白血球 filterability に影響を及ぼす各種薬剤の検討

原 著 〔東女医大誌 第64巻 第3号頁208∼214平成6年3月〕

白血球丘lterabilityに影響を及ぼす各種薬剤の検討

東京女子医科大学 脳神経センター       コ     セキ       小  関 神経内科学（主任 丸山勝一教授）  ユ     カ

由 佳

（受付 平成5年11月19日） Efεects of Various Pharmacological Agents on Leukocyte Filterabi藍ity        Yuka KOSEKI Department of Neurology（Director：Prof． Shoichi MARUYAMA）， Neurological Institute，        Tokyo Women’s Medical College   Leukocytes are large and rigid cells， and by adherence to the vascular endothelium they can perturb the normal flow dynamics of the microcirculation． Under ischemic conditions，1eukocytes may become activated and release l2ukotrienes， free radicals， and platelet−activating factor（PAF）， which act to increase their adhesiveness and further impair the microcirculation． Several clinical studies have shown that decreased leukocyte filterability may possibly be associated with the pathogenesis of microcirculatory impairment．   The purpose of this study was to explore the effects of pharmacological agents on leukocyte filterab量lity． Leukocytes were separated from whole blood obtained from healthy volunteers． Formyl一 ；nethionyl−leucyl・phenylalanine（FMLP）， prostaglandin E1（PGE1）， prostacyclin（PGI2）， the cy‡oplasmic calcium antagonist TMB・8， and the antioxidant ebselen were added to the leukocyte suspensions，and leukocyte filterability was measured with a St． George’s filtrometer， The changes of leukocyte filterability caused by ebselen and TCV309（a PAF antagonist）were determined after stimulation with PAF． FMLP and PAF decreased leukocyte filterability， while PGEI and PGI2 improved the filterability． In addition， ebselen and TCV309 improved the filterability of activated leukocytes．   The present in vitro results suggest that pharmacological improvement of leukocyte filterability may be a new strategy for treating microcirculatory impairment in the penumbral zone in patients with cerebral ischemia．       緒  言  白血球，特に多形核白血球や単球は炎症反応時 や虚血時などに活性化され，遊走能の充進，脱穎 粒現象などにより組織障害を引き起こすことが知 られている．特に注目されているのは微小循環に 及ぼす影響であるn．すなわち，白血球は流血中心 も大きな有形成分であり，毛細血管通過時に血管 壁内の酸素供給の低下などを契機に内皮との接触 が密になり2），また，活性化された白血球から放出 されるロイコトリエンやplatelet−activating fac・ tor（PAF）， superoxideの作用により白血球一内 皮細胞間の粘着が充進ずることにより3），微小循 環障害を引き起こすことが示唆されている．実際， 脳血管障害急性期4）‘）や慢性期6），虚血性心疾患7）に おいて白血球丘1terabilityの悪化が報告されてお り，微小循環障害の要因として白血球mterability

の関与が注目されている8）．そこで今回，St。

George’s mtrometerを用いて各種薬剤のin

vitroにおける白1血球filterabilityに及〃ます影響 を検討した．       対象および方法

 informed consentを取得した健常人の肘静脈

より，formy1−methionyl・leucyl−phenylalanine

（FMLP）使用時はethylenediamintetraacetic

acid（EDTA）1mg／mlを，．

ｻの他の薬剤使用時は

ヘパリン1，000U／m1を用いて静脈血を採取した．

モノポリ分離溶液と静脈血を3：3．5の割合で使

用し，400G，30分遠心分離した白血球層を抽出し た．抽出した白血球にHEPES， Tyrode’s bufFer （2．7mM KCI 201mg〃，138mM NaCl 8．065g〃，

1mM MgC12203mg〃，3．3mM NaH2PO4515

mg／1，5．5mM Dextrose 991mg〃，3，5mM

HEPES 834mg／1）を加えて洗浄し，再度400G，

10分間遠心した．沈澱した白血球をHEPES

Tyrode’s bufferにて1，000∼1，200／mm3に調製 し，自血球浮遊．液を作製した．作製した白血球浮 遊液を37℃で10分間incubateし，その後各種薬剤

を添加し，さらに37℃，5分間incubateした後白

血球mterabilityを測定した．使用した試薬およ

び終濃度は以下の通りである．

 ①0．1μMFMLP（Sigma Chemical， St．

Louis， u．s．A．）：白血球遊走ペプチド，②o．1μM PAF（フナコシ，東京）：血小板活性化因子，③1

μMプロスタグランディンEユ（PGE1；Sigma）：

赤血球変形能充進薬，④10ng／mlプロスタグ．ラン ゲイン12誘導体（TEI7165；大正製薬，東京）：抗 3 2 1 1 19基 5 6 7 8 _9   10 11

＼、

  12 ／^’

@ 13

@ 筆4

@ 15

＝＝二二，．』＝7＝ニ ．＝二＝一＝＝…二＝＝二 二㌦＿…盛罫．

O

oo 16 P7 P8 P9 ラボ・ジャッキー ?@槽 求[ラー Kラス栓 r出ロ oック・ハウジング tィルター膜（メンブラン） ＜塔uラン保持用0リング Eォータ・ジャケット（特注品）  7検知ユニットキャビラリー管フィルター・チャンバー Aクリル・プリズム      5 6 811 ＼ 検体注入部 tロント・ハウジング 謔阨tけネジ 謔阨tけ盤 謔阨tけ台 﨟@台 鰭… 15  12 P4 図1 St， George’s丘ltrometer   St． George’s nltrometerの各部位の名称

血小板凝集薬，⑤0．1mM 3，4，5−

Trimethoxybenzoic acid 8・（diethylamino）octyI ester（TMB−8；Sigma）：細胞内Ca2＋拮抗薬，⑥ 10μM2−phenyl−1，2−benzisoselenazol・3（2H）一〇ne （ebselen；第一製薬，東京）：抗酸化剤（抗白血球 凝集剤），⑦10μM 3−bromo−5一〔N−pheny1−N一〔2一 〔〔2一（1，2，3，4・tetra−hydro−2−isouinolyL

carbonyloxy）ethyl〕carbamoy1〕lethyl〕

cabamonyl〕一1−propyl−pyridinium nitrate

（TCV309；武田薬品，大阪）：PAF受容体拮抗

薬．  白血球filterabilityの測定は， St． George’s 創trometer（Carri−Med社， London）を用いて測 定した（図1）9）．St。 George’s且ltrometerをよ少量

の濾過物が通過するキャピラリーに3つのタイム

インターバルを設定することにより少量の濾過物 の測定ができるようになっている．フィルターは

垂直に設置され，どのporeにも均等に圧がかか

り，沈降による濃度変化が最小限になるように設 定されている．白血球浮遊液をキャピラリーに満 たし，チャンバーを開けると検体がキャピラリー

を通過し，4対の光源と検知器が管壁の内面にお

ける反射光輝度の変化を検知し，検体のキャピラ リー内流量をマイクロ秒の単位で計測し，3つの 濾過率を基にコンピューターが次の指標を画面上 に表示する．指標としては，相対濾過率：relative 丘ltration rate（rFR），閉塞率：clogging rate （CR），閉塞粒子数：clogging particles（CP）が

表示されるが，各指標は次の計算式よりコン

ピューターで自動的に算出される．  rFR＝平均基準化時間／懸濁液時間

   1一初期相対濾過率／相対濾過率

      （／ml）

 CR＝

        標本容積

 CP＝CR×有効pore数（×105／m1）

 負lterabilityは3cmH20の陰圧を加え，8μmの

Nucleopore⑪（Costar社， U。S．A．）を用いて測定 を行った．  結果は平均値±標準偏差で表し，統計解析には Student’s dependent t−testを使用し， p＜0．05を 有意差ありと判定した．          結  果

 PAFの添加によりrFRは0．97±0．16から

0．80±0．14へ（p＜0．05），CRは1．57±0．23から 3．21±0．71へ（p＜0．01），CPは4．07±0．59から 7．76±1．47へ（p＜0．01）といずれも有意に悪化し

た（図2）．また，FMLPの添加によりrFRは

0．99±0．10から1．07±0．13へと，有意な変化を示 さなかっ、たが，CRは2．10±1．03から4．12±1．87 へ，CPは5．45±2．67から9．89±4．26へとそれぞ れ有意に低下した（p〈0．05）．このように，PAF，

FMLPともに創terabilityを悪化させたが， PAF

の効果がより著明であった．  PGE1によりrFRは0．82±0．11から0．94±0．09 へ（p〈0．05），CRは3．44±1．64から2．49±1．21へ （p〈0，01），CPは8．94±4．26から6．48±3．14へ （p〈0．01）といずれも有意に改善し，PGI2誘導体

であるTEI7165では， rFRは0．74±0．20から

1．20±0．42へと，有意な変化は見られなかったが， 廷 7 ニら   § き、 4 3 2 1 o 15 1．o O，5 o．o

「一

前   後

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前      ヨ_★一

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“＝P（0．05 ・・ Fpく0．01 噛2PAF 圏FMLP n＝5

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 前  後   前  後     前  後   前  後 図2 PAFとFMLPの白血球且lterabilityに及ぼす  影響

CRは4，39±0．82から2．32±1．27へ， CPは

11．41±2．13から6．18±．3．20へとそれぞれ有意に 改善した（p＜0．05）（表）．また，TMB−8では且lter− abilityの変化はみられず（rFRは0．86±0．20から 0．95±0．16，CRは2．66±1．34から2．38±1．31， CPは6．89±3．49から6，26±3．45）， ebselenに よってもrFRは0．81±0．11から0．86±0．16， CR は4，22±1．01から4．14±1．36，CPは10．96±2．65 から10．76±3．53と，いずれも有意差が認あられな かった．

 一方，PAF刺激下では， rFRはebselen添加で

は0．86±0．15から0．87±0．21へ，TCV309では 0．86±0．15から0．92±0．19へといずれによっても

有意な変化はなかったが，CRはebselen添加で

6．20±2．00から4．05±1．24へ，．TCV309添加では 6．20±2．00から3．31±ユ．23へ，CPはebselen添加 で16．11±5．19から10．54±3．23へ，TCV309では 16．11±5．19から8．13±2．19へと，CR， CPは煎剤 により有意な改善を認めた（p＜0．05）（図3）．          考  察  白血球は流血中の有形成分の中で最も大きな粘

性抵抗因子の一つであり，直径5∼6μmの毛細血

管通過に際しては常に変形する必要があるが，赤 血球に比べ約2，000倍もの硬度を有し，血管内皮と 粘着しやすいため，通常の循環状態においても毛 細管内通過に5∼6秒を要する10）．脳虚血時など の灌流低下時は白血球が活性化され，ロイコトリ

エン，サイトカイン，フリーラジカル；PAFなど

を放出し，これらがさらに血管内皮との粘着を増 加させ，また，白血球凝集充進や内皮の透過性充 進をきたし，微小循環障害を引き起こすと考えら れている3）10）．一方，Englerら7）は犬の心筋梗塞モ デルにおいて白血球丘1terabilityの悪化を報告し

ており，また，Vermisら6）はSt． Geroge’s

mtrometerを用い，慢性脳梗塞患者において白血

球丘1terabilityを測定したところ， mter clogging 表PGE、， TEI7165， TMB・8， ebselenの定常状態における白血球丘lterabilityに及ぼす影響 rFR CR（／ml） CP（×105／ml）

N

用量 前 後 前 後 前 後 PGEl sEI7165 sMB・8 dbselen 6598  1μM P0ng／ml n．1mM P0μM 0．82±0ユ1 O．74±0．20 O．86±0．20 O．81±0．11 0．94±0．09＊ P．20±0．42 O．95±0．16 O．86±0．16 3．44±1．64 S．39±0．82 Q．66±1．34 S．22±1：01 2．49±1．2P掌 Q．32±1．27寡 Q．38±1．31 S．14±1．36 8．94±4．26 P1．41±2，13 U．89±3．49 P0，96±2．65 6．48±3．14＊＊ U．18±3．20＊ U．26±3．45 P0．76±3．53 ＊：p＜0．05， ホ拳：p＜0．01． 臣 旨 1．5 1．0 0．5 σ0 乏 。．

昼 8

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症 歪 図3 PAF刺激下でのebselen， TCV309の白血球filterabilityに及ぼす影響 ＊＝pく0．05 （n＝6）

の増加を認めたと報告している．Mercuriら4）や CiuffetUら5）は脳虚血急性期において穎粒球と単

球の丘lterabilityが悪化していたと報告してい

る．また，当教室の佐藤11）は脳血栓症患者において 白血球丘lterabilityの低下を報告している．この ように白血球filterabilityは虚血状況下で循小循 環の増悪因子として病態生理学的に重要な意義を

有していると考えられている．そこで，白血球

filterabilityの変化，改善に影響を及ぼす薬剤の検 討は微小循環障害の病態と治療へのアプローチに 有意義と考え，今回の研究を行った．

 白血球創terabilityの測定法にはガラス毛細管

による吸引法，直視的生体顕微鏡による観察法， マイクロフィルター法などがあるが，今回使用し たSt． George’s丘ltrometerは持続低圧のマイク ロフィルター法である9）．この測定系で用いた指

標のうちrFRは大多数の白血球によって起こる

初期の急速な流速低下の程度を示し，CR， CPは より小さな比率を占める変形しにくい細胞が流れ に対する抵抗に与える影響を反映しており，白血 球の変形能，走化性，白血球間の粘着性を総合的 に反映していると考えられる．

 今回使用した化学物質のうちFMLPは強力な

白血球遊走ペプチドで，白血球一内皮細胞間の粘着 充進12）や白1血球の変形能悪化13）を惹起する作用の あることが報告されている．また，PAFは1血管内 皮細胞，血小板などで産生されるが，活性化した

白血球からも放出される．PAFは極めて多彩な生

物活性を有し，血小板凝集惹起，1血管透過性詠進， 血圧低下等の作用が知られている2）が，白血球に 対しては内皮との粘着充進14），血小板との粘着促 進15），さらに白血球相互間の粘着（白血球凝集）も

引き起こす16）とされている．PAFとFMLPは今

回の検討で白血球のmterabilityをともに悪化さ

せたが，これは両物質の白血球同志や白血球と

フィルター面との粘着高進作用や変形能低下作用

に関連していると推測される．また，PAFは

丘lterabilityに対し， FMLPに比べより強い悪化 作用が認められた．

 PGE、は末梢血管拡張作用や血小板凝集抑制作

用を有し，動脈硬化性疾患や血栓性疾患で臨床的 に広く使われている薬剤であり，PGI2は血管内皮

において生成され，PGE、より強力な血小板凝集

抑制，血管拡張作用を有し，さらにコレステロー

ル沈着抑制や内皮細胞のサイクリックAMPを上

昇させ，組織プラスミノーゲンアクチベーター

（t−PA）の放出を促し，線溶活性を高めることも報 告されている17）．また，Bathら18）はFMLPにより

刺激した白血球においてPGI2が走化性を抑制し

たと報告し，白血球の内皮への粘着の抑制作用の あることも示唆されている．さらに，本研究によ

り新たにPGE1とPGI2には白血球創terabilityの

改善作用もあることが判明した．  TMB・819）は細胞内Ca2＋拮抗薬であるが，当教 室の内山ら20）は脳虚血時には血小板内Ca2＋濃：度

の上昇がみられることを報告しており，また，

Huangら21）は白血球と内皮細胞との粘着に際し

ては内皮細胞内のCa2＋濃度の上昇が重要である

と報告していることから，今回白血球の創ter−

abilityに対するTMB−8の効果を検討したが，

TMB・8の添加によっては白血球五lterabilityは

変化しなかった．白血球filterabilityにおける

Ca2＋の意義については今後より特異的な他の白

血球内Ca2＋阻害剤による検討が必要と考えられ

る．

 ebselenはモルモット多形核白血球由来の

superoxideの産生を抑制し22），5−1ipoxygenase阻 害作用を有する化合物である．また，佐久間ら23）は

ヒトとラットにおいてebselen投与による白血球

凝集抑制作用を見いだしている．活性化白1血球は

superoxideを産生し，産生されたsuperoxideの

放出により白1血球が内皮を障害したとする報告24） や，多形核白血球の遊走性が充進ずることも示唆 されている25）．ebselenを定常状態の白血球浮遊

液に添加した場合には創terabilityは変化しな

かったが，PAF刺激により脳虚血部にて起こって

いると推測される状態に白血球を活性化し，mter− abilityを低下させた場合の且lterabilityに対して は有意な改善効果を示した．このことより，eb−

selenは活性化白血球のsuperoxide産生抑制作

用や白血球凝集抑制作用を介してmterability改

善をもたらした可能性が示唆される．従って，こ

の薬剤は白血球が活性化される脳虚血急性期にお ける白血球丘lterabilityの低下を改善し， penum−

braを中心とした脳虚血巣周辺の微小循環を改善

する効果が期待される．

 今回の実験で，PAF受容体拮抗薬である

TCV30926）はPAFによるfilterability低下を防

止する効果のあることが示唆された．当教室の内 山ら15）17）によれぽ，脳梗塞急性期では血漿PAFが 増加し27），白血球凝集能が充進しており15），この充

進はin vitroにおいてPAF受容体阻害薬CV−

3988やCV−6209により抑制されたという．脳虚血 急性期では虚血脳組織や活性化した白血球や内皮

から大量にPAFが産生され，白血球と内皮との

粘着性を増大させたり，白血球凝集を促進するこ とにより，ischemic penumbraと呼ばれる梗塞巣 周辺の可逆性虚血部の微小循環を障害して無点灌 流現象（no reHow phenomen），再謡言傷害（reper− fusion injury），遅発性虚血後低二流（delayed postischemic hypoperfusion）などの諸現象を惹 起することにより梗塞巣の拡大と神経症状の悪化 を招来すると考えられる27）28）．PAF阻害薬はこの

ような，PAFをchemical mediatorとする虚血

周辺部の微小循環障害を防止することにより神経 症状の悪化を阻止する効果が期待されている．  今回のin vitroの研究で， PGE1とPGI2は定常

状態における白血球の，ebselenとTCV309は

PAF刺激下の白血球のmterabilityをそれぞれ

改善する作用が認められたが，微小循環障害が関

与する血栓性疾患や虚血性疾患に白血球創ter−

ability低下が病態因子の一つとして注目されて

おり，白血球の創terabilityを改善させる薬剤の 臨床応用は，新たな微小循環障害の治療法となる ことが期待される．          結  論  脳虚血における微小循環障害には白血球の活性 化による遊走能，白血球凝集，白血球と内皮の粘 着性の二進に伴う白血球通過性の低下が関与して いると考えられることから，白血球且lterability に影響すると考えられる薬剤の検討を行った．in

vitroにおいてPAFとFMLPは白血球創ter−

abilityを低下させ， PGE、とPGI2の定常状態の，

ebselenとTCV309はPAF刺激下の白血球

創terabilityをそれぞれ改善する効果が認められ

た．今後，ex vivoでのこれらの薬剤の白血球

丘lterabilityに及ぼす効果を脳虚血との関連で検 討する必要があると考えられた．  本稿を終えるに当たり，御校閲頂いた丸山勝一主任 教授，御助言頂いた竹宮敏子教授，直接御指導頂いた 内山真一郎講師に深謝致します．          文  献  1）Ernst E， Hammerschmidt DE， Bagge U et al：   Leukocytes and the risk of ischemic diseases．   JAMA 275：2318−2324，1987  2）土屋雅春，末松 誠，鈴木雅之ほか：内皮障害を   めぐる酵素活性と細胞間相互反応．現代医療   23：1593−1596， 1991  3）Tonnesen MG：Neutrophi1・endothelial cell   interactions：Mechanisms of neutrophil adher−   ence to vascular endothelium． J Invest Der−   matol 93：53S−58S，1989  4）Mercuri］M【， Ciu仕etti G， Robinson M： Blood   cell rheology in acute cerebral infarction．   Stroke 20：959−962， 1989  5）Ciu促etti G， Mercuri M， Mannarino E et aL   Leukocyte rheology in the early stage of is−   chemic stroke． Klin Wochenschr 67：762−763，

  1989

 6）Vermes I， Strik F＝Altered leukocyte   rheology in patients with chronic cerebrovas−   cular disease． Stroke 19：631−633， 1988  7）Engler R正， Scbδnbein GW， Pavelec RS：   Leukocyte capillary plugging ln myocardia1   ischemia and reperfusion in the dog． Am J   Pathol 111：98−111， 1983  8）Grau AJ， Berger E， Sung K正 et ah   Granulocyte adhesion， deformability， and   superoxide formation in acute stroke． Stroke   23：33−39， 1992  9）Dormandy J， Flute P， Matrai A et al：The．   new St． George’s blood丘ltrometer． Clin Hemor−   heol 5：483−491， 1985 10）Belch JJ： The ro豆e of the white blood cell in   thrombosis． Current Medica｝Literature   Thrombosis，63−67， Sanofi Foundation for   Thrombosis Research Vol 3 No 3（1993） 11）佐藤美佳：脳梗塞患者における白血球と赤血球の   創trability．脳卒中 15：97−103，1993 12）Tonnesen MG， Smed韮y LA， Henson P：   Neutrophil・endothelial cell interactions． J CIin

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