フランスを転々として米国に落付くまで，様に実験も出来なかったが，今迄の生化学の業績をよく勉強して考えた。そして生物体内の化学変化には熱力学の第一法則しか適用出来なかったのを，ATP＊を中心とした高＝ネフレギー燐酸結合の存在を提唱し，熱力学の第二法則も生物体中で成立することを説明し，生体内の化学変化を熱力学的に解明出来ることを立証した。このことは生化学という学問の様相をも変え，現在生化学の急速な進歩の最大な要因となった。この説明にLipmannは焦性ブドウ酸の酸化と高エネルギー性燐酸結合との関係を上げているQ彼はLactobacillus delbrttckiiにおいて，Mg＋＋， Mn＋＋， Co＋＋，燐酸， TPP， FAD＊＊（Flavin−adenine−dinucleotide）の存在のもとに次の様な反応がおこると考えた。この反応では水素受容体はFADであり，生じた還元型FADは好気的条件下では酸素により，嫌気的条件下では焦性ブドウ酸によって再酸化される。またメチレン青（M．B．）は酸素にかわって水素受容体となり＊ ATP＝Adenosine triphosphate Adenine−ribose一一（Drv（DtvO 匹有磯塩基）（五単三l adenosine

Iuh，i

adenosine−mono−phosphate ＝AMP

iwh l

adenosine−di−phosphate＝ADP ＊＊ FAD＝＝Flavine−Adenine−Dinucleotide Flavine−ribitol−G−e−ribose−Adenine

l一一．一1

Ribofiavine ビタミンB2 adenosine−tri−phosphate＝ATP ⑪二燐酸 ∼㊥；高エネルギー燐酸結合一 442 一

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CH，， CH3

醗 1言；胆1即

CH，／＼還元型FAD

ll：）（器品

6〈／g．得るし，過酸化；水素が酸化に利用され得る。とくに重要なことは中聞に高エネルギー燐酸結合であるアセチル燐酸を生じ，ATPの生成されることを証朋したことである。Lipmannはこの様な反応機構をPhosph− oclasticな反応と呼び， Escherichia coliやClostri． dium butylicum中にも同様な酵素系のあることを報告した。しかし動物組織ではアセチル燐酸の生成は全く見られない。またこのようなPhosphoclasticな反応は細菌においても常に認められるものではない。Stumpf（1945） 10，はProteus vulgarisの焦性ブドウ酸酸化に際して無機燐酸の存在も必要とせず，中立産物としてもアセチノレ燐酸の生じないことを認めている。動物組織についてはGreenら〔1947）11）がノ・トの胸筋の焦性ブドウ酸を酸化する酵ii饗が，無機燐酸， FA D，ATP， Cytochrom C＊等の存在がなくても， TPPの存在において焦性ブドウ酸を活性化し，分子状の酸素，フェリシアン塩，メチレソ青と反応して酢酸を生ずるとi報告した。さらにGreenら（1948）12）は TCA・cycleの酵素系の研究において，上述の酵素と同じものがウサギの腎，肝，心，脳，筋に存在することを報告し，TCA・cycleの酵素系の存在は焦性ブドウ酸を完全に炭酸ガスと水とにまで酸化することを：立証し，焦性ブドウ酸の酸化する酵素を焦性ブドウ酸酸化酵素Pyruvic oxidaseと名付けた。 CH3・CO・COOH十H20 十2 Fe＋＋＋一cyanide→ CH3。COOH十CO2十2 Fe’＋＋一cyanide十2H＋ Jagannathan，Schweet（1952）！5）はハトの胸筋からこの酵素を精製している。活性酢酸（アセチノレ・Coenzyme A）の生成焦性ブドウ酸の酸化において酢酸のみを生ずるのではおかしい。なぜならばTCA・cyc］eの存在において先づ第一に出来るものはクェン酸であり，このものは炭素数が6ケである。 TCA・cycleの最：後のものであるオキザ・酢酸は炭素数が4ケである。オキザ・酢酸と焦性ブドウ酸とからクエン酸が出来るならば，焦性ブドウ酸は脱炭酸されるのだから炭素数が2ケのものとなり，このものがオキザ・酢酸と縮合してクエン酸を作るのであろうと考えた。しかしこの炭素数2ケのものがいかなる型のものか全く解らなかったので，C2 化合物，あるいは活性酢酸と呼んでいた。 Liprnann（1945）！4・によってこのものがパントテン酸の誘導休であることが分り，彼はこのものをパントテン酸の誘導体である助酵素A（Coenzyme A，酪してCoA）＊＊に酢酸が高エネルギー結合の状態に結合したアセチル。助酵素Aであると提唱した。このアセチルーCQAが実際パン酵母細胞からLynenら（195／） 16♪により取り出されるに及び，この劃期的な仕事は第二次大戦に惨敗した敗戦国ドイツの化学の意気を示すと共に，焦性ブドウ酸酸化の代謝過程の研究．1こ急速な進展をもたらした。Ochoaら（195！）17）はEscherichia coliの焦性ブドウ酸酸化系につき， Green門下のLi− ttlefie］d， Sanadi（1952）18はハトの胸筋の精製焦性ブドウ酸酸化酵素について，筆者ら（1954）19・20）は犬心筋の焦性ブドウ酸酸化酵素について研究した。焦性ブドウ酸はTPPとMg÷＋との関与によりこの酸素の作用を受けて脱炭酸し，CoAの存在においてD PN＊＊＊を水素受容体として酸化きれてアセチルーCoA を生ずる。CoAは一SH基を持っており，アセチル基はこの一SH基と高エネルギー結合をしている16L。焦性ブドウ酸からアセチルCoAを生ずるまでの反応を触媒している酵素が単一のものであるかどうかは疑わしい。むしろ酵素系と老える方が妥当であろう。

TPP，Mg”

CH．gtcO．cOOH十CoA十DPN一一一一Y

（CoA−SH）

CHaeCOtvS−CoA十DPNHL，十2e

出来たアセチルーCoAはオキザロ酢酸と縮合してクエン酸を生じ，TCA−cycleに入って酸化され，また生体内にて脂酸，コレステリンが，合成される場合に＊鉄ポルフィリγ蛋白体で，酸化現象において電子の伝達に重要な役割をしている。＊＊助酵素A，Coenzyme A：Ochoaら（1954）15）によって構造式が明らかにされた。 Adenine−ribose−Ot．．一（［E）一pantothenic一（ B−mercapto−ethanol−aT．nine）

1 acid

② パントテン酸

＊＊＊ DPN＝＝Diphospho pyridine nucleotide． nicotinlc amide−rlbose一（1i）一〇t．一ribose−adenine．

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はアセチルーCoA・が出発点とな．り，また『リンにアセチル基を転移してアセチフレコリンを作り，また薬物をアセチル化して解毒作用を行う重要な物質である。焦性ブドウ酸酸化の代謝過程焦性ブドウ酸からアセチルーCoAを生成する反応は焦性ブドウ酸酸化酵素によって行われる。この場合脱炭酸にはMg＋＋あるいはMn＋＋とTPPが必要である。山村らはCarboligaseとpyruvic oxidaseとは別の酵素であると云うが，筆者ら1920）や，Green一派18）の研究ではpyruvic oxHaseの申にCarboligaseようの作用がみられる。すなわち嫌気条件で，電子受容．体を添加しない場合，焦性ブドウ酸から脱炭酸してアセトインを生ずる。筆者らによれば19）20）この反応は重曹緩衝難中では非常に弱く，燐酸緩衝液中では酵素も保護され，アセトインを生成するがアセトアルデヒドを添加すると数倍に増量する。しかし，アセトアルデヒドのみからはアセトインが出来ない。電子受容休としてKuFe（CN）6， D P N，メチレン青を添加すると酸化的に脱炭酸がみられ酢酸を生成する。この場合は燐酸緩衝液を用いる場合よりも重曹，炭酸緩衝液を用L．｝る場合の方がよい。故に焦性ブドウ酸は動物組織では脱炭酸されて，まつアフレデヒドー酵素一複合体（aldehyde−enzyme− comp王ex）を生成するものと考えられ，電子受容体あるいは水素受容体が存在すれば，酸化が起って酢酸を生じ，存在しないときには遊離のアセトアフレデヒドと縮．合してアセトインを生成するものと思われる』

CoAが存在し，電子受容体としてDPNを用いる場

合，焦性ブドウ酸からの炭酸発生と，アセチルーCoA の生成量を観察した。アセチフレニCoAはオキザ・酢酸を添加し，縮合酵素によってクエン酸を生成し，そのクエン酸を測定した2ユ。反応系にCoAを添加し．て一定旧聞反応させた後でDPNを添加したもは，その逆に添加した場合よ．りもクエン酸の生成量が多い。故に焦性ブドウ酸から脱炭酸して出来るアルデヒド酵素複合体はCoAが存在するとア7レデヒド基が転移してAc− etyj−CoA hydrideの型になり．， D P Nの存在のもとに酸化されてアセチルーCoAになるものと考えられる。 iTPP Mg” ’

・H、・・…H曲・・H。←一一・H、・・H・一一→／・HバC−S−C・A）

アセ・トイン C．Ha．。CO・COOH（焦性ブドウ酸）

CHO．CH3

燐酸

_{k 〕HS執§H〕}

（灘ア7，レデヒド）

_{ｫR，翫㍑MB●．↓・・N}

CHg．．CO−S−CoA

CH3・COOH（酢酸）

／（アセチフレーCoA）

cooH一一co−cH，rcoofl oH gt

（ザ撃CO冊1設論OH

l．・（クエ卵

／ x

CO2 02

（TCA−cycle）最近焦性ブドウ酸からアセチ7レーCoAの生成過程について電子転移体としてlipoic acidとTPPとの結合したものが問題になっているが，このものは大腸菌の様な細菌においてみられ，動物体中では問題にならないし，反応過程も複雑であるので省略する＊。ビタミンB1の活性基について一体活性アルデヒド，アルデヒド酵素複合体（alde− hyde−enzyme complex）とはいかなるものであろうか，CoAが未発見の時に，アセチルーCoAを’！active

acetate「／または「！acetate enzyme complex’iと云って

いたように，この複合体をaldehyde−cocarboxy］ase （TPP）cOmplexと考えたい。何故ならば，焦性ブドウ酸の脱炭酸に必要な，ビタミンの誘導体である

nucleotideようのものはTPPのみであるからであ

る。それならばTPPのどこ．ﾆ結合して複合体を作るのだろうか。三井（1946）22．は，かつて大豆のCatboxyJaseが焦性ブドウ酸，TPPとMg＋＋を中心として不安定な錯．化合物を作って作用すると考えられたが，焦性ブドウ酸酸化酵素の活性基もやはりTPPに求めで考えなければならぬ。ビタミンB1の同族体について生理作用と化学播造との関係をしらべ℃みると，ピリミジン部の4t位に一NH2が存在すること（一〇Hがついているとanti− vitamin作用を示す）。＊：文献1を参照されたい。一 444 一

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N二こC−NH2 H

・Hガ

P：ili÷一CH叩く繧．CH、．。H，。H

N！工CH

ビタミンB1 1

CH，

H OH

N＝＝C−NH2 ×／

・Hボ

撃戟雌?FユCH，．CH，。H

N−CH I

CH．？ Pseudobase型

・恥

二Ｎぐ隔ゴ。 H

N−CH l

CH2

Thiol型チアゾドル部の2位1（一H，5位にβ一オキシニチル基が存在すること，e” 1）ミジン部とチアゾール部とがメテソ橋で結合していることが必’要である。水原（1951）25）はチアゾー一 7レの3位のNがPseudo− baseを形成し，活性アルデヒド生成の活性基となっていると考えている。一方松川ら（1953）24）はチアゥール核が容易に開環するζと「から，開環によって生ずるThio1型の一SHに活性基を求めている。筆者ら20）25）はまつ阻害剤によって検べてみた。犬心筋の焦性ブドウ酸酸化の反応系に阻害剤を加えてみたが阻．害翻の影響はみられない。酵素蛋白に一SH阻害剤を作用させた後に，反応系を組立ててみると阻害効果がみられるので，酵素蛋白．部分では一SH基が複合体を作るのに必要なものであろう。

TPPを氷冷しながら一時pH10にして，チアゾー

7レを開環させ，モノ沃度酢酸， P−chloromercuribenz− oate（p−CMB）を結合させたのち，中性にもどし，助酵素として作用をしらべると，犬心筋の焦性ブドウ酸の酸化的脱炭酸活性の低下をみた。故に松川らの云うようにチアゾール核の一SH基も活性である。またT PPをライネッケ塩と共に作用させて，焦性ブドウ酸酸化系に，助酵素として加えてみてもやはり活性度は．低下するので，水原の云うようにPseudobaseも活性基であると思う。またOxythiamine pyrophosphate も助酵素としては作用がないので，ピリミジン部の一NH2も活性基であると思う。また筆者5）はTPPわよびBエに一SH阻害剤である

p−CMBを結合させたものをchromatographycally

に取り出し，このものについて，TPP作用のないこと，また水原の行った実験条件でB、作用のないことをも一覧）ナこ25）o

結局のところTPP，ビタミンBJの活性基として

はピリミジンにつく一NH2，チアゾールの開環によって出来る一SH， Pseudo baseの≡…点であろう。筆者の考えでは26，，ビタミンBlのチプゾール部5 位のβLオキシエチル基に・燐酸がピ・燐酸の型に列び， Mg＋＋を介して酵素蛋白の一SH基と結合して酵素を形成する。三点の活性基は互に共q嘱し合っており，基質が存在すると容易に三点で結合し，不安定な錯化合物を作って作用するものと思う。だから反応系に阻害剤を入れても，活性度の低下は見られない。この活性基の問題の解決，さらに活性プルデヒドが酸化されて’活性酢酸すなわちアセチルーCoAへの生成過程の詳細な機構の解明は今後の研究の焦点である。最後に本題に関する研究に対し，御指導，御援助下さった東京大学医学部生化学教窒島薗順雄教授に対し，深甚なる感謝の意を蓑し．ます。また研究に協力下さった共同研究者の倉富一興，青島雄吾，真野嘉長，掘江滋夫，田原芳馬，石川晋次君らに厚く感謝致します。文献 1）島薗順雄，細谷憲政；生体の科学，6，254∼262 （1955）

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25）倉富一興，細谷憲政：第28回日本生化学会総会（1955）．生化学，28，特別号，77（1956）

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