博 士 （ 理 学 ） 彦 坂 兄
学 itL 論 文題 名
Quantitative Analyses of Anatomical and Electrotonic Structures of Local Spiking and Nonspiking Interneurons by Three‑Dimensional h/Iorphometry in Crayfish
（ザリガニ局在性介在ニューロンの三次元形態計測による 解 剖 学 的 及 び 電 気 緊 張 的 構 造 の 定 量 的 解 析 ）
学位論文内容の要旨
無 脊椎動物 の中枢 神経系で は、ノン スパイ キング介 在ニュ ーロン（NSI）とぃう神経細 胞集団の存在が数多く確認されているが、中枢情報処理におけるその機能的意義については、
不 明の点が まだ多く 残され ている。NSIで の情報処 理では 、活動電 位ではなく段階的なシ ナプス電位が用いられる。シナプス電位の細胞上での空間、時間的広がりは、細胞の樹状突 起の電気緊張的構造によって基本的に規定される。電気緊張的な特性は樹状突起膜の受動的 性質と三次元的構造に依存する。しかし、特に後者については従来の光学顕微鏡による解析 で は充分な 調査が困 難であ ったため 、樹状 突起構造 の三次 元的な解 析はNSIの機能を調べ る上でまず取り組まれるぺき重要な課題であった。
ア メリカザ リガニProcambarus cb尚jGirardの腹部 最終神経 節では 、感覚情報処理系お よ び 運 動 制 御 系 でNSIが 働 い て い る 。 感 覚 情 報 処 理 系 で 同 定 さ れ るNSIで あ るLDS細 胞は、神経節の両側に樹状突起を伸ばし、片側で尾扇体表の水流機械感覚毛から興奮性単シ ナプス入カを受け、反対側の上行性介在ニューロンを抑制することで、刺激方向の検出能カ を 高めると 考えられ ている 。一方、 運動系 でも多数 のNSIが報告さ れているが、クラスタ ーを形成するため個々の同定はされていない。これらの細胞の樹状突起は神経節の片側にと どまっている。主に下行性介在ニヱーロンから入カを受け取り、尾扇肢筋肉を神経支配する 運 動神経の 活動を直 接コントロールすることから前運動性のNSIと呼ぱれている。加えて、
腹部最終神経節では、感覚情報処理系において、活動電位を発生する局在性スパイキング介 在ニュー‐ロンが働いていることも確認されているが、感覚情報処理系におぃてスパイクを発 生 す る も の と し な い も の の 両 方 が 働 いて い る こと の 機 能的 意 義 は未 だ 不 明 であ る 。
本 研究では 、腹部 最終神経 節に存在 するNSI及び局 在性ス パイキング介在二ヱー口ンの 機能的意義を解明する事を目的として、これら介在ニューロンの解剖学的および電気緊張的 構 造 を 定量 的 に 解析 し た 。第1章 にお い て は、 感 覚 性の 同 定NSIで あ るLDS細胞 の 三 次 元形態と受動的膜性質を定量的に調査するとともに、その個体間変異の調査を行った。三次 元形態計測は、螢光色素Lucifer yellowを細胞内注入した細胞に共焦点レーザー顕微鏡を適 用して得られた光学的連続切片を用い、個々の樹状突起の直径・長さ、神経節内での空間的 位置を三次元的に計測した。樹状突起は、異なる直径と長さ、座標を持つ円筒の集合体とし
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て近似し、細胞形態の三次元的な再構成を行った。また、樹状突起の長さと直径、分岐のパ 夕 一 ン を 反 映 し た デ ン ド ロ グ ラ ム を 作 成 し た 。 今 回 の 調 査 で は 、LDS細胞 は418〜82 3個の円筒で表され た。
13個のLDS細 胞を 元に した 三次 元形 態の 定量 的な 調査 の結 果、 樹 状突 起の総膜面積 、 解剖学的長さの合計、神経節の中心線から末端に至るまでの平均の実長、総分岐数などにお いて、個体間変異が観察された。また、樹状突起の神経節内における空間的な分布を調べた 結果、中心の太い突起とその両端から直接分岐 する4本の主要な突起がほぼ同様の空間配置 をとる一方、入出カシナプスが存在する末梢の突起になるほど、その分布はばらつくことが 明らかになった。上述の個体間変異の他に、各個体に共通した性質も明らかになった。神経 節中心線から見て細胞体が存在する側の樹状突起とその反対側の樹状突起の比較を行ったと ころ、細胞体側の突起は、長さ、分岐数、面積のいずれにおいても反対側のそれを有意に上 回っているとぃう点で各個体とも共通していた。さらに、電気生理学的手法によって明らか になった細胞の受動的膜性質と樹状突起の三次元構造に基づぃて、樹状突起電気緊張的距離 を表すデンドログラムも作成した。その結果、解剖学的構造における個体間変異は電気緊張 的構 造に も反 映さ れて いる事が明らかになり、LDS細胞はその形態的な変異と関連して 、 シ ナ プ ス 統 合 作 用 に お け る 機 能 的 な 変 異 を 持 つ 可 能 性 が 示 さ れ た 。
本 論文 の第2章に おい ては 、前 運動 性NSIの解 剖学 的及 び電 気緊 張的 構造 を、第1章と 同じ 手法 によ って 解析 した 。前 運 動性NSIの樹 状突 起は 細胞 体 の位 置な どに よってAL細 胞とPL細 胞の2つに 大き く分類されているが、これまで両者の樹状突起 の形態的・電気緊 張的な構造の差異は定量的に明らかにされてはぃなかった。定量的な解析の結果、AL細胞と PL細胞は非常に類似した樹状突起の分布および解剖学的構造を持つことが明らかになった。
また、三次元形態計測値および受動的膜性質に基づき、定常状態における樹状突起上での電 位減衰率を計算した結果、樹状突起の肥部分から末端方向及びその逆方向での電位減衰率に おいて両者に統計的な違いは見られず、電気緊張的構造においても両者の細胞は非常に類似 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 次 に 感 覚 性NSIで あ るLDS細 胞 と 前 運 動 性NSIと の 間 で 、 樹状突起の解剖学的・電気緊張的構造の比較 を行った。その結果、解剖学的構造におぃてL DS細 胞は 前運 動性NSIと 比較 して 比較 的単 純で 大き な解 剖学 的 構造 を持 つ事 が明らかに なっ た。 樹状 突起 の肥 厚部位から末端方向 および逆方向での電位減衰率は、LDS細胞が前 運動 性NSIより 大き な値 を示し、電気緊張的にも大きな構造を持ってい ることが明らかに なっ た。 一方 、樹 状突 起の 膜時 定 数は 、前 運動 性NSIがLDS細胞を有意 に上回っていた。
この結果は、断続的なシナプス入カを持続的な膜電位変化に変換する樹状突起のシナプス平 滑 化 作 用 が 、 前 運動 性NSIにお いて より 強い こと を 示し てお り、 前運 動性NSIが 運動 ニ ユ ー ロ ン の 全 般 的 な 背 景 興 奮 性 を 調 節 し て い る と 言 う 仮 説 を 支 持 し て い る 。
本論文第3章では、局在性スパイキング介在ニューロン の解剖学的・電気緊張的構造を定 量的に明らかにし、NSIとの間での比較を行った。局在性 スパイキング介在ニューロンは、
一 見し たと ころ 、NSIと 同様の解剖学的構 造を示す。樹状突起が神経節両側に広がるタイ プ と片 側に 留ま るタ イプ が存在し、両タイプとも、NSIと同様に明確な軸索構造を持たな い。三次元形態計測による定 量的解析の結果、局在性スパイキング介在ニューロンは、樹状 突 起肥 厚部 分か ら樹 状突 起末端までの平均の距離におぃて、感覚性・ 前運動性のNSIのい ず れよ りも 有意 に大 きぃ ことが明らかになった。すなわち、NSIと較べて細い突起がよく 発達していることを示す。ま た、膜の受動的性質におぃて、局在性スパイキング介在ニュー
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口ン はNSIと比較して有意に小さい膜時定数を持っことも分かった。定常状態解析の結果、
局在 性スパ イキング 介在ニュ ーロン の樹状突 起上で の電位減 衰率は、NSIと較ぺると有意 に大きいことが判明した。局在性スパイキング介在ニュー口ンのこの巨大な電気緊張的構造 は、活動電位すなわち樹状突起膜の興奮性によって補償されていると考えられる。ただし、
活動電位は信号の伝播のためではなく、情報処理様式の・一っとして機能すると考えられる。
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学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 助教授 助教授
高畑 浦野 鈴木 伊藤
雅一 明央 教世 悦朗
学位論文題名
Quantitative Analyses of Anatomical and Electrotonic Structures of Local Spiking and Nonspiking Interneurons by Three‑Dimensional Morphometry in Crayfish （ ザ リ ガ ニ 局 在 性 介 在 ニ ュ ー ロ ン の 三 次 元 形 態計 測 によ る 解剖学的及び電気緊張的構造の定量的解析）
近年 、 無 脊椎 動 物 の 中枢 神 経 系で は 、 ノン ス パ イキ ング介 在ニュー ロン（NSI）と 呼ば れる活 動電位（ スバイ ク）を発 生しない 神経細 胞集団が数多く確認されているが、
中枢 情報処 理におけ るその 機能的意 義につい ては、 不明の点がまだ多く残されている。
NSIで の 情 報処 理 で は 、活 動 電 位で は な く段 階 的 なシ ナプス 電位が 用いられ る。従 っ てNSIの 働 きを 理 解 す るた め に は、 細 胞 上で の シ ナプ ス電位 の空間 ・時間的 分布を 規 定 す る 樹 状 突 起 の 電 気 緊 張 的 構 造 が ま ず 解 明 さ れ な け れ ば な ら な い 。 本研 究 で は、 ア メ リ カザ リ ガ ニ腹 部 最 終神 経 節 に存 在するNSIの機 能的意義 の解明 を目 的とし て、その 解剖学 的および 電気緊張 的構造 を、三次元形態計測と神経生理学実 験 に より 、 定 量的 に 解 析 した 。 さ らに 、 同 神経 節 内 で、NSIと同様 の局在性 形態を 示 すス パイキ ング介在 ニュー ロンにつ いてもそ の解剖 学的および電気緊張的解析を行い、
局在 性細胞 における 活動電 位の機能 的意義を 調査し た。
そ の 結 果 、 ま ず 、 感 覚 性 の 同 定NSIで あ るLDS細 胞 が 、 樹 状 突起 の 解 剖学 的 構 造 にお いて一 定の個体 間変異 を示すこ とが判明 した。 特に、神経節中心腺付近の太いセグ メン トとそ の両端か ら直接 分岐する4本の主要な突起がほぼ同様の空間配置をとる一方、
入出 カシナ プスが存 在する 末梢の突 起になる ほど、 その分布はばらつくことが明らかに なっ た。ま た、上述 の個体 間変異の 他に、各 個体に 共通した性質も明らかになった。細 胞体 が存在 する側の 樹状突 起とその 反対側の 樹状突 起の比較を行ったところ、細胞体側
の突起は、長さ、分岐数、面積のいずれにおいても反対側のそれを有意に上回っている とぃう点で各個体とも共通していた。さらに、電気生理学的手法によって明らかになっ た細胞の受動的膜性質と樹状突起の三次元構造に基づぃて、樹状突起電気緊張的距離を 表すデンドログラムも作成した。その結果、解剖学的構造における個体間変異は電気緊 張的構造にも反映されている事が明らかになり、LDS細胞はその形態的な変異と関連 し て 、 シ ナ プ ス 統 合 作 用 に お け る 機 能 的 な 変 異 を 持 つ 可 能 性 が 示 さ れ た 。 また 、前運 動性 のNSIは 、細 胞体 の位置 など によ ってAL細 胞とPL細胞に大別さ れるが、定量的解析の結果、両細胞は非常に類似した樹状突起の分布および解剖学的構 造を持つことが明らかになった。三次元形態計測値及び受動的膜性質に基づき、定常状 態における樹状突起上での電位減衰率を計算した結果、樹状突起の肥厚部分から末端方 向及びその逆方向での電位減衰率において両者に統計的な違いは見られず、電気緊張的 構造においても両者の細胞は非常に類似していることが示された。感覚性のLDS細胞 と前運動性NSIとの間で、樹状突起の解剖学的・電気緊張的構造の比較を行った結果、
解 剖学 的構造 にお いてLDS細胞 は前 運動性NSIと比較して比較的単純で大きな解剖 学的構造を持つ事が明らかになった。樹状突起の肥厚部位から末端方向および逆方向で の 電位 減衰率 は、LDS細胞 が前 運動 性NSIより大きな値を示し、電気緊張的にも大 きな構造を持っていることが明らかになった。一方、樹状突起の膜時定数は、前運動性 NSIがLDS細胞 を有 意に 上回 って いた 。この結果は、断続的なシナプス入カを持続 的な膜電位変化に変換する樹状突起のシナプス平滑化作用が、前運動性NSIにおいて より強いことを示しており、前運動性NSIが運動ニューロンの全般的な背景興奮性を 調節していると言う仮説を支持している。
局在性スパイキング介在ニューロンは、一見、NSIと同様の解剖学的構造を示す。
三次元形態計測による定量的解析の結果、局在性スパイキング介在ニュー口ンは、樹状 突起肥厚部分から樹状突起末端までの平均の解剖学的距離において、感覚性・前運動性 のNSIのいずれよりも有意に大きいことが明らかになった。また、膜の受動的性質に おいて、局在性スパイキング介在ニューロンはNSIと比較して有意に小さい膜時定数 を持つことも分かった。定常状態解析の結果、局在性スパイキング介在ニューロンの樹 状突起上での電位減衰率は、NSIと較べると有意に大きいことが判明した。局在性ス パイキング介在ニューロンのこの巨大な電気緊張的構造は、活動電位すなわち樹状突起 膜の興奮性によって補償されていると考えられる。ただし、活動電位は信号の伝播のた め で は な く 、 情 報 処 理 様 式 の ー っ と し て 機 能 す る と 考 え ら れ る 。 これを要するに、著者は、NS樹状突起のシナプス統合作用の基盤となる電気緊張的構 造を確立するとともに、局在性ニューロンでの樹状突起形態と活動電位発生機能との連 関を明らかにしたものであり、行動制御におけるNSIの働きに関する神経生理学的理解に
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貢献するところ大なるものがある。
よって著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格あるものと認める。
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