博士（歯学）山下知巳 学位論文題名
ネ ダプ ラチ ンの Na+ ， K+ ― ATPase 活性阻害と ヒト腎由来近位尿細管細胞に対する作用
学位論文内容の要旨
【目的】
プラチナ系抗がん剤が誘発する腎毒I生の詳細な機構はまだ不明であるが、Nr， K+ーATPase濳陸 の抑 制が 腎臓に おけ る近 位尿 細管の 機能 変化に関与するとされ て い る。 プ ラ チナ 系抗 がん 剤で あるネ ダプ ラチ ン(NDP)はシ スプラ チン より 抗 がん作用が強く、腎毒陸は少ないとされているものの、臨床で用いる場合は水分 負荷が必要であり、腎障害は主な副作用のひとっとしてあげられている。しかし、
NDPの 腎 毒 性 に 関 す る 詳 細 な 報 告 は 少 な く、Na+，K+‑パFPaseに 対 す る作 用 につ いては 報告 が見 られ ない。 そこ で、NDPによ る腎 毒I生の機構とその予防法 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て 、NDPによ るNa+，K+‑ ATPase活 性 阻害 と ヒ ト 腎 由 来 近 位 尿 細 管 細 胞 に 対 す る 作 用 に つ い て 検 討 し た 。
【方法】
1．NDPによるブタ腎Na゛，K十‑ ATPase活陸阻害
1）プ夕腎Na+，K―パIBヨse活性とNDPによる阻害の測定
ブ 夕腎 臓 よ り精 製し たNr，K゛−AコPaseを含 む反応 液に 、種 々の 濃度のNDP を 添 加し 、 そ の後ATPを加 えて 反応 を行 ったの ち、 酵素 反応 の結果 生じ た無 機 1」ン酸を定量した。
2） ．NDP存 在下 で抑 制さ れたNa十，K←ーAロaSe活性の含硫化合物による回復の 測定
同 様 に 酵 素 を 含 みNDP濃 度 が2mMと な る反 応 液 を プ レ イ ン キ ュ ベ ー ショ ン した 後に、 含硫 化合 物で ある2一メルカプト工夕ノール、ジチオスレイトール、
グルタチオンあるいはジエチルジチオカルバヌートを加え、その後、A工Pを加え 反応を行った。以後の操作は上記に従った。
2．NDPの ヒ ト 腎 由 来 型 劃 立 局 細 管 細 胞 （HRPTEce‖ ） に 対 す る ヶH羽 1）NDPのHRPIECenに対する作用の評価
HRnEceuと 腎 上 皮 細 胞 用 増 殖 培 地 はBioWhittaker社 よ り 購 入 し た 。細 胞 を 種 々の 濃 度 のNDPを添加 した 培地 で培 養し、 その 後、 細胞 を超音 波破 砕し 、 その ホモジ ェネ ート を用 いてタ ンパ ク質 量、Na十，Kt―ATPase活性、酸性ホス
ファターゼ活性を測定した。
2） NDP存在下のHRIyFE cellに対する2MEの作用
細胞 を20ルMのNDPと 同時に種々の濃 度の2MEを添加した 培地で培養し た。
以後の操作は上記に従った。
3） HRPTEcellの生存度に対するNDPと2MEの作用
細胞 を 種々 の 濃度 のNDPと2MEを加え た培養液で培 養した。Lumi′I'ech社 よ り 購 入 し た Via工 jght HSを 用 い て 、 培 養 液 中 のATPを 測 定 し た 。 4） NDPによるHRPTE cellのアポトーシスの検出
20お よ び200 uMのNDPを含 ん だ培 養 液で 細 胞を 培 養し た。 回 収細 胞 から DNA断片 を抽出し、アガ 口ースゲル電 気泳動した後 、DNAラダーを検出した。
【結果】
1.NDPのブ夕腎Na゛，K十一ATPase活性に対する作用 1） NDPによるブ夕腎Na+，K一ATPase活性阻害
NDPはその 濃度とプレイ ンキュベーション時間に依存してNr，K゛一バIPase 活性を阻害した。
2） NDP存 在 下 の Nr， K＋ ― ATPase活 性 の 含 硫 化 合 物 に よ る 回 復 2mMのNDPを 添 加 後120分 で活 性 は約40％ ま で低 下 した が、 こ の時 点 で、
2MEを添 加すると、Na十，K←ーバn aSe活性は添加した2MEの濃度と時間に依 存して活´l生化された。他の含硫化合物を用いた実験でも、その添加濃度に依存し て餅 卩ase漕I生を回復し た。しかし、その活性回復の程度は2MEでもっとも高 かった。
2‐NDPのHRPTEce‖に対する作用 1）細胞増殖および酵素活性の抑制
NDP濃度に 依存した細胞 の増殖抑制が光学顕微鏡下で観察され、回収細胞か ら 求 め た タ ン パ ク 質 量 も 、 NDP濃 度 に 依 存 し て 減 少 し た 。 ゛ Na十，K．＋一鮒Pase活性は、総活性および一定夕ンバク質量あたりの活性すな わち 比活性のいず れもNDP濃度に依存して低下した。さらに酸性ホスファター ゼの 総活性と比活 性は、どちら もNDP濃度に依存して低下したが、比活性の低 下はNr，K＋・ーAn ase活性の場合より軽度であった。
2）NDP存在 下 のタ ン バク質量お よび酵素活性 の低下に対す る2MEの回復作用 臨 床 血 漿 濃 度 と 言 わ れ る20MMのNDPと 同 時 に 種 々 濃 度の2MEを添 加 して 細胞 を培養したと ころ、2MEを20ルM添加し た際にタンバ ク質量は有意に増加 した 。Nr，K゛ーバIPase活性お よび酸性ホス ファターゼ活 性も、20仏Mの2ME を 添 加 し た 際 に 総 活 性 が 有 意 に 増 加 し 、 比 活 性 も 軽 度 に 増 加 し た 。 3）NDP存任下のHRnEcenの生存度と2MEの効果
NDP濃 度 に 依 存 し た細 胞死 が 観察 さ れた 。NDP濃 度が20ルM以 下 では 、 細 胞は80％以上の生存度であったが、80比M以上の濃度ではほぽ100％死滅した。
20此MのNDPと 同 時 に 種 々 の 濃 度 の2MEを 添 加 し た 際 の 生 存 度 は150彫M
以 下 で 増 加 し 、10ルMで は 約150％ と最 大 で あ っ た 。 ま た600ルM以上 で はNDP 単独より生存度は低下した。
4） NDPによるHRPTE cellのアポトーシス
NDP非 存 在 下 あ る い は20ルMNDP存 在 下 で は DNAラ ダ ー は 観 察 さ れ な か っ た が 、200ルMでは観 察さ れ、 細胞死 にア ポト ーシ スが関 与す るこ とが 示され た。
【考察】
1.NDPに よ る ブ 夕 腎Na゛ ，K゛ −ATPase活 陸 阻 害 と 含 硫 化 合 物 に よ る 回 復 近 位 尿 細 管の 機能は 、腎 にお ける糸 球体 濾過 量の 約75％ を再 吸収 する ことで あり 、こ の再 吸収 はハぱ ，K+‑ ArIPaseが 近位 尿細管 細胞 においてナトリウムを 輸送することにより生じる浸透圧の変化により受動的に行われている。このNa+， K+‑ ArIPaseの 近位 尿 細 管 に お け る 重 要 な 機能 を 考 え る と 、NDPが 引 き 起こ す Na+，K+‑バFPse活性の 阻害 が腎 毒陸の 原因 のひ とっ になり うる と推 測さ れる。
含 硫 化 合 物 はそ の 添 加 濃 度 に 依 存 し てNDPに よっ て阻害 され たブ 夕腎Na十，
K．＋―ぷIR〕se活性を可逆的に回復した。これらの薬物はNa十，K −パIPase活性 を回 復す るこ とに よ．りNDPの腎 毒性 を軽 減で きる可 能性 を持つことを示唆して いる。
2．NDPのHRPTEce‖に対する作用と2MEの効果 1）NDPによる細胞死とその機構
NDP存 庄 下 で の細 胞 増 殖 の 抑 制 は 、 回 収 した 培養 細胞の タン バク 質量 の減少 お よ び 生 存 度試 験の結 果か らNDPに よる 細胞 死であ ると 確認 された 。ま た、DNA ラダ 一・ 検出 の結 果、高 濃度 のNDPに よる 細胞 死の機 構に アポトーシスが関与し ていることが示唆された。
2）NDPによるHRTEcenの酵素活性阻害と2MEの保護効果
細 胞 死 を 引 き起 こ す 濃 度 のNDPに よ る 酵 素活 陸の 低下に は、 細胞 死に よる細 胞 数 の 減 少 以 外に 、NDPに よ る 直 接 的 な 酵 素活 陸の 抑制も 関与 して いる ものと 考えられる。
至 適 濃 度 の2MEはNDP存 在 下 で の 酵 素 活 性 の 低 下 を 抑 制 す る こ と が で き る の み な ら ず 、 細胞 死 も 抑 制 し た 。 こ れ ら の 結果は 、2MEは 酵素 活性 を保 護する こ と に よ っ て 、NDPの 近 位 尿 細 管 細 胞 に 対 する 毒陸 を軽減 でき る可 能性 を示唆 する。
し か し 、NDPは、 酵 素 な ど タ ン ノ 、 ク 質 に対 す る と 同 時 にDNAに 対 し ても ク 口ス リン ク作 用な どを示 し、 これら両者の結果が総合的な腎毒陸発現機構である と考 えら れる 。そ のため 、よ り詳細な腎毒陸機構の解明には、更なる研究が必要 である。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
ネ ダプ ラ チン の Na+ ， K+ − ATPase 活性阻 害と ヒト腎由来近位尿細管細胞に対する作用
審査は、 審査担当 者全員が 一堂に会 し、口頭に て行った 。まず、論文提出者に研究の概 要 の 説 明 を 求 め た 。 論 文 提 出 者 は 研 究 内 容 を 明 快 に 説 明 し た 。 ． 論文の概 要は以下 の通りで ある。
【目的 】ネダプ ラチン(NDP)に よる腎毒 性の機構と その予防 法を明ら かにする ことを目 的 とし て 、Na゛ ，K+―ATPase活 性 阻害 と ヒト 腎 由 来近 位 尿細 管細 胞(HRPTE celDに対す る 作用にっ いて検討 した。
【方法】
1．NDPによる ブ夕腎Na゛ ，K+‑ ATPase活性阻 害 1）活性阻 害の測定
プ 夕 腎臓 よ り精 製 し たNa゛ ，K゛‑ ATPaseを 含 む反 応 液に 、NDPを添 加し、そ の後ATP を 加 え て 反 応 を 行 っ た の ち 、 酵 素 反 応 の 結 果 生 じ た 無 機 リ ン 酸 を 定 量 し た 。 2）含硫化 合物によ る活性回 復の測定
同様 に 酵 素を 合 みNDP濃 度 が2mMと なる 反 応 液を プ レイ ン キ ュベ ー シ ョン し た後 に 、 含硫化合物である2―メルカプトエタノール（2ME冫、ジチオスレイトール、グルタチオンあ るい は ジ ェチ ル ジチ オ カ ルバ メ ート を 加 え、 そ の 後、AIPを加え 反応を行 った。以 後の 操作は上 記に従っ た。
2．NDPのHRrceuに対 する作用
1）HR阿Ece11を 種々 の 濃 度のNDPを 添加 し た培 地 で 培養 し 、その タンバク 質量、Na゛ ， K十一A1、Paseと 酸性ホス ファター ゼ活性を 測定した。
2） 細 胞 を20肛MのNDPと 同 時に 種 々の 濃 度 の2MEを 添 加し た 培地 で 培 養し た 。以 後 の 操 作は上記 に従った 。
3） 細 胞 を 種 々 の 濃 度 のNDPと2MEを 加 え た 培 養 液 で 培 養 し 、 そ のATPを 測 定 し た 。 4）20お よ び200UMのNDPを 含 ん だ 培 養 液 で 細 胞 を 培 養 し た 。 回 収 細 胞 からDNA断片 を 抽 出 し 、 ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 し た 後 、 DNAラ ダ ー を 検 出 し た 。
【結果と 考察】
博明 人 邦 正 田木 村 福鈴 田 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
1.NDPのプ夕腎Na+，K+ーATPase活性に対する作用
1） NDPはその濃度とプレインキュベーション時間に依存してNa゛，K゛ーATPase活性を阻 害した。
2） NDPに より低下し た酵素活性 は2MEを添 加後、2MEの濃度と時間に依存して活性化 された。他の含硫化合物を用いた実験でも同様の結果であったが、その酵素活性の回復の 程度は2MEがもっとも高かった。
2.NDPのHRPTE cellに対する作用
1） NDP濃度に依存した細胞の増殖抑制が光学顕微鏡下で観察され、回収細胞から求めた タンパク質量も、NDP濃度に依存して減少した。
Na゛，K゛ーATPaseおよび酸性ホスファターゼは、総活性および一定夕ンバク質量あたり の活性すなわち比活性のいずれもNDP濃度に依存して低下した。
2） 20uMNDPと同 時に2MEを20ロM添加 した培養の際にタンバク質量は有意に増加し た。酵素活性の上昇も同様であった。
3）NDP存 在 下のHR阿Ece11の生 存 度は 、NDP濃 度に 依 存し低下し た。20ロMのNDPと 同 時 に2MEを 添加 し た際 のHR阿Ece11の 生 存度 は2ME150ロM以 下 で 増加 し 、louMで は約150％と最大であった；
4）NDP非 存 在下 あ るい は20ルMNDP存在 下 ではDNAラ ダ ーは 観 察さ れ なか っ たが 、 200ロMでは観察され、．高濃度のNDPにる細胞死にアポトーシスの関与が示唆された。
NDPによ る酵素活性の低下には、細胞死による細胞数の減少以外に、NDPによる直接 的な酵素活性の抑制が関与しているものと考えられ、それにより弓Iき起こされる近位尿細 管の機能変化が腎毒性の機構のーっになりうると推測された。また、2MEが酵素活性を 保護することによって、NDPの近位尿細管細胞に対する毒性を軽減する可能性が示唆さ れた。
続いて、審査担当者から本研究およびその関連事項について種々の質問がされた。
実験法に関して
1）精製Na+，K二十‑ ATPase活性阻害の回復の実験で含硫化合物をNDPの後から入れる理由 やATPを加えるタイミングについて
実験結果に関して
2）精製Na十，モぐ―ATPaseに対する実験において、NDPによる活性阻害が時間依存で起こ る 理 由 や そ の 活 性 回 復 の 程 度 が 含 硫 化 合 物 の 種 類 で 異 な る 理 由 に つ い て 3） HRPTE cellを用いた実験において、NDPや2MEによりタンパク質量や酵素活性の変 化 が 起 こ る 主 因 な ら び に NDPの 細 胞 へ の 移 行 経 路 と 作 用 に つ い て 臨床的な事項として
4）臨床で用いられているプラチナ系抗がん剤の各々の特徴、腎毒性軽減に用いられてい る 薬 剤 な ら び に 2MEを 臨 床 応 用 す る に あ た っ て の 問 題 点 に つ い て 5）本実験の今後の展望について
こ れ ら の 質 問 に 対 し て 、 論 文 提 出 者 は そ れ ぞ れ 明 快 に 回 答 し た 。 以上より、本論文内容が高く評価されるとともに、本論文提出者は、本研究を中心に広 い 知 識 を 有 し 、 博 士 （ 歯 学 ） を 授 与 す る に 値 す る も の と 判 定 さ れ た 。
