遺 伝子 複製機構 解 析 イ 上皮系細胞 け

金沢 大 学十 全 医 学会 雑 誌 第9 8巻 第1号 1 3 9

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上 皮系 細 胞に おける E p^stein ⁻B a r r ウイ ^{ル ス} 遺伝 子複製機構 ^の解析

金 沢大学 医 学 部耳 鼻咽喉 科学 講 座 く主任^こ梅田良三教 授I

田 中 ^{佐 一} 良

く平 成¹ 年¹ 月^{2 6}日受 付1

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N P C⁻K T 細 胞は 上咽 頭 癌初 代 培 養 細胞とヒト ア デノイ ド由 来 上皮 系細 胞株 A d⁻A H と の細 胞 融 合^によ^って樹立化さ れ た Epstein⁻Ba r r ウ イ^{ル ス}くEpstein⁻Ba r r vir u s，E B Vl 産 生上皮系 細 胞株で あ り，

N P C⁻K T 細 胞の サ ブ ク^{ロ ー} ン であ る S 6 1 細 胞は さ らに E B V 高 屋 生 性で あ る^． A 2 LI

IA H 細 胞は，

B 9 5⁻8 細 胞 由 来E B V によっ て ト ラン ス フ ォ ^ー ムし た リン パ芽 球 様 細 胞 株と A d⁻A H 細 胞との細 胞 融 合

によっ て樹 立 化さ れ た E B V 産 生上皮 系 細 胞 株^{であ る ． S 6 1} 細 胞で は 5^{−ヨ ー} ド デ オ キシウ リ ジン

く5⁻iodode o xyu rid in e，I U d RI 処理によって巨大 融合 細 胞， 封入体 形 成と^い った^{ヘル ペ ス}ウ イル ス増 殖に

特 異 的な細 胞 変性 像が観 察さ れ， S 6 1 細 胞は B 細 胞 系E B V 産 生細 胞 株と は異な り細 胞 破壊 性に E B V を産 生 すること が推 測さ れ た^． ウ イ^{ル ス}増 殖^に伴う上 皮 系細 胞^{での E B V ゲノ ム}複 製 機構を検 討す る た め， E B V 腐 生上皮 系 細 胞 株である N P C⁻K T， S 6 1， お よ び A 2 LノA H 細 胞を用いて サ ザンプロ ット法

にて E B V D N A 末 端 構 造^の解 析を行っ た． 上記3細 胞 内の ウ イル ス環 状 D N A の末 端 反 復 配 列

く^{te r m}in al r epe at，T Rl の^コピ ^ー数は均 ^一 であっ た が，I U d R 処理^によ^っ て ウ イ^{ル ス}産 生を誘 導す る と

種々 の^コ ピ^ー 数^の T R を有す る ウ イ^{ル ス}線 状D N A の形 成が み ら れ た． ま たこ のように種々のコ ピ^ー 数 の T R を有す る線 状D N A を含む ウ イル ス によっ て ト ラン ス フ ォ ^ー ムし た リ^{ン パ}芽 球 様 細 胞株に お い て は， そ の内 在す る ウ イ^{ル ス} D N A は E B V 産 生 細 胞 内環 状 D N A と異な り種々 の^コ ピ^ー数の T R を有 し て^いた^． E B V 産 生細 胞 内ウ イ^{ル ス}環 状 D N A と ト ラン ス フ ォ ^ー ムし た細 胞 内ウ イ^{ル ス} D N A の T R のコ ピ ^ー数^の相 違を検 討し た結 果， ウ イ^{ル ス}増 殖^に伴う 上皮 系 細 胞^{で の} E B V ゲノ ム複 製 機 構は D N A ^コ ンカ テ^{マ ー} くc o n c ate me rl を複 製 中 間体と す る^{ロ ー} リングサ ^ー クル モデル によ る も の で あ るこ と が推 測さ れ た^． E B V D N A の ク^{ロ ー} ン化 D N A によ る サ ザンプ^ロ ット法にて E B V 産 生細 胞と ト ラ ン ス フ ォ ^ー ムし た細 胞が保 有す る ウ イ^{ル ス} D N A の 比較解 析を行^った と^ころ， 両 者の ウ イ^{ル ス} D N A は T R の^コ ピ ^ー数を除^いて同 ^一 であ る^こと が確 認さ れ， ま た N P C⁻K T 細 胞と S 6 1 細 胞 内の E B V D N A は同^一 であっ た^． A 2 LIA H 細 胞と B 9 5⁻8細 胞 内のE B V D N A も T R の コ ピ^ー 数を除^いて同 ^一

であった が， これ ら の E B V D N A は N P C⁻K T 細 胞 内ウ イ^{ル ス} D N A と は異な る も^ので あった．

K ey ^{w o r}ds E_pstein⁻Ba r r vir u s， te r min al r ep^{e a}t， epithelial c ell， D N A

r eplic atio n

1 9 64年 E_pstein ら^{1 1}によって^{バ ー} キット リ^{ン パ}腫の イル スと して知ら れ ており， さ らにま た，

バ ^ー キッ ト

培 養細 胞^から発 見さ れ た E_pstein⁻Ba r r ウ イ ^{ル ス} リ^{ン パ}腫お よ び 上 咽頭 癌 患 者血清 中の E B V 関 連 抗 体

tE_pst_ein^．Ba r r vir u s， E B VJ は伝 染 性単 核 症の病 原ウ が高 値を 示 す^こと や， そ^の腰 瘍 細 胞 内^に E B V ゲノ ム

A b br e viati_{o n s こ} C B L， C Ord b lo od l_y m pho cy t^eニ ^{C C C}D N A

， C O V ale ntl_y clo s ed cir c ular

D N A _ニ C S A ， Cy^Clo sp^{o r}in A _ニ D M E M ， Dulbe c c o m od ified E agle

，

s m ed iu m 三 E A ， e a rl_y

a nti_ge nニ E B N A ， E B V ⁻a S S O Ciated n u cle a r a nti_ge n妄

E

eth_yle n edia min etetr a a c etate三 I U d R ， 5⁻iod ode o xy^{u r}id in ei k b

， k iloba s e p^ai_rs三 L C L，

1 4 0

が存 在し E B V 核 内 抗 原 くE B V⁻a S S O Ciated n u cle a r a ntige n， E B N Al ^の発現 が み ら れ る^こと な ど か ら，

E B V が^{バ ー} キット リ^{ン パ}腫お よ び 上咽 頭 癌 発 症^に深 く関 与し て^いる^こと が 示唆さ れ た^{2 州}

E B V は^{ヘ ル ペ ス}ウ イ^{ル ス}科^に属し， ウ イ ^{ル ス}粒子 は1 6 2個のカ プソメ ア か ら な る 正 2 0面 体のヌク レ オ カ プシ_ツド と そ れ を と り ま く ^{エ ン ベ ロ ー} プ か ら成る．

E B V ゲノ ムは ウ イ^{ル ス}粒子内で は約1 7 0 キ^ロ 塩 基 対 くk iloba s e pair s，k bl ^の2 本 鎖 線 状D N A で あ り， その

両 端^には約0^．5 k b の末端 反 復 配 列 く^{te r m}in al r epe at，

T Rl を 1 ^旬12個 程度 有す る^研． ま た 上咽 頭 癌 細 胞な ど の E B V ゲ ノム陽性 細 胞 内で は， 両 端の T R 同士 が融 合 し て閉 環 状 D N A く^{c o v ale ntl}y ^clo s ed cir c ula r

D N A ，C C CD N Al と なっ て存 在し て^いる^{8ト1 0 I}

E B V 粒子内線 状 D N A 両 端の T R ^のコ ピ^ー 数は ^一 般に不 均 ^一 で あ る た め， E B V 感 染^によ って生じ た ウ

イ^{ル ス} C C CD N A 中の T R のコ ピ^ー 数も各々異な るこ

と が 予想さ れ ること か ら， R a ab⁻Tr a ub ら^{1 1I}は 上咽 頭 痛の ク^{ロ ー ン}性^{のマ ー} カ ^ー と し て T R の^コ ピ ^ー 数に

注 目し た^． T R 近 傍^の D N A を プ^{ロ ー} ブ と し て腫 瘍 組 織か ら抽 出し た D N A を サ ザ^ンプ^ロ ット法^にて検 索し た ところ， 6例^の上咽 頭 癌^{に お い}て T R の コ ピ^ー 数は 各々 す^べ て均^一 で あ^ったこと か ら， す で^に腫 瘍 化し た 細 胞^に E B V が感 染し た の で は な く ^一つの E B V 感 染 細 胞が腫 瘍化し た^こと， す な わ ち 上咽 頭 癌の単ク^{ロ ー}

ン性お よび E B V 感 染の 上咽 頭 癌 発 症^へ の関 与が 示唆 さ れ た と報 告し て^いる^．

E B V は，in vitr o にてヒト お よ び^{マ ー モ セ ッ}ト な ど の新 世 界ザ^ルの B 細 胞^に感 染しこれ を容 易^{にト ラン ス}

フ ォ ^ー ムく不 死 化^{，im m o rtaliz atio n}l す ること が で き る た め彗 ^一般 的^には B 細 胞好 性と考え ら れ て き た^．

し か し， ト ラ^{ン ス フ ォ ー ム}し た B細 胞 内では ウ イ^{ル ス} 複 製は宿主細 胞^に厳 格^に制 御さ れ て^いる^{． 山} 方，in viv o にお^いて は E B V ゲ ノム の複 製お よ び ウ イ^{ル ス}産 生は咽 頭上皮 ある^いは耳 下 腺 組 織^において み ら れ るこ と か ら^1桝SIB 細 胞で は な く 上皮 系細 胞が真^の E B V 増 殖^の場と考え ら れ る よ う^にな^っ た^． しか し， 樹立化さ れ た E B V 産 生 細 胞 株は す^べて B 細 胞 系^であ り E B V 産 生上皮 系細 胞 株の報 告は皆 無で あ る た め， in vitr o にお け る 上皮 系細 胞で の E B V 増殖 機構の解 明は な さ れ ていない ．

当教 室に て樹 立化さ れ た N P じ K T 細 胞は， 上 咽頭 1_y m ph obla stoid c ell lin e三P B L ， p^{e r}i_phe r al

癌 初 代 培 養 細 胞とヒト ア デノイ ド由来上皮 系 細 胞 株と の細 胞 融 合^によって樹 立 化さ れ た もの で， 唯 ^{一 の}上咽 頭 癌 由 来 E B V 産 生上皮 系細 胞 株で あ る^岬．

本 研 究で は， 当教 室にて樹 立 化さ れ た E B V 産生上 皮 系細 胞 内ウ イル ス D N A ， お よ び^これ ら か ら産 生さ れ た E B V によ^っ て i^{n v}itr o にて ト ラン ス フ ォ ^ー ムし た B 細 胞 内ウ イ^{ル ス} D N A の末 端 構 造を分子生 物 学的 手 法^{に て}解 析し， ウ イ^{ル ス}増 殖^に伴う 上皮 系細 胞 内^で

の E B V ゲ ノム複 製 機 構^および上 咽頭 癌^の単ク^{ロ ー} ン

性 発 生^に関し て検討し た．

材 料^{およ び}方 法 工^． 使用細 胞

1 ． N P C⁻K T 細 胞

上咽 頭 痛 く未 分化 癌1 初代 培養 細 胞^{とヒト ア デノ}イ ド由 来上皮 系 細 胞株 A d⁻A H 細胞との細 胞 融合^によ^っ て樹 立 化さ れ た E B V ゲノ ム陽 性 上 皮 系 細 胞 株で あ り， 1 0％ 牛 胎 児 血 清 田yclo n e， Utah_，U S Al 加ダ^ル

ベア^コ変 法イ ^ー グル培 地 くD ulbe c c o m od ified Eagle

，

s m ed iu m ，D M E Ml く日水， 東 京1 にて3 4^OC で培 養し た^．

2 ．S 6 1 細 胞

N P C⁻E T 細 胞^のク^{ロ ー ニ ン}グによっ て得ら れ た E B V 高 産 生上皮 系 細胞 株であり， N P C⁻K T 細 胞と同 様の条 件^にて培 養し た．

3 ^． B 9 5⁻8 細 胞

伝 染 性 単 核 症 由来 E B V によっ て ト ラン ス フ ォ^ー ム し た^{マ ー モ セ}ッ ト リ^{ン パ}球 系 細 胞 株^であ り， 1 0％ 牛胎 児 血 清加 R P M I^．1 6 4 0培 養液 く日射 ^にて 3 7⁰C で培 養し

た^．

4 ^． A 2 LJIA H 細 胞

B 9 5⁻8 細胞 産生 ウ イ^{ル ス}くB 9 5⁻8 ウ イ^{ル ス}い^こよ^って ト ラン ス フ ォ ^ー ムし た リ^{ン パ}芽 球 様 細 胞 株である A 2 L 細 胞と A d⁻A H 細 胞との細 胞 融 合^によ ^って樹立 化さ れ た E B V ゲ^{ノ ム}陽 性ウ イル ス産 生上皮 系 細胞 株 であり^{1 7 ，}， 1 0％ 牛 胎 児 血 清 加 D M E M ^にて3 4⁰C^で培養 し た^．

工工^． ウ イル ス抗原^の観察 1 ． E B N A

標 本を ア^セ ト^ン固 定し た後， 5 6⁰C で 3 0分 間非 働 化し た抗 ^{E B N A} 抗 体 陽 性^の健 康 成人 血清と抗E B V 抗体 陰 性 補体用健 康 成人 血清を 用^いて ， Re edm a n ら^{1 8 ，の} 方 法^に準じ て蛍 光 抗 体 補 体 法^{にて E B N A の}観 察^を b lo od l_ym ph o cy t^e三 P B S， pho sphate buffe r ed

s alin ei S D S， S Odi^{u m} dod e cyl s ulfateニ T P A ， 1 2⁻0 ⁻tetr ade c a n oyl_pho rbol⁻1 3⁻a C etate三 T R，

te r min al r ep^{e a}t 三V C A ，Vir al c ap^sid a nti_ge n