博士（医学）大釜 学位論文題名

I． は じ め に

     博士（医学）大釜 学位論文題名

gp90 ″EL ―14 発現T 細胞の分布と機能 学位論文内容の要旨

浮

  リ ン パ 球 の り ン パ 節 組 織 内 へ の 移 動 は ， 高 内 皮 細胞 静脈(HEV)を 介し て行 わ れる 。こ の 高 内 皮 細胞 との 特 異的 接着 で 働く りン パ 球表 面構 造 は，ホーミ ングレセプ夕一と呼 ばれ，MEL―14 単 ク ロン 抗体によってgp90 ″L‑I。分子が同定されて いる。このように りンパ球と末梢リ ンパ節 HEVと の 接 着 機 構 が ， 分 子 レ ベ ル で 解 明 さ れ で き た が ， 通 常 の 条 件 下 で は ル ン パ 球 上 のgp 90″ELー｜＾抗原発 現パ夕一ンが急速 に変化するため，各リンパ組織細胞が，生体内て実際どの程度 のgp90 Lー1゜抗 原を 発 現し てい る かに っい て は， 一定 の 見解 が得 ら れなかった。著 者はgp 90 L―I＾のmodulationを止めるこ とにより，各リンパ組織細胞上の実際のgp90 ∴ー‥発現量 を 測定することに成 功した。また末梢 ルン′く節T細胞の90％以上 はgp90″‖―I。を発現している が ，gp90 FLー｜。 陰性細胞も少数存 在しており，これら の機能が近年注目 されている。今回の研 究 においては，種々のりンパ組織細胞のgp90″EL―1 発現の詳細な定量的解析と，gp90 だL一｜＾陽 性 ，陰性リンパ球の 機能を解析した。

n． 材 料 と 方 法

1）3重 染 色 （i） ：C 57BL/6（B6） の 脾(SP） ， 腸 間 膜 ル ン パ 節 （MLN),末 梢 リ ン パ 節 (PLN)， 末 梢 血(PB） ， 及 び パ イ エ ル 板 （PP)よ ル リ ン パ 球 （1Xlo° 個 ） を 採 取 し ，MEL

‑14， ビ オチ ン化 抗 ラッ トだ 一 鎖抗 体を 順 次加 えた 後 ，非 特異 的 染色 を防 ぐ ため ，マ ウ スIg， 及 び ラ ッ トIgを 加 え た 。 最 後 に ，streptavidin←TANDEM（phycoerythrine/texas red） ， phycoerythrine（PE） ― 抗CD4（L3T4） 抗 体 ， 及 びfluorescein isothiocyanate（FITC) ー 抗CD8（Lyt2） 抗 体 の カ ク テ ル で 染 色 し た 。

2）3重 染 色 （ 五 ） ： PLNT細 胞 に1次 抗 体 と し て 抗Pgp亠1を 加 え ， 上 記 の ス テ ・ ソ プ 後 ， PE一 抗CD4抗 体 とFITC―MEL―14,又 はPEー 抗CD8抗 体 とFITC亠MEL−14で 染 色 し た 。

3） フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー ： 螢 光 色 素 で ラ ベ ル し た 細 胞 は ，FACScanを 使 用 し ，FSCとSSC の2っのパラメ― 夕で生細胞を選別し ，   30, 000個以 上にっいて解析した。場合によっては死細胞 をpropidiumiodideにて染色し，生細 胞のみを解析した 。

4） 混 合 リ ン パ 球 反 応 （MLR） ：B6又 は ，BlOBR（BR） マ ウ ス の 各 リ ン パ 組 織 よ り 得 た り ン パ球 を ナイ 口ン ウ ール カラ ム を通 し， ヒ ・ソ ジ抗 マ ウスIgGダ イナ ビ ーズと2回反応 した後，

T細 胞 分 画 を 得 た 。 こ の 細 胞 よ り ，MEL一14と ヒ ゛ ソ ジ 抗 ラ ッ トIgGダ イ ナ ビ ー ズ でgp 90 L―1＾陽性細胞を 除き，gp90'''∴―‥陰性反 応細胞とした。刺 激細胞は，AKR又はBl0マウ ス 睥 細 胞 を マ イ ト マ イ シ ン 処 理(40肛g／ml)後 ，lxlo￣ 個 ／ ウ ェ ル の 反 応 細 胞 に 対 し ，2x 10゜個 ／ ウェ ルを 分 注し た。 反 応細 胞と 刺 激細 胞を2〜5日 間混合培養後，°Hーチミジ ンの細胞 内取り込 み量を測定した。

5）CD4細 胞 とCD8細 胞 の 分 離 ： リ ン パ 球 を 抗Lyt―2抗 体 ， 又 は 抗CD4抗 体 で 処 理 後 ， ヒ ・ ソ ジ 抗 ラ ッ トIgGダ イ ナ ビ ー ズ を 用 い て ， そ れ ぞ れCD8陽 性 ， 又 はCD4陽 性 細 胞 を 除 去 した。

6） マ イ ト ジ ェ ン 反 応 ： 細 胞 に ，  Con A,又 はPHA（ い ず れ も5Hg／ml） を 加 え て3日 間 培 養 後 ， 反 応 性 をMLRと 同 様 H一 チ ミ ジ ン の 取 り 込 み 量 で 測 定 し た 。ILー2， 又 はIFN‑7 ア ッ セ イ に は ， 培 養 細 胞 を 洗 浄 し ， 新 た に 培 養 液 を 加 え ，12時 間 培 養 後の 上 清を 用い た 。 7） 抗CD3抗 体 刺 激 ： 抗CD3抗 体 （2Cll） を プ レ ー ト 表 面 に 固 相 化 し た 。 上 記 の 方 法 で 用 意 した 反 応細 胞を プ レー トに 分 注， 培養 後 ，培 養上 清 中のIL―2，IFNーア 産生量を測 定した。

8) 11−2ア ッ セ イ ： 上 記 培 養 上 清 を ，ILー2依 存 性T細 胞 株 ，CTLL−2に 加 え た 。 培 養 後 ， CTLL―2の 増 殖 反 応 を 測 定 し ， 反 応 細 胞 か ら 分 泌 さ れ たIL―2の 量 を 間 接 的 に 算 定 し た 。 9）IFN ‑7定 量 ： 反 応 細 胞 の 培 養 上 清 中 のIFN‑7分 泌 量 を,INTERTEST ‑アELISAキ ッ トを用い て，波長492/620nmで測定後 ，解析した。

m． 結  果

1） 各リンパ組織細胞のgp90″EL−｜＾発現量：浮遊細胞調整の過程で，gp90 L一1゜抗原量が変化 し た 。 こ の 変 化 を 抑 える ため に ，NaNヨを 加え たHanks液に 各組 織 およ び末 梢 血を 取り ， 浮遊 細 胞に調整後 ，3重染 色を行った。PLN, SPリンパ 球のgp90 ″L亠1＾ 発現量は，NaNヨを加えナょ い 通 常 の メ デ ィ ウ ム を用 いて 細 胞を 処理 し た時 には ，NaNヨ 添加Hanks液の も のと 比べ て 著明 に 高か った 。 しか し，PBのgp90″‖ー｜ 発現量では，両 者間に差が認めら れなかった。さらに SP, PLN, PB, MLNとPP細 胞 ポ ピ ュ レ ー シ ョ ン をNaNヨ 添 加Hanksで 処 理 し ，CD4陽 性

T細 胞 ，CD8陽 性T細 胞 ， 及 びB細 胞 の 各 集 団 のgp90M':ト ‥ 発 現 量を 比 較 し た 。そ の 結 果 ， PBリン パ 球 のgp90MEL−J4抗 原量 は ， い ず れの ポピ ュレ ーショ ンでも 他のり ンパ組 織と 比べ高 い 値 を 示 し た 。 ま たPLNは2番 目 に 高い 値 を ，PP細 胞 は 再 低 値を 示 し た 。 他の 細 胞 で は 中 間 値を 示した 。

2） リ ン パ 球 上 のgp90MF",−14とPgp←1抗 原 発 現 の 関 係 ：Pgp一1の 発 現 はCD4陽 性 細 胞 で 高く ，gp90ME'.―1゜ の発現 はCD8陽性細胞で高いこと，gp90M″L ‑I。陰性集団の大部分は，CD4， CD8に関わ らずPgp―1発現 量が高 いこ とが判 明した 。

3) gp90MEト14陰性 と 陽 性 細 胞のMLR： gp90MF".一J＾ 陽 性T細 胞とgp90″ ‑＾ 陰 性T細 胞 の AKR抗 原 に 対 す るMLRを 調 べ ， そ の 機 能 を 比 較 検討 し た 。 そ の結 果 ， い ず れ の組 織 のT細 胞 に お いて も ，gp90MEト14陽 性T細 胞と 較 べ て ，gp90'F"‑I 陰性T細胞 の反応 性は 有意に 高かっ た 。 また ， 各 組 織 より 得 たgp90JVfい‥ 陰性， 陽性T細胞 それぞ れの 反応性 を比較 した時 ，組 織 間 に は有 意 の 差 は 認め ら れ な か っ た。 し か し ，BRのgp90M'L ‑1゜ 陽 性T細 胞 反 応 性 をHー2に 対 す るMLR (Bl0)，Mls―1 に 対 す るMLR (AKR)で 比 較 す る と ，Mls―1 に 対 す る 反 応 が 有意 に 高 か っ た。 し か し ，gp90MEL‑】 陰 性T細 胞 で は 逆に ，Bl0に対 す る 反 応 がAKRに 対す るもの よりは ，有 意に高 かった 。

4）gp90MEL‑I 陰 性細胞 と陽性 細胞の マイ トジェ ン反応： CD4゛集団では，gp90″‖―1 陽性と 陰 性T細 胞 群 の 間 に，ConAに 対 す る 反 応 に有 意 の 差 は 認め ら れ な か ったが ，CD8゛ポピ ュレ ー シ ョ ンで は ，gp90M"ト14陽 性 細 胞 と較 べ ，gp90'v‖―14陰性T細胞 は高いConA反応 を示し た。

ま たConA刺 激 後 ， 上 清 中 のIL―2量 を 測 定 し た 結 果 ，CD4゛ ，CD8゛T細 胞 の 両 方 でgp 90MEトI＾ 陰性細 胞の上 清は ，gp90MピL―14陽性 と較 べ，高 いIL―2値を 示した 。さ らに，CD4゛ T細 胞 はIFN‑7を ほ と ん ど 産 生 し な か っ た が ，CD8゛T細 胞 は ， 多 量 のIFN‑7を 分 泌 し た 。 5）CD8゛T細胞 の サ イ ト カイ ン 分 泌 とgp 90'v'FLー14発 現 ： CD8゛gp90Mr:ー1゜陰性T細 胞は ConA，PHA， ま た は2Cllい ず れ の 刺 激 によ っ て も ，CD8゛gp90 ‖‑1 陽 性 細 胞よ り 多 く の ILー2を 分 泌 し た 。 ま た，ConA又 は2Cllで 刺 激 し た 時，CD8゛gp90″ ￡∴ −1゜ 陰 性T細 胞 は CD8゛gp90MEL ‑1＾ 陽 性 T細 胞 と 較 べ て ， 著 明 に 高 いIFN‑ア を 分 泌 し た 。

IV.考  察

1）PLNとSP中 のCD8゛T細 胞 は ，invivoで はgp90mEL ‑】 ＾発 現 量 は 低 い が， 細 胞 浮 遊 液を 作 製 す る 過 程で ， そ の 発 現 量を 増 加 さ せ たと 考 え ら れ た。 ま たPBの ルンパ 球は，invivoに お い てす でにマ キシマ ムに近 いgp90MFL一｜ を発 現しているため，細胞浮遊液調整中に発現量の見

掛 け 上 の 増 加 が 認 め ら れ な い と 考 え ら れ た 。 っ ま り ，SPとPLNのり ン パ 球 は ，invivoで は gp90″ どL―I 発現 か抑制 され ている が，in vitroでは ，up−regulateされ る事が示唆された。

2） 抗CD3抗 体 に よ り 活 性 化 さ れ たCD8゛Pgp‑1゛gp90 ‖ ―1゜ 陰 性T細 胞 は ， 多 量のIL― 2，INF‑7を 分 泌し た 。 さ ら に， 異 系 組 織 移植 に よ り 増 加 したCD8゛gp90 L一1゜陰性T細 胞 も 多く のINF ‑ア ， グ ラン ザ イ ム を 分泌 し ， 高 い 細 胞傷 害 性Tリ ンパ 球 （CTL） 活 性 を 持っ こ と をMobleyら は報 告 し て い る。 そ れ ゆ え ，gp90 fL−1＾ 陰性CD8゛T細 胞は ，ヘル パ一T細胞 非 存在 下 で も そ れ自 身 が 分 泌 した サ イ ト カ イ ンに よ っ てCTLへ と 誘 導さ れ る 経 路 が 示唆 さ れ た 。

3）gp90″EL→I。陰 性とgp90″ELー｜ ＾陽性 細胞間 で，IL―2，INF‑7の産生 量に差が認められ，

gp90″EL一1＾ 陰 性Pgp―1゛T細 胞 が メ モIJーT細 胞 で あ る と い う 考 え に 一 致 し た 。

V． 結  語

1） リンパ 球上のgp90 L一1゜ 分子のmodulationを 抑える 条件下 でgp90 ‖−1＾発現パターン を解 析 す る と ， 末梢 血 （PB)， 末 梢 リ ンパ 節 （PLN） ， 脾(SP） ， 腸 間膜リ ンパ節 （MLN）， パ イエル 板(PP）の順 にgp90 ‖―1＾発 現細 胞の割 合，並びにgp90 L‑1゜発現量が高いことが判 明した 。

この 順 序 はPLNとHEVと の 解 剖 学 的 ，機 能 的 距 離 に相 関 し て お り，gp90 ‖ 亠I＾ がホ ー ミ ン グレ セ プ タ ー と して 働 く 際 ， その 発 現 量 に 依存 して効 率的に りンパ 球がPLNに マイグ レート す ると考 えると ，こ れまで のgp90 L‑I のホ ーミン グレセプターとしての役割と一致する結果と 考えら れた。

2） 脾，末 梢リン パ節い ずれ におい ても，gp90″EL‑1゜陰性T細 胞は，gp90 FL‑I 陽性T細胞 と 較 べ ， 高 いMLRを 示 し た 。 ま た，gp90 L‑1゜陰 性T細 胞 は，Mls抗原 よ りH―2分 子 に 対 し て高 い 反 応 性 を 示し た が，gp90 ビL−1＾陽 性T細胞は ，H―2と較べMls抗 原によ り強い 反応 性 を示し た。

3）CD8゛ ポピュ レーシ ョンで は，gp90 ″L―J。陽性T細胞群と較ベ，gp90 L‑｜。陰性T細胞は 高いConA反応 を 示 し た が，CD4゛ポ ピ ュ レ ― ション では， 著明 な反応 差が認 められ なか った。

し か し ，ConA刺 激 後 のIL一2，INF ‑ア 産 生tま ，CD8゛ ，CD4゛ 両 ポ ピ ュ レ ーシ ョ ン に お い て ，gp90MELー1＾ 陰 性分 画 で 高 か った 。 同 様 の 傾向 はPHA，2Cllで刺 激 し た ，CD8゛ ポ ピ ュ レーシ ョンに おい ても認 められ た。

主 副 副

学位論文審査の要旨

  リ ン パ 球 の末 梢 リ ン パ 節へ の 移 動 は ， リン パ 節 傍 皮 質域の 高内皮 細胞静 脈（HEV） を介し て 行わ れ る 。HEVと の 接 着 で働 く り ン パ 球上 の 分 子 は ， ホーミ ング レセプ ターと 呼ばれ ，こ れら は現在gp90 だL亠1＾と同定されている。しかし，gp90 ‖亠1＾分子fま，リンパ節にはホーミングし ない未 熟型胸 腺細 胞，好 中球な どにも 発現さ れて いるな ど，こ れらの ホー ミング レセプターとし て の 役 割 と は 一 致 し な い 結 果 が ， 報 告 さ れ て い る 。 本 研 究 に お い て は ， リ ン パ球 上 のgp 90MピL―1＾発現量をよりin vivoに近い状態で定量することに成功し，さらにgp90 L←I。発現，及 び非発 現T細胞の 機能を 解析 し，gp90 ∴―1→のホーミングレセプターとしての役割を再確認し た。

  種々の りン パ組織 ，末梢 血よル リン パ球浮 遊細胞 を調整 する際 ，ア ジ化ナ トリウ ムを添加した ハンク ス液内 で行 い，ア ジ化ナ トIJウ ム非添加ハンクス液で処理したものと比較した。その結果，

末梢血以外のりンパ球は，細胞浮遊液調整過程で速やかにgp90 ∴亠｜＾分子発現量を増加するこ とが 判 明 し た。し かし， 末梢IJンパ球 は，ln vivoで 既にマ キシマ ムのgp90Mト1 を発現 してい るため ，in vitroで発現 量を増 加する こと はなか った。 アジ化 ナトリ ウム 添加に よって，発現量 の変化 を抑え たり ンパ球 ポピュ レーシ ョンのgp90 ‖ ―1＾発現 細胞の比率，及び発現量は，末梢 血， 末 梢 リ ン パ 節， 脾 ， 腸 間 膜リ ンパ節 ，パ イエル 板の順 に高か った 。これ らは末 梢リン パ節 HEVと の解剖 学的， 機能 的距離 と相関 し，gp90″ L亠I が その発現量依存性にホーミングレセプ 夕一と して働 くこ とを支 持した 。また ，gp90″ ピL−1゜とPgp一1発現 量はお おむね 逆相関の関係 にあることが判明した。

  次に，gp90 L―1＾ 陽性， 陰性T細胞 の機能 を比 較した 。混合リンパ球反応においては，リン パ節， 脾いず れに おいても，gp90″‖―1＾陰性T細胞が，gp90″EL‑｜＾陽性細胞より高い反応性を 示し た 。 ま た ，gp90″ ″L‑I＾ 陰性T細 胞 は ，Mls抗 原 よりH−2抗原 に強い 反応 性を示 したが ， gp90″ ￡L‑t＾陽 性T細 胞 は， そ の 逆 の 反応 パ タ ― ン を 示し た 。T細 胞をCD4陽性 とCD8陽性 の 2分 画 に 分 け， さらに これら をgp90″ ‖―1＾陽 性と陰 性亜群 に精 製後コ ンカナ バリンAで 刺激す ると ，CD4陽性，CD8陽 性いず れにお いて も，gp90 L一1＾陰性 細胞 がgp90 ‖ ーI 陽性 細胞

則 彦

敬

和 邦

江 林

木

野

小 小

吉

授 授

授

教 教

教

査 査

査

よ り 高 いIL一2，INF‑7産 生 を 示 し た 。 同 様 の 傾 向 は ，PHA， 固 相 化 抗CD3抗 体 で 刺 激 し たCD8陽 性T細 胞 で も 認 め ら れ た 。 こ れ ら の 結 果 は ， 末 梢 リ ン パ 節 に ほ んの 数％ 存 在す るgp 90 ‖一1＾陰 性 リン パ球 が ，生 体内 で 一度 活性 化さ れたメモリ一細胞で あることを示唆し た。

  論 文発 表 に際 し， 小 林， 古木，上 出，武市，細川各 教授より，gp90MビL ‑1 陰 性T細胞は ，活 性化の結果gp90″ ‖←I 分子発現量が低下し たものなのか，またその分子量低下の生物学的意義，

末梢 ルン パ 節以 外の り ンパ 組織に対 するホ―ミングレ セプターにっいて， アジ化ナトリウ厶 処理 リン パ球 を 機能 アッ セ イに 用い た のか どう か ，gp90"ト14の 接 着因 子と し ての 役割 の 直接 評価 はし てい るか，gp90M1:ト1＾発現量に影響する サイトカインにっ いて，gp90 ‖｜ ＾陽性と陰性T 細胞 にお け る混 合リ ン パ球 反応 の 標的 抗原 の 違い の意義，抗原 レセプ夕一を介し ないT細胞 活性 化にっいて，T細胞以外の 細胞におけるgp90 ピL←I＾発現にっいて，など数多くの質問があった。

申請 者は 一 部不 十分 な もの があった が，おおむね適切 な解答を成し得た。 また，小林，古木 両教 授には個別にご審 査いただき合格と 判定された。

  以 上， 本 研究 は単 一 浮遊 リンパ球 調整当初より，ア ジ化ナトリウム添加 メディウムを用い ると いう 単純 な改良手順により ，gp90″‖ー1＾分子のより 生体内に近い発現量 を定量化すること に成 功し，gp90 ‖− 】＾分子のホーミ ングレセプターとしての役割を確認した。また，gp90";L―1￣陽 性T細 胞と 陰性T細胞 の 機能 を解 析 し， 末梢 ル ンパ 組織 に 少数 存在 す るgp90'∴ リ＾ 陰 性ル ンパ 球が ，in vivoです でに活性化さ．れ たメモリー細胞で あることを示唆する 結果を得た。これ らは いずれも新知見で あり，博士（医学 ）の学位に相当す ると判定した。