金沢 大 学 十全 医 学会 雑 誌 第9 8巻 第2 号 2 79 岬2 8 9く1 9 8 別
小 児アトピ ー 性 皮膚炎における N K 細 胞 活性 および
N K 細 胞 表 面 マ ー カ ー に関する研 究
金沢 大学 医学 部 公 衆衛生学 講座 く主任こ岡田 晃 鍬 掛
木 村 憎
く平成1年2 月4 日受付1
2 7 9
小 児ア ト ピー性 皮 膚 炎 患 者にお け る N K 細 胞の免 疫学 的特 徴を重症 度 別に検 討す る目 的で本 研 究を行っ た． ア ト ピー性 皮 膚 炎 患 者3 9 人く男 性1 9 人， 女性2 0 人ナの年齢は 9 旬1 5歳 く平 均 年 齢1 1．9歳1 で， 重 症 度 別に軽 症1 4 人， 中等 症1 5 人， 重症1 0 人の 3群に分類し た． ま た， 対 照と し て 9 旬15歳の健 常 児1 6 人く男 性9 人， 女性7人J を選ん だ．
5Cr r ele a s e cy toto xic a s s ay によ る n atu r al k ille rくN Kl 細 胞 活 性およ び single c ell a s s ayくS C A いこよ る N K 細 胞活 性は と もに健 常 児に比べ重 症 群で有 意に低 下 し た． ま た，inte rle uk in−2 く1 し 21 お よ び inte rfe r o n−a くI F N −al によ る増 強に つ いて は， 重 症 群で I F N ．a によ る％ spe cific 5 1Cr r ele a s e の増 強は認め ら れ なかっ た が． 軽症群お よ び中 等症 群で N K 細 胞 活 性は I L−2 およ び I F N ．a によっ て有 意に増 強さ れ た． 一 方， Le u−7 陽 性 細 胞のポ ピュ レ ー ションは 健 常 児と の間に有 意 差は認め ら れ な かっ た が， Le u．11c 陽性 細 胞のポ ピュレ ー ショ ンは中等 症群で有 意
に増 加し た． ま た， ア ト ピー性 皮 膚炎患 者およ び健 常 児において， ％ spe cific 5tIr r ele a s e は S C A お よ び Le u．11c 陽 性 細 胞と の間に有 意な 正 の相 関 関係が認め ら れ た． 以上 よ り， 重症 患 者では N K 細 胞 の標 的 細胞 結 合 能 力およ び標 的 細 胞 傷 害 能 力の低 下が， 中等 症 患 者で は N K 細 胞の機 能 低 下およ び数 量 的 増 加が認め ら れ た． 小 児ア ト ピ ー性 皮 膚 炎 患 者にお け る N K 細 胞の免 疫 学 的 特 徴を横 断的にと ら え，
各 重 症 度にお け る そ れ ぞ れ の特 徴を 明 ら かにす ること が で き た． 今 後， 縦 断的 研 究によ り さ らにその推 移を追 跡で き れ ば， 小 児期に おけ る N E 細胞 機 能の測 定は重 症 度を客 観 的に把握し， 予後を推 測す る た
めの1 つの手段にな り う る と 思 わ れ た．
K ey w o rds atopic de r m atitis， n atural k ille r c ell，
5 1Cr r ele a s e cy totoxic a s s ay， Single c ell a s s ay，S u rfa c e m a rk e r
ア ト ピー 性 皮 膚 炎 くatopic de r m atitis， A D l の患者 は皮 膚感 染 症に躍 患し や す く， しかも 重症にな り や す い こと が知ら れ て お り， 合 併し や すい疾 患と し て伝 染 性膿痴疹1Iな どの細 菌感 染症， 伝 染性 軟 属腰2 ，． 尋 常性 疫贅3 I． Kapo si 水 痘 様 発 疹 症弟な どのウ イル ス感 染 症 が あげら れ ている． これ らの皮 膚 感 染 症を合 併し や す い理由と し て， 強い痔み によ る掻 破が 以前からいわ れ ている が， 近 年本 症にお け る免 疫 異 常， おそ ら く細胞 性免 疫の異 常によ る可能 性が考え ら れ ている． こ の点
A b br e viatio n s ニA C D， a Cid citr ate de xtr o s e Cy tOtO Xic a s s ay 三 F B S， fetal bo vin e s e r u m i
に関して， しかし， A D 患 者に おけ る遅 延型皮 膚反応
の低下珊 ， リン パ球の幼 君 化因 子に対す る 反応 性の低
下6 ト 8 1およ び サ プレツサー T 細 胞の減 少の1 0 Iな ど を 示 し
た報 告は多 数あ る が， ウ イル ス感 染 細 胞の破 壊に関与 す る n atu r al k ille r c ellくN K 細 胞J の活 性の A D 患者
にお け る変 化に関す る報 告は ま だ 少 ない ．
一 方， N K 細 胞の括 性 測 定には， 従 来その細 胞 傷 害 活性を細 胞 集団で測 定す る方 法であ る 5 1Cr 放 出 細 胞 傷 害 試 験 く5Cr r ele a s e cy toto xic a s s ay，
5 1CrR．
A D ，atOPic de r m atitisニ5 1C rR C A ，
5 1Cr r ele a s e
F I T C ， flu o r e s c ein is othio cya n atei I F N − a ，
inte rfe r o n−a iI L 2 ，inte rle uk in−2ニ N K ， n atu r al k ille r三P B S
， pho sphate b uffe r ed s alin e 三 P E
， phyc o e ry thriniS C A ， Single c ell a s s ay
C Al1 1 I1 2−が 用いら れ ていた が，近 年 免 疫 学の進 歩に伴い 新しい手 法が開 発さ れ て き た． な か で もモ ノクロ ー ナ ル抗 体を 用い て検 出す る N 瓦 経 胞 表 面マ ー カ ー 解
析1 3 ト 1町や単一 細 胞レベ ルで細 胞 傷 害 活 性を検 定し う る
単 d 細 胞傷 害試 験 くsingle c ell a s s ay， S C Al1 6 ト 2 O，が有 用と され， これ らの方 法によ り N K 細 胞 活性を多 角 的
にと ら え ること が可 能と なって き た． そこ で著 者は，
5 1CrR C A ， S C A お よ び N K 細 胞 表 面マ ー カ ー解 析を用いて A D 患 者に お け る N K 細 胞 活性を測 定し， 異常の有 無を検 討し た． ま た， A D の 重 症 度と N K 細 胞 活 性と の関 連を検 討し た■
対 象およ び方 法
王． 対 象
金 沢 大学 医学 部 附 属 病 院， 石 川 県 立 中 央病 院， 氷 見 市 民 病 院， 公立加 賀 中央 病 院の各 皮 膚 科 外来を訪れ た A D 患 者3 9人 く男性1 9 人， 女性2 0 人1 を対 象と し た．患 者の年 齢は 9 へ1 5歳 く平 均 年 齢1 1 ．9歳1 であっ た．
A D の診 断は 上原 ．太 藤の診 断 基 準2 りに基づ き， さ ら に A D の重 症 度によ り次の 3 群に分 類し た．
軽 症 二乾 燥 性のア ト ピ ー皮 膚が主体の も の． 中 等 症こ乾 燥 性の ア ト ピ ー皮 膚に加え て， 四肢およ
び体 幹に限 局性の苔 癖 化 局 面を有す る が，
そ の範 囲が広 範 囲で ないもの．
重 症 こ典 型 的な ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎で， 習 癖 化の程 度が顕 著で そ の範 囲が広 範な もの ．
上記の重 症 度によ り分類す る と， 対 象 患 者は軽 症1 4 人， 中等 症1 5 人， 重 症1 0人で あった． た だ し，
A D 患 者を集め るにあ たって， 各 群の対 象数が な るべく等し く な る よ うに選ん だ． ま た， N E．細 胞 活 性への影 響を 避け る た め， 副 腎 皮 質ホル モ ンの全 身 投 与によ り治 療
中の患 者は対 象から除 外し た．
な お， 対 照 例と し て 9 旬1 5歳で同 一家 系 内にアレル ギー 性疾 患の ない健 常 児1 6 人く男 性9 人， 女 性7人1 を 選ん だ．
II ． 末 棉血単 核球の分離
末 梢 静 脈 血を 1 0ml ヘパリン採血後， リン酸 緩 衝 塩 類 溶 液 くpho sphate buffe r ed s alin e， P B Sl く日水 製 薬， 東 京1 にて 2倍 希 釈し た も の を リン パ球 分 離 液 く1ym pho cy te s epa r atio n m ed iu m ， L S Ml くL it to n
Bio n etic s， U ．S．A．1 に重 層し，1 5 0 0rpm 2 0分 間 遠 心 し た． 遠 心 後， 単 層に分 離し た末 梢血単 核 球を採 取 し， P B S にて 1 8 0 0rpm l O分 間， 引 続き 1 0 0 0rpm 5 分 間 遠 心 洗 浄し，1 0％ 非 動化 牛 胎 児 血 清 tfetal bo vin e
s e ru m ， F B Sl くG S L ， U． S． A ．，lot． 1 0 0 9 1J 添 加 R fIM l 1 6 4 0 溶 液 く日水 製 薬， 東 京一に浮 遊し た． さ ら
に ， こ の浮 遊 液を 6 0 x1 5m m 組 織 培 養ディ ッ シュ
くFalc o n H3 0 0 2， U ．S．A1− に入 れ，3 70c 5 ％C O2気相 下で 一晩 静 置し た． 翌 日， こ の浮 遊 液を1 0％ F B S 添 加 R P M I1 6 4 0溶 液にて 1 0 0 0rpm 5分 間2 回遠 心洗 浄 し， 0．2％ト リバ ンプル ー で染色し て生 細 胞 数を算 定 し， 2Xl O5個Ir nl に調 整し て effe cto r c ell と し た．
m ． 5 1CrR C A
5 1CrR C A は押 味喝の方 法に準じ て行っ た． ヒト慢性 骨 髄 性 白血病 由 来 細 胞 株K 5 6 2細 胞に，5 0〆C i に相当
す る 5C rくNa2
5C rO．， 1m C iJ I
mll く第 一 ラ ジ オ ア イソ トー プ研 究 所， 東 京1 を加え て3 70Cで2 時 間培 養し た． 培 養 後 ， 1 0％ F B S 添 加 R P M I1 6 4 0 溶 液にて 8 0 0rpm 5分 間4 回遠 心 洗 浄し， 細 胞 数を 1xl O4個ノ
ml に調 整し てta rget c e11 と し た． effe cto r c ell と ta rget c ell を各々 1 ml づ つ くE ニT ニ 2 0 こ り
tripric ate で 小 チ ュ ー ブ に加え， 3 7qC 5 ％C O2気 相下 で4 時 間混 合 培 養し た． 培 養 後，2 0 0 0rpm 5分 間遠心 し， 上清1 ml を採 取し て． 細 胞 沈 漆を含む残り 1 ml と と もにオ ー ト ガン マ シ ンチレ ー ショ ンカ ウンタ ー
げ ロカ， 東 京1 で， 放 出さ れ た 5 1Cr の放 射 活 性を測 定し た ． ％ 特 異 的 5 1Cr 放 出 値 く％ spe ci fic 5でr r ele a s el を下 記の式によ り求め 5C rR C A によ る N K 細 胞 活 性 値と し た．
％spe cific 5C r r ele a s e
ニ くくe xpe rim e nta1 5C r r ele a s e −SpO nta n e O u S 5Cr r ele a s el 八m a xim u m
5てニr r ele a s e
− SpO nta n e O u S
51Cr r ele a s eH xl O O 自 然 51Cr 放 出 値 くspo nta n e o u s 5Cr r ele a s el は． ta rget c ell 単独 培 養し た際の ， ま た最 大 5Cr 放 出 値 くm a xim u m
5Cr r ele a s el はta rget c ell に 1 ％trito n
X−1 0 0く和 光 純 薬，大 阪1 をカロえ た際の 5t r 放 出量によ り算 出し た．
N ． S C A
S C A の測 定は Grim m1 61およ び内田2 0一の方 法に準じ て行った． 細 胞 数を 4 x l O5個ノml に調 整し た単核 球 くeffe cto r c ellナと K 5 62 細 胞 くta rget c elり を， 各々 0．5ml づつ小 チ ュ ー ブに加え混 和し たのち， 3 70Cで1 0 分 間 培 養し た． 一方， 0．1％ア ガロ ー スくAga r o s e 2ン く同仁 化 学 研 究 所， 東 尉 を完全に溶 解し たのち，3 70C
の恒 温 槽 中に保 温し て その液体 状態を保 持し た． 培嚢 し た effe cto r c ell と ta rget c e11 の浮 遊 液1．Omlに，
あ らかじ め準備し た ア ガロ ー ス 1．Oml を静か に混 ぜ，
素 早く 6 0x1 5m m 組 織 培 養 ディ ッ シ ュ くFalc o n
椚0 0 2， U．S． A．1 上に均 一に塗布し た． ア ガロ ー スが 完 全に凝 固し た の ち． ア ガロ ー スが乾 燥し ないよ うに 1 0％ F B S 添加 R P M I1 6 4 0 溶 液を 1．Oml 重 層し，3 7
