抗 腫瘍 性

金沢大学 十 全 医学 会椎 誌 第9ニi巻 第¹号 147 ⁻15 8 く198 射

P ep t o c o c c u s m ag ^{n u s} の抗 腫瘍 性に 関 す^る研 究

金 沢 大学大学院医 学研 究科歯 科^l川空外科 学講 座く主 任^こ玉井健 三艶 聞

坂 下 英 明

く昭和^{5 9}年¹ 月³H^ヨ受 付1

147

T F 培地 中^{で 1}2 時間^から12 0時 間 培養し た Pep to c o c c u s m agn u sS T⁻1株の抗 腫 瘍性を， I C R 系マ

ウス に移 植し た^{エ ー} リッヒ腹 水癌およ び サ^{ルコ ー マ}1 8 0細 胞の固型腰瘍^{につ い}て研 究し た． 抗腫 瘍 性物 質 を， 1う培 養上浦 液よ り 6 0％^エタ^{ノー ル で}沈殿さ せ た分 乱 2ユ菌 体^を超 音 波 処理 し て得た 上清 液と沈澄^， 3 1 菌体 抽 出物よ り_pH 6．0， PH 4．0， pH 2．0 の等 電 点^にて沈 殿し た分 画の3 物 質に分 離し て検 討し た^． 3

へ 4 X lO⁷c e11s の癌 細 胞を皮 下^に移 植 後⁴8 時 間目よ り， 適度^に懸 濁調 整し た各^{々 の}3 つの物 質の 0^．25 ml づつを筋 肉 内 注射し た． 担 癌^マウ^スへの治療は 1 日 1 回 で， 1週 間続け た．

2 4時 間 培 養^の培 養上浦 液^の6 0％エタ^{ノ ー ル}分画が， エ ^ー リッヒ腹水 癌 細胞の固 型癌の担癌マウス に

対し て延 命 効果 を 示 し た． しかし， 4 8^一−12 0 時 間 培養^{に お い}て は， 活 性は認め ら れ な かっ た． 2 4時 間培 養

の菌体 超 音 波処 理 上清 液では， さ ら^に有 効な活性^が得ら れ た． 10 規 定塩 酸を加え， 超 音波 処理 上清 液 中よ りpH4．0 にて等 電 点沈 殿 し た分 薗が， これ らの3検 体 中^で最も高^い抗腫 瘍 性を示 し た^{． こ}の分画を投与し た^{エ ー}リッ ヒ腹 水 痛ま た は サ^{ルコ ー マ} 180 細 胞^の担 癌^マ ウス におい て， 延命日数は TノC く％I ^にし て 14 4^へ1 7 4％で あ^っ た． 6 0 日観 察^{にて， 1 0 匹}中3 匹のマウスが腫 瘍^{死 せ}ず， この結果は再確 認さ れ た． さ ら に_， 本 活性 物 質の問 題 点^およ び， 細 胞 免 疫 能強 化と関係し^{て い}る と考え ら れ る作用機 序に つ いて論じ た^．

Key ^{w o r}d^s A n a e r ob e s

， A ntitu m o r a ctivi_{t y}

， 勒^{to c o c cus m} 曙^{n u S．}

近 年， 細 菌お よ び その生成 物^の抗腫瘍 作用に関す る 研究は多数認 め ら れ る^{ト 71}． し か し， そ^のほ と ん ど は好 気性 薗^によ る研 究^であ り， 嫌 気 性^によ る抗腰瘍 性^の研 究は， C lo stri d ia，a n a e r Obic Co ryn eba cte riu m tPr o⁻ p i^{o n}iba ct_{e r}iu ml ^{の 一}部^に限 ら れ^{て い}る^{8−1 21}

わ れ わ れの教 室で は， 数年前よ り グ^{ラ ム}陰 性 嫌気 性 梓菌の Fu s oba cte riu m n u cle atu m に抗腫瘍 性^のあ る こと を i^n−Viv o で証 明し報 告し て き た が^{1 3 l}， こ の事 実

に関連してグラ ム陽性 嫌 気性 球 菌^にも抗腫瘍 性が あ る の では な^いかと考え， Pep to c o c c u s m agn u s につ い て 抗腫瘍性^の実 験を試^みた．

材 料およ び方法 I ． 実験 材 料^二

1 ． 使用薗 株^こ

実験^に供し た Pep to c o c c u s m agn u s S T−^{1株は， 口}

腔 内炎 症 性 疾 患の材 料よ り分 離 後， Co wa n 川お よ び Be rg^ey

，

s m a n u al^{1 51}にした がって同 定し， A PI 2 0 A

a n a e r obic syste m くLa Balm ele s Gr ot te s，M o ntalie u，

Fr a n c el ^にて同定し た教 室保 存 株^であ る^．

2 ^， 使用培地

前 培養には， 玉井^．福田の培 地^用 くT F培 地^． 日水，

東京I を使用 し た^．

ま た，本 培 養^には，T F処 方よ り寒天 を除^いた培 地を 用^いた． 以下T F 培 地 く寒天ぬきうと記す．

3 ^． 実験^に使用 し た癌 細 胞

教 室^で継 代し ている E hrlich 腹 水 癌 細 胞^およ び Sa r c o m a 18 0 細 胞を 用^いた．I C R 系^マウスく生後4 週，

体重約¹8 ^旬20 gう^の腹 部を剃毛 し， ヒ ビテンアルコ ^ー ルで消 毒し た後^に各^{々 の}癌 細 胞1．OX lO⁷c e11sJ^Imlの 0^．5 ml を腹腔 内に移植 維 持し た^． 移植 後1週 間 目に可 及的 無菌 操 作^{に て}乳 様^の腹 水を採 取し， 滅菌 生理食 塩 Studie s o n the A ntitu m o r A ctivit y ^of P w^{to c o c cus m d}g^{n u S ．} H ide aki Saka sh ita， D ep^{e r}t⁻ m e nt of De nt^二O^{r a}l Su rg^{e r}yく^{D ire cto r こPr of． Ke n z o T a m ai}l^{，S cho ol of M edicin e，K a n aza w a} U niv e r ci_{t y}．

1 4 8 坂

水^で細 胞 数を調 整 後， 実 験^に供し た．

4 ^． 実験 動 物^こ

実験^に使用 し た動 物は 工C R 系^マ ウス の生 後 約6 週 で， 体 重が約2 5^旬2 7 g のものを供し た．

工工． 実験 方 法

1 ． 担癌マウス の調 整^こ

教 室で 継 代し て い る E hrlich腹 水 癌 お よ び

Sa r c om a 18 0 細 胞の腹 水を滅 菌 生理食塩水^にて希 釈

し^， Tdrk 塾 血 球 計 算 盤にて算 定 後， 3^．2 ^へ3^．6X lO⁷

c ellsl^ml と な る よ う ^にE hrlich腹 水 癌 細 胞^およ び

Sa r c om a 18 0 の細 胞 浮遊 液を調 整し， 実 験^に供し た．

剃 毛後^ヒビ テンアル コ ^ー ル にて消 毒し た^マ ウス の背 部 の皮下^に，調 整し た細 胞浮 遊 液0^．2 5 ml を移 植し，固型 腫瘍と し て全て の実 験^に供し た．

2 ^． 抗腫 瘍 物 質の調 整 く表1う 旧 ^エタノ ^ー ル分画の調 整^こ

P． m ag^{n u s} S T^．1株を T F 培 地 仲 試 験 管1 5 mll で 3 アC^．4 8 時 間前 培 養し， さ ら^にT F 培 地 く中試 験 管 15 mりで3 アC ^．2 4時 間培 養 後， T F血 液 寒天平板 培 地

に塗抹し た^． Ga s Pak くB B L，Co ckeys ville，U S Al

にて 3 7⁰C^．4 8 時間 嫌 気培 養 後， 平板 培 地上^に形成さ れ た^{コ ロ ニ ー} を T F 培 地 く中 試 験 管1 5皿り ^に釣 菌し，

3 アC^．媚 時 間培 養し た^． 培 養 後， 1 0 0 ml容 量の投 薬^ビ

ン に1 0 0 ml の T F 培 地を作 製し， この培 地 中^に5 ％の

割合^に培 養し た薗 液を移 植し， 3 7⁰C^．2 4時 間さ らに前 培 養し た^．培養 後T F 培 地 く寒 天^ぬき^， 1，0 0 0 ml容 量^の投 薬ビン に1，0 00 ml の T F 培 地を作製し た も のう

に5 ％の割合で前 培養し た菌 液を移植し， 3 7^DC で各実 験に必 要な時 間培 養し た^． か か る条 件^{で の} S T ⁻1 株の 増殖 曲 線 く生 菌 数 測定コ は図1 に示 し てある． 各 時 間 培 養 後， 各1，0 0 0 mlの培 養 液を無 菌 的^に4 ⁰Cにて，

4，5 0 0^X G で 2 0 分 間冷 却 遠 心し， 培 養上清 液と沈 津と に分離し た．

冷 却遠 心し て得ら れ た培 養上清 液^に純^エチルアル コ ^ー ルを加え， 培 養上清 液 中^のエチ^ルア^{ルコ ー ル}濃度 が 6 0％と な る よ うに調整し た後に十 分濃 拝し た． 4⁰C にて ^一夜 静 置し た後， 再度^{1 0，0 00 XG にて 2 0分 間 冷} 却遠 心し た． こ の際得ら れ た沈漆を滅 菌 生理食 塩 水5 0

くvlab le c el lsノmり

下

1．O x l O7

0 6 1 2 1 8 Z 4 4 8 7 2

くhr sI F i_g．1． Gr o wth c u rv e Of Pep to c o c c u s m agn u sS T ^．1

Str ain．

ml に懸濁し， エタ^{ノ ー ル}分画と し て実 験^に供し た^． 榔 超 音 波 処理菌体^の上清液と沈澄の調 整^二 本培 養後， 冷 却遠 心して得ら れ た沈溝^に5 0 mlの滅 菌 生理食塩 水を加え， 4，5 00 ^XG で20 分 間冷 却遠心 し

て洗 浄し た．

この際 得ら れ た沈 壇^に滅 菌 生理食 塩 水5 0 ml を加 え， To my ultr a s o nic dis r up to r くM odel U R⁻2⁰0p，

2 0 K Hz， T o my^， Tok_yol を用^いて， 2 0 分間 超 音 波処 理 を おこなった． 超 音波 処理後1 0，00 0^X G で2 0分 間 冷 却 遠心 し， 上清 液は菌 体 超 音 波処理 上清液と し て実 験^に供し た．沈漆は滅 菌 生理食 塩水⁵0ml に懸 濁し，菌

Table l． Antit_{u mo r} s ub^{sta n c e s e xtr a cte}d fr o m Pep to c o c c u s m agn u sS T ^，1 str ain

1J Etha n ol fr a ctio n こ60％etha n olpr e citate s ofc ultu r e s upe r n ata nt

2I Sup^{e r n a}tan t a nd s ed im e ntfr a ctio n obtain ed by c e ntrifug^atio n ofultr a s o nic ally dis r up t^ed

c ell s u spe n sio nin physiologl C als alin e

3I ^{Fr a ctio n s o}btain ed byis o ele ctiv e point pr e cipitatio n こ

s upe r n at_{a n}tfr a ctio nin 2I ^{w a sc o m m}it tedtois o ele ctric al _pr e ci_pit_atio natd iffe r e nt pH 6．0，4．O a nd 2．0

P． m agn u s の抗 腫場 性^に関す る研 究

体超 音 波 処理沈 漆と し て実 験^に供し た^．

く3I 等 電 点沈 殿 法^によ る抗腰瘍 性物 質の抽 出 くpH 6^． 0分画， pH 4．0分 画， pH 2．0分 画う^こ

前培 養し た菌 液を 5 ％の割 合で 4^，0 0 0^ml のT F 培 地 く寒天ぬき， 1，0 0 0ml 容 量の投 薬ビン に1，0 0 0 血 ^の T F培 地を作 製し た もの を4 本つ ^に移 植し，

3 7⁰C^■2 4 時 間培 養し た^． 培 養 液を4，5 0 0^X G で 20 分間 冷 却遠心 し， 得ら れ た 沈瘡^に滅 菌生理食 塩 水5 0 ml を 加え た後， 再度4，5 0 0^X G で 2 0 分間 冷 却 遠心し て洗浄 し た． こ の菌体をく2ユの操作で超 音波 処理 を お^こな^い，

そ の 上清 液^に用^のご と く^エ タノ ^ー ルを 60％^に加え折 出し た分 画を遠心 し，得ら れ た沈漆を出 発材 料と し た．

さ らに pH によ る分 画に用^いた^．即ち，得ら れ た沈 澄に P B S くpho sphatebuffe r s olutio n，pH 7．01 5 0ml を加 え， 充 分授 拝し た後^に1 0 N H Cl を加え てpH を 6^．0 と な る よ うに調 整し た^． 調 整 後4 ⁰Cに ^一 夜 静 置し，

1 0，00 0 ^XG ^で2 0 分間 冷 却 遠心を^{お こ}な^い，得ら れ た沈 漆^にP B Sくp王野．0うを 5 0 ^ml加え て懸濁し， pH 6．0 分 画 と し て実験に供し た^．

一方， こ の際 得ら れ た遠 心上浦 液に， さ らに1 0 N H Cl を加え， pH 4．0 と な る よ う^に調 整し た． 授 拝 後 4⁰C に^鵬 夜 静 置し， 再 度10，0 0 0^X G で 2 0 分 間 冷 却遠

JL^一し， 得ら れ た沈漆にP B SくpH 7．O15 0 ml を加え て懸 濁し， pH 4．0 分 画と して実験^に供し た．

同様^に， pH 4^．0分 画を得る た めに操 作し た後^の遠心 上宿 液に， さ らに1 0 N H Cl を加え てpH 2．0 に調整し，

授搾 後⁴⁰C に ^一 夜 静 置し， 1 0，0 0 0XG にて 2 0 分間 冷 却遠心 し， 得ら れ た沈 埴^にP B SくpH7．O15 0 ml を加え て， 懸 濁し た ものをp王1 2．0分 画と し て実験に供し た．

3 ． 投与 方法^こ

P^． m agn u s S T⁻1株^の培 養液^のエタノ ^ール分 画， 上

記の菌 体超 音 波処 理 上清 液およ び沈溶な ら びに等電 点

149

沈殿 法^によ^っ て得ら れ た各 分画を次の如く投 与し た．

す な わ ち，実験 癌縄 胞 移植 後⁴8 時 間経 過し た^マウス の 左右上腕^二頭 筋 部へ交互に各^{々 の}0^．2 5ml を 1 日 1 回，

1週 間 連続し て筋 肉 内注 射を し た． 全て の実験 群^{は 1} 群¹0 匹 と し て実 験し た．

4 ^． 抗腫瘍 効 果の判 定^こ

実験 癌細 胞を移植し た 日 よ り以後^{の マウスの}生 存^日 数にて抗腫 瘍 効 果を判 定す る^こと と し， 実 験群の平 均 生存日数 くTコと対 照 群^の平 均 生存日数 くCl の 比， 即 ち TノC ^xl O O ^によっ て抗腫瘍 効 果^を判 定し た^{1 71}．

この際， 各 実 験群は 6 0 日間 観察し， 6 0 日目に TノC く％I の判定を おこな^った． TノCく％コは 1 3 0以上 の も の に つ いて抗 腫 瘍 性 あ^{り と}判定し た．

ま た， 腫瘍 重 量^によ る抗腫 瘍効 果^の判 定も おこなっ

た^． す な わ ち， 実 験癌 細胞 移 植 後1 5 日目よ り 5 日 ご と に， 対 照群およ び処 置 群^のマ ウスの背 部^に形成さ れ た 固型腰 瘍の短 径と長 径を測定し， 下 記の式で腫 瘍重量 を算定し た^{1 8I}．

腫 瘍重 量く^mgう^ニ 奉攣^く叩 岬 ²

2

成 績

王． E brlicb 腹 水 癌 細 胞^の 固型腫 痛^に対す るP^．

m agn n s S T⁻1株^{の エ} タノ ^ー ル分 画^の抗 腫 瘍

性^こ

P． m agn u s S T ⁻1株を 2 4 ^．48 ^．7 2⁻9 6 ^．12 0 時 間の 各時 間 毎^に培 養し， 各々の培 養上清 液よ り得ら れ た^エ タノ^ー ル分 画^{に つ い}て抗 腫 瘍 性を検 討し た． 対 照 群^は E hrlich腹 水 癌細 胞^を移 植し た^マ ウス に滅 菌 生理食塩

水0．2 5ml を筋 肉内 注射し実験をお こなっ た．

経口的^{に こ}れ ら の^マウス の生死を観察し， 抗 腫 瘍性 を判 定し た． こ の成 績を表2 に示 し た が， 対 照 群の マ

T able 2^． Antitu m o r effe ct oft he etha n ol fr a ctio nfr o m c ultu r e s upe r n ata nt of Pep to c o⁻ C C u S m ag^{n u S} S T⁻¹ str ain o n s olid _{t y p}e tu m o r of E hrlich c a r cin o m a c ellsin mic e

Etha n ol fr a ctio n s ob^tain ed fr o m

S T−^{1str ainin c ubated fo rくhrl}

M e a n s u rviv al Nu mbe r of^al

d^ay^al s u r v I V O r S T ノCく％j

3 6^．0 ^{士 1}2．4 1 1 3 6^．3

3 2^．8 士 10^．4 1 1 2 4．2

72 3 3^{．1 士}7^．5 0 12 5^．3

9 6 3 3．3士 8．5 0 12 6．1

12 0 3¹．1 士5．5 0 117^．8

P h_ysiologl C als alin e

くCo ntr oll ^{2 6．4士3．0 0}

al O bs e r v ed o nthe6 0th day ^aft_{e r}intr a m u s c ula rinj^{e ctio n of m ate rial into tu m o r−} be a ring mic e．