性 細胞 の
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(2) 780. 岡. 水 癌 細 胞(wild. EATC岡. 二 郎 教 授 よ り供 与)及 あ る. HeLa. S3細. 山大 学医学 部 び そ のADR耐. 層 細 胞 培 表 で あ り, wild. 胞 で, ADRを. EATCは. 胞 は単. 浮遊細 胞培. 性 細 胞 は 当 教 室 で 樹 立 した細. 繰 り返 し処 理 し た後,増 殖 す る 細. 胞 を選 び,各 種 濃 度 のADR 2.0, 5.0, 10.0μg/ml)の を 各 濃 度 のADR耐 Dulbecco's. (0.2, 0.5,. 1.0,. Eagle medium. (日水 製 薬)に10%仔. (DMEM). 牛 血 清(Gibco. ユ シ りン(明 治 製 菓),. トレ プ トマ イ シ ン(明 治 製 菓)を. Co.),. 良. 夫. 5.. FCM. Rho. analyzer(励. 5%. CO2イ. 時 間培 養 し た 後, 10%血 と交 換 し,再 び5%. て測 定 し,得. 加 え た もの を. 胞周期 の解析. は,高 橋 らの 方 法13,14)に よ り, PI染 色 に よ り求 め たDNAと. ス トグ ラ ム か ら各 細 胞 周 期 の 分 画. 結 1.. Rho. 果. 123の 処 理 濃 度,処 理 時 間 と細 胞 内 蛍 光. wild EATCを. 使 用 し, Rho. 123の 処 理 時 間 を. 20分 間 と一 定 に し, Rho 123の 処 理 濃 度 を0〜50. ン キ ュ ベ ー タ ー に2. μg/mlま で 変 えて 細 胞 内 に 取 り込 まれ たRho の 蛍 光 量 の 変 化 を 測 定 した(図1).処. 123. 理 濃 度10. μg/ml以 下 で は 処 理 濃 度 に 比 例 して 増 加 したが,. 44.0±0.05℃. 入 れ,. の恒 温水 槽の水 中に入れ行. っ た.. 10μg/ml以 上 で は 曲 線 が 緩 か とな っ た 。次 ぎ に, Rho. 123の 処 理 濃 度 を10μg/mlと 一 定 に して 処 理. 時 間 を変 え て 細 胞 内 取 り込 み 量 を観 察 す る と処 ミ トコ ン ドリア 活 性 及 びDNA量. Rho. 123. 生 薬)は. (Sigma. Chemical. iodide(以. Co.)はphosphate 1mg/mlの. 下PI, buffer. 理 時 間10分 ま で は 急 激 に 増 加 し た が, 20分 以 上. の 測定. Co.),. 蒸 留 水 に て1mg/mlの. propidium. CP(化. 研. 濃 度 の 溶 解 液 を, Sigma sa1ine. (PBS)に. EATCは. そ の ま ま,マ. て. 123処 理 直 後, wild. ウ スL‑5細. 胞, HeLa. よ る 洗 浄 処 理 を加 え た 後, FCMに. 測 定 し た. PI染 色 は,温 熱 処 理 後70%ア. っ て, Rho. が で き る.以 後 の 実 験 で は, Rho 度10μg/ml,処 2.. て. ル コー. wild EATC, ‑5細. HeLa. S3細. 胞 及 び マ ウ スL. 胞 の 体 積 と ミ トコ ン ドリア 活 性 の 比 較. FCMのscatterか Rho. 123の 処 理 は 濃. 理 時 間20分 と し た.. ら平 均 細 胞 体積 を求 め,. 123の 取 り込 み 量か ら ミ トコン ド リア活 性 を. 測 定 し た.表1に. 示 す 如 く細 胞 容 積 はHeLa. ル 固 定 し, 48時 間 以 上 保 存 し た もの を 脱 ア ル コ ールし , RNase処 理 し, PBSに よ り洗 浄 後,. 3細 胞 が もっ と も大 き く,マ ウ スL‑5細. 50μg/mlのPDに. 表1. FCMに. て 染 色 し細 胞 内DNA量. を. 酸 素 消 費. 細 胞 の 呼 吸 に 伴 う酸 素 消 費 量 は オ キ シ メー タ ‑に て 測 定 した .反 応 液 量 は2m1で 細 胞 数 は 約 測 定 し,酸 素 港 費 量 と して106細 胞 当. りのμmoles 10μg/mlと. O2で した.. 表 した. ADRの. 最終 濃度 は. S. 胞, wild. 細 胞 の 種 類 に よ る細 胞 容 積 及 び ミ トコ ン ド リ ア 活性 の 比較. て 測 定 し た.. 4×106で. 123. の 処 理 濃 度 と時 間 を一 定 に す る こ とに よ り,同. S. 3細 胞 で は トリプ シ ン処 理 に よ り浮 遊 細 胞 とし, 冷PBSに. で は プ ラ トー とな っ た(図2).従. 一 細 胞 系 ミ トコ ン ドリア 活 性 の 変 動 を知 る こ と. Chemical. 濃 度 の 溶 解 液 を作 成 し適 宜 使 用 した.. 細 胞 内 蛍 光 量 の 測 定 は, Rho. 4.. 上)に. 量 の 関係. 清 を含 むfresh medium. 温熱処 理 は試験 管に 細胞 包(106/5ml)を. 3.. 光530nm以. られ た ヒ ス トグ ラム を積 分 し,そ. 100μg/mlス. 温 熱 処 理. 43.0,. 起. びFACS. を 算 出 し た.. 時 間 入 れ た 後 実 験 に 使 用 し た. 2.. 753(励. 上),及. 起 波 長488nm,蛍. 100. ン キ ュ べ ー ター に て48. CO2イ. 光530nm以. の 積 分 値 を測 定 した 細 胞 数 で 割 っ て 求 め た 平 均. 使 用 した.対 数 増 殖 中 の 各 々 の 細 胞 数 を106/5ml と して37℃,. 123の 細 胞 内蛍 光 量 はEPICS. 波 長488nm,蛍. 細 胞 蛍 光 量 か ら比 較 検 討 し た.細. 存 在 下 で 増 殖 す る細 胞. 性 細 胞 と した12).培 養 液 は. modified. unit/mlペ. 佐藤. 性細 胞 で. 胞 及 び マ ウ スL‑5細. 養 で あ る. ADR耐. 崎. 1). scatterに. 2). 平 均 細 胞 蛍 光 強 度 を 示 す.. よ りvolumeを. 求 め た..
(3) 耐 性 細 胞 の ミ ト コ ン ドりア 活 性 の変 動. 図1. Ehrlich腹. 水 癌 細 胞 に お け るRhodamine. 781. 123. の 処理 濃度 と細 胞 内蛍 光 量 との関係 反 応 は37℃. で 行 っ た. 図2. Ehrlich腹. 水 癌 細 胞 に お け るRhodamine. 123. の 処 理 時 間 と 細 胞 内 蛍 光 量 との 関 係 反 応 は37℃. 3.. で 行 っ た,. wild EATC及 Rho. wild. びADR耐. EATCで. るが, ADR耐. は 多量 の 取 り込 み が 認 め ら れ 性 細 胞 で は 取 り込 み 量 が 非 常 に少. な か っ た(図3).ま 性 細 胞 ほ どRho CP. ADR耐. 性 細 胞 のRho. 123の 取 り込 み とCP. EATC,. 0.2μg,. 0.5μg,. は 各 々 の 濃 度 のADRを ADR耐 でRho. 123の 取 り込 み 量 が 少 な か っ た. 処 理 す る とRho. EATCで. は 約20%増. 123. 2.0μg. 含 む培地 で増 殖 す る. 性 細 胞 を 示 す. CPの. 加 え た. Rho. 1.0μg,. (10μg/ml)添. 濃 産 は10μg/ml 加 前20分. に培 地 は こ. 123の 反 店 時 間 は20分 間 で あ る.. 123の 取 り込 加 した.し. か. し な が ら,耐 性 細 胞 で は 取 り込 み 量 が 著 明 に 増 加 し た. 2.0μg/ml ADR耐. の効 果 wild. た,耐 性 度 の 高 いADR耐. (10μg/ml)で. み 量 がwild 図3. 性 細胞 におけ る. 123の 取 り込 み 量. 性 細 胞 で は 約3倍. の. Rho 123の 取 り込 み 量 の 増 加 が 認 め られ た. 一方 , Rho 123の 取 り込 み に対 す るCPの. 濃. 度 効 果 を観 察 し た. CPの 上 で はRho. 処 理 濃 度 が10μg/ml以. 123の 細 胞 内取 り込 み 量 が プ ラ トー. と な っ た(図4). EATCは. ほ ぼ 同 じで あ っ た.ミ. 性 はHeLa. S3細. ウ スL‑5細. 胞, wild EATCの. トコ ン ド リア 活. 胞 が も っ と も高 く,次 い で マ 順 で あ っ た.. 4.. wild EATC及. wild EATCとADR耐. びADR耐. 性 細 胞 の呼 吸. 性 細 胞 に お け る37.0℃. で の 酸 素 梢 費 を 測 定 した,内 発 呼 吸 で はwild EATCは2.57μmoles. O2/min/106. cellsで あ っ.
(4) 782. 図4. 岡. ADR耐. 性 細 胞(1.0μg/ml)のRho. り込 み に 対 す るCPの. 崎. 図5. 123(10μg/ml)添. 前20分 に 壇 地 に 加 え た.反. 夫. 123の 取. 濃 度 効果. 各 種 濃 度 のCPはRho. 良. 温 熱 処 理 中(43℃)の. ミ トコン ドリア活 性 の. 変動. 加. ○ wild. 応 時 間 は20分 間 で. EATC. ● ADR耐. あ る.. 性 細 胞(1.0μg/ml). 各 時 間43℃ 温 熱 処 理 後CP(10μg/ml)に 分 間 前 処 理 しRho 表2. wild. EATCとADR耐. 性 細 胞の酸 素 消 費制. 酸 素 消 費 量 は(μmoles. O2)で. 123(10μg/ml)添. て10 加 し,. 37℃ で20分 間 処 理 し た.. 示 す.. 5. a.. 温 熱 処 理 に 伴 う ミ トコ ン ド リア 活 性 の 変 化 wild. EATC及. びADR耐. 性 細 胞(1. .0μg/. ml)に お け る温 熱 処 理 中 の ミ トコ ン ドリア 活 性 の変化 43.0,. 44.0℃ の 温 熱 処 理 に お け る ミ トコ ン ド. リア 活 性 の 変 動 を観 察 した. Rho 制 す る ためwild 応 液 にCP た が, ADR耐. 性 細 胞(1.0μg/ml)は3.73,. 耐 性 細 胞(5.0μg/ml)は5.25, (10.0μg/ml)で mlのADRを. は4.69で あ っ た.ま. 加 え る と,ADR耐. 素 消 費 量 が 増 加 した.そ 素 消 費 量 とADR添. ADR耐. の 上,内. ADR 性細胞. た, 10μg/. 性 細胞 では酸 発 呼吸 時の酸. 加時 の酸素 消 費量の 比は耐. 性 度 の 高 い 細 胞 は 大 き くな っ た(表2).. EATC,. ADR耐. 123の 排 泄 を抑 性 細胞共 に 反. (10μg/ml)を 加 え た. 43.0℃,. 分 間 の 処 理 で はwild. EATC及. びADR耐. 0〜120 性細. 胞 と もに ミ トコ ン ド リア 活 性 の低 下 は 認 め ら れ な か っ た(図5).し は 処 理60〜90分 認 め られ,そ b.. か しな が ら, 44.0℃ 処 理 で. で ミ ト コ ン ドリア 活 性 の 低 下 が. の 後 活 性 が上 昇 した(図6).. wild EATCに. お け る温 熱 処 理 後 の ミ トコ シ. ドリア 活 性 の 変 化 43.0℃,. 60分 の 温 熱 処 理 後 の ミ トコ ン ド リア.
(5) 耐 性 細 胞 の ミ トコ ン ド りア 活 性 の 変 動. Incubation Time (min). 図6. 温 熱 処 理 牛(44℃)の. 783. Hours. ミ ト コ ン ド リア 活 性 の. 図7. 温 熱 処 理(43℃,. 変動. after Hyperthermia 60min)に. よ るEhrlich腹. 水 癌 細 胞 の ミ トコ ン ド リア 活 性 の 変 動. ○ wild. EATC. ● ADR耐. 性 細 胞(1.0μg/ml). 各 時 間44G温. 熱 処 理 後CP(10μg/ml)に. 分 間 前 処 理 しRho. 123. (10μg/ml)添. て10. 考. 察. 加 し,. 37℃ で20分 間 処 理 し た.. ミ トコ ン ドリア は ヱ ネ ル ギ ー(ATP)を す る細 胞 内 小 器 官 で あ る.即 ち, ATPを. 活 性 の 変 動 を 観 察 し た.温 熱 処 理 に よ り ミ トコ ン ド リア 活 性 は,処 が,処. 理9時. 間後 では変 わ らな い. 理12時 間 後 で 急 激 に 増 加 し,処 理18時 間. 後 で は 約2倍. に な っ た,そ. の 後 急 激 に低 下 し処. る た め に,ミ. トコ ン ド りア 内 膜 に お い て エ ネ ル. ギ ー 転 移 の た め 電 子 伝 達 が お こ る.こ の 電 子 伝 達 系 は,フ ク質,助. ラ ビ ン タ ン パ ク 質,非 ヘ ム 鉄 タ ンパ. 酵 素Q,チ. トク ロ ー ム な ど を 中心 とす. 理24時 間 後 に は 対 照 値 に 回 復 し た(図7).. る 酸 化 還 元 系 で,こ. 6.. 終 的 に は 酸 素 と結 び つ く.一 方, Rho. wild. EATCに. お け る温 熱 処 理 に伴 う細 胞. 用期 の 変 動 wild. 産生 合成 す. の 中 を 電 子 が 運 搬 さ れ,最 123は,脂. 肪 親 和 性 で 賜 性 に 荷 電 し た 蛍 光 色 素 で あ り,ミ. EATCで43℃,. 60分 の 温 熱 処 理 を行 っ. トコ ン ド りア 膜 に 形 成 され た 酸 化 還 元 系 の 電 気. た 後 細 胞 周 期 の 変 動 を観 察 した. G1期 細 胞 は 処. 化 学 的 ポ テ ン シ ャ ル差 に よ って ミ トコ ン ド リア. 理 後12時 間 ま で は ほ とん ど変 わ ら な い が そ の 後. は こ特 異 的 に 取 り込 ま れ る と考 え られ て い る9).従. 24時 間 ま で減 少 し,処 理 後36時 間 に は 処 理 前 の. っ て, Rho. 状 態 に 回 復 す る. S期 細 胞 は 処 理 後3時. に 染 色 す る こ とが で き, FCMを. 時 的 に 増 加 す る が6時 G2+M期. 間 に一. 間 後 に は 減 少 す る.一 方,. 細 胞 は 処 理24時 間 後 ま で漸 増 し, 36時. 間 後 に は 減 少 した(図8).. 123は 細 胞 内 ミ トコ ン ドリア を精 異 的 応 用 す るこ とに. よ り細 胞 の ミ トコ ン ド リア 活 性(エ 態)を. ネ ル ギー 状. 知 る こ とが 可 能 と思 わ れ る10,11).. 若 者 が 観 察 し た3種 類 の 細 胞 で はRho. 123の. 取 り込 み 量 に 差 が 観 察 さ れ る こ とか ら,そ れ ぞ.
(6) 784. 岡. 崎. 良. 夫. ン ドリア 活 性 が 高 い とい う予 測 に しか し,井 上15)がADR耐. 見 矛 盾 す る,. 性 細 胞で は耐性度 の. 高 い 細 胞 ほ ど細 胞 内ADRの. 取 り込 み 量 が 少 な. い と報 告 して お り,当 教 室 で 樹 立 し たADR耐 性 細 胞 はADRだ. け で な くRho. 123に 対 し て も. 排 泄 機 構 が あ る と考 え られ,こ. れ に よ り前 述 の. 矛 盾 の 説 明 が つ く と思 わ れ る.そ こで, ADRの 細 胞 外 へ の排 泄 を抑 制 す るCP16‑18)を. 使 用 し,. Rho. 効 果 を観. 123の 取 り込 み 量 に 対 す るCPの. 察 して み る と,図3に. 示 す よ うに, CPに. 泄 が 抑 制 さ れ 細 胞 内 へ のRho. よ り排. 123の 取 り込 み 量. が 増 強 さ れ る と い う新 し い事 象 が 判 明 した.ま た,耐. 性 度 の 高 い 細 胞 ほ どRho. 123の 細 胞 内へ. の 取 り込 み 量 が 増 加 して い た.即. ち,耐 性 度 の. 高 い細 胞 ほ ど細 胞 内 ミ トコ ン ド リア 活 性 は 高 い と思 わ れ る.こ. の こ と は,耐 性 細 胞 に 存 在 す る. ポ ン プ 作 用 を 持 つPGは,代. 謝 産 物,化. 学 物質. を細 胞 外 に排 泄 す る機 能 が あ り,そ の 上, PGは 制 癌 剤 に 対 す る選 択 断 が 低 い た め にADRだ. け. で な く 多 くの 制 癌 剤 に 対 し て も同 じ よ うに 排 泄 図8. 温 熱 処理(43℃,. 60min)後. のEhrlich腹. 水. 癌 細 胞 の細 胞 周期 の変動 ○ G1期 分 画 細 胞 ● S期 分 画細 胞 △ G2+M期 分 画細 胞. し,多 剤 耐 性 を示 す よ うに なる と考 え られ る1‑6,19). 一方 ,ミ トコ ン ド リア 活 性 が 高 い こ と は,耐 性 細 胞 が よ り多 くの 酸 素 消 費(呼. で はwild. EATCに. 2)こ. とか ら,前 述 のRho. こ とが 考 え ら れ る.ま. た.ま. た,培 地 にADRを. た,同 一 細 胞 で は,同 一. 応Rho. 123濃 度,反. で 染 色 す る こ と に よ り,ミ. 応 温 度). トコ ン ド リア 活 性 の. ADR耐. 性細 胞 包は,耐 性 獲 得 前 の 細 胞 と比 較 し. て, PGを. は じめ 特 殊 タ ンパ ク質 の 合 成 が 盛 ん に た,細 胞 外 か ら 流 入 す るADRを. 胞 外 に 排 泄 す る12,15)た め に 多BのATPが. 細 梢費. され て い る と推 察 さ れ る.こ の こ とか ら,著 者 はADR耐. 性 細 胞 の ミ トコ ン ド リア 活 性 はwild. EATCよ. り高 い と考 え, ADR耐. EATCのRho み た.図3に EATCと. 性 細 胞 とwild. 123の 取 り込 み 量 の 比 較 を行 って 示 す よ うにADR耐 比 較 してRho. 性 細 胞 で はwild. 123の 取 り込 み 量 は 少 な. く,ま た 耐 性 度 の 高 い 細 胞 ほ どRho. 123の 取 り. 123の 結 果 と一 致 し 添 加 す る と酸 素 消 費. が 増 加 す るこ とか ら,耐 性 細 胞 で はADRが 液 に 存 在 す る とPGの ATPの. 変 動 を 観 察 す る こ とが 可 能 と思 わ れ る.. 行 わ れ,ま. して い る. 比 較 して 内発 呼 吸 が 高 い(表. れ の 細 胞 で ミ トコ ン ド リア 活 性 が 異 な っ で い る. 条 件(反 応 時 間,反. 吸)を. と推 察 さ れ,酸 素 消 費 を 測 定 す る と,.耐 性 細 胞. 外. ポ ンプ 作 期 が 盛 ん に な り,. 消 費 が盛 ん に な る ため ミ トコン ドリア の. 活 性 が 高 ま る と思 わ れ る.従. って こ のADR耐. 性 細 胞 の 各 種 薬 剤 添 加 に 対 す る酸 素 消 費 を測 定 す る こ とに よ り薬 剤 選 択 性 を識 別 で き る可 能 性 が あ る. 温 熱 処 理 に よ り,ミ. トコ ン ド リア は 膨 化 な ど. の 形 態 変 化 を認 め,ま. た ミ トコ ン ド リア の 細 胞. 内 局 在 が 移 動 す る こ とが 報 告 され て い る20,21).ま た,温 熱 処 理 とRho. 123の 取 り込 み 量 の 変 動 に. 間 す る報 告 も あ る21,22). 43℃, 44℃ で120分 処 理 す る と コ ロユ ー 形 成 能 か ら観 察 す る とほ と ん ど の 細 胞 が 死 亡 す る12).しか しな が ら,ミ トコ ン ド. 込 み 量 が 少 な い こ とが 観 察 され た.こ の 結 果 は,. リア 活 性 は そ れ ほ ど大 き な変 動 は 観 察 され な い.. ADR耐. 従 って,温. 性 細 胞 の 方 がwild. EATCよ. り ミ トコ. 熱 に よ る細 胞 の 生 死 と ミ トコ ン ド り.
(7) 耐 性 細 胞 の ミ トコ ン ド リア 活 性 の 変 動 ア 活 性 と直 接 的 な 関 係 は な い と考 え ら れ る.し か し な が ら, wild. EATCに43℃,. 2.. 60分 の 温 熱. Rho. 処 理 を行 う と処 理18時 間 後 に ミ トコ ン ド リア 活 性 の 著 明 な上 昇 が 認 め ら れ た,こ 原 因 を 明 ら か にす る た め,そ 変 動 を 測 定 し た.温. 熱 処 理 後S期,. G1期. が 減 少 し, G2+M期. の 漸 増 が 認 め ち れ る が ,処. こ の よ うに,濃. 熱 に よ り惹 起 され るG2ブ. CPはADR耐. 性 細 胞 のRho. ロッ. ADR耐. 性 細 胞 の 酸 素 消 費(呼. EATCに. とか ら,. 123の 取 り込 み 量 の 増. ト コ ン ド リア のmembrane. potential. 吸)はwild. 比 較 して 多 か っ た. ADRが. 中 に 存 在 す る とADR耐. 加 は,ミ. 123の 取 り込. 処 理 濃 度 は10 .0. μg/mlで ほ ぼ 完 全 に 排 泄 機 能 を抑 制 した. 4.. は 増 加 し た が, wild. 間 後 のRho. 123の 取 り込 み. み 量 を増 強 させ た. CPの. 下 が ほ ぼ 一 致 して い る(図7, 処 理12〜24時. 比 較 し,. 123の 取 り込 み 量 は 少 な く,そ の程 度 は. クが 解 除 さ れ る時 間 と ミ トコ ン ドリア 活 性 の 低 8)こ. EATGに. 量は少 なか った 3.. 細胞. 理36時 間 後 に は処 理 前 の 状 態 に 回 復 し て い た.. 性 細 胞 で はwild. 耐 性度 が 高 い 細 胞 ほ どRho. の活性 上昇 の. の間 の細胞 周期 の. ADR耐. 785. 培地. 性細 胞の酸素 消 費 EATCで. は変 わ らな. か っ た. 5.. ADRI耐. 性 細 胞(1.0μg/ml),. wild. EATC. の 亢 進 と考 え る よ り も,温 熱 処 理 に よ りG2ブ. に対 して43.0℃ 加 温 で は,両 細 胞 共Rho. 123. ロ ッ ク が 起 こ り, G2+M期. の取 り込 み 量 は ほ とん ど変 わ らないが44. .0℃. 細 胞 の 蓄 積23)が 生. じ るが,処. 理24時 間 後 にG2ブ. ロ ッ ク24,25)が 解. 加 温 で は,両 細 胞 共60,. 除 され,細. 胞 がG2期. G1期 へ 移 行 し,. の 取 り込 み 量 が 減 少 した .. 細 胞 質 が2分. か らM,. され,そ. の 結 果 と して ミ ト コン ド. 6.. wild. EATCに. 90分 に はRho. 対 し, 43.0℃,. 60分 間 加 温.. リア 活 性 が 減 少 し た 可 能 性 が 高 い よ うに 思 わ れ. す る と処 理 後18時 間 で 著 し くRho. る.こ の 点 に つ い て は今 後 よ り詳 細 に検 討 す る. り込 み 量 が 増 加 し た.. こ とが 必 要 と思 わ れ る. 論. 当 教 室 で 樹 立 し たEhrlich腹 (ADR)耐. EATC)な. 水癌細胞の. 性 細 胞 と そ の 親 株(wild. ど を硬 用 し て,フ. ー(FCM)に. てRhodamine. 効 果,酸. を し, Rho. 123の 取 り込 み に 対 す るCPの. をFCMで. 測 定 す る こ とに よ り臨 床 標 本 の 薬 剤. 効果. 耐 性 度 の 判 定 に 応 用 で き る可 能 姓 が あ る こ とが 示 唆 され た.. ロー サ イ トメ ト リ (Rho. 123)の. 細. 胞 内 取 り込 み 量 及 びそ れに 対す るCepharanthine (CP)の. 123の 取. 以 上 よ り,薬 剤 耐 性 機 構 に つ い て 若 干 の考 察. 結. Adriamycin. 123. 素 消 費 を測 定 し た.ま. 稿 を終 え るに あ た り,御 指 導,御 校 閲賜 りま した 平 木祥 夫教 授 に 深甚 なる謝 意 を表 わ します.終 始研. た,温. 究 の御 指 導 をい ただ いた 岡山 大学 医療 技 術 短期 大学. 熱 処 理 に 伴 う細 胞 内 ミ トコ ン ド リア 活 性, DNA. 部 川崎 祥 二教 授 に深 謝 い た します.ま た快 く勧協 力. ヒス トグ ラ ム の 変 動 か ら細 胞 の 生 理 学 的 状 態 に. 下 さ い ま した教 室員 諸 兄の 方 々 に心か ら感 謝の 意 を. つ い て 検 討 し た.. 表 します.. 1.. Rho. 123の 細 胞 内 取 り込 み 量 をHeLa. 細 胞,マ. ウ スL‑5細. 胞, wild EATCで. S3 観. 察 し,各 々 の 細 胞 で 細 胞 内 取 り込 み 量 は 異. 本 研 究 の一 部 は第6回 日本 ハ イパー サー ミア学 会 (平成 元年11月,東 京),平 成 元年 産文 部 省科学 研 究 費が ん特 別 研 究I. (加納 班)に お いて発 表 した.. な っ て い た.. 文 1) Turuo T: Mechanisms of multidrug resistance (Gann)(1988). and implications. for therapy.. Jpn j Cancer Res. 鈴 木 日出 夫:抗. 3). 鶴尾. 79, 285-296.. 2). 隆;癌. 献. 癌 剤 の 耐 性 と そ の 克 服 を め ざ し て,蛋 の 多 剤 耐 性 とそ の 克 服.癌. と化 療(1988). ・核 ・酵(1988) 15,. 2848‑2857.. 33,. 94‑100. ..
(8) 786. 岡. 崎. 良. 夫. 4) Thiebaut F, Turuo T, Hamada H, Gottesman. MM, Pastan I , Willingham: Cellular location of the gene product P-glycoprotein in normal human tissues. Proc Natl Acad Sci USA. multidrug-resistance. (1987) 84, 7735-7738. 5) Gerlach HJ, Endicott JA, Juranka. PF, Henderson G, Sarangi F, Ling KL: Homology between. P-glycoprotein. and a bacterial haemolysin. tance.. (Lond)(1986). Nature. 6) Sugimoto Y, Turuo T: DNA-mediated adriamycin-resistant. transport protein suggests a model for multidrug resis. 324, 485-489. transfer. and cloning a human multidrug-resistant. gene of. myelogenous leukemia K562. Cancer Res (1987) 47, 2620-2625.. 7) Shinohara K, Kugotani M, Ishiwata J, Matsuda T: Early change of adenosine triphosphate L5178Y cells during hyperthermia.. Jpn J Cancer Res (Gann)(1987). 8) Kawasaki S: Effect of whole body X-irradiation Res (1965) 6,. level in. 78, 333-335.. on the swelling of rat liver mitochondria.. J Radiat. 111-121.. 9) Johnson LV, Walsh ML, Chen LB: Localization. of mitochondria. in living cells with rhodamine 123.. Proc Natl Acad Sci USA (1980) 77, 990-994. 10) Johnson LV, Walsh ML, Bockus BJ, Chen LB: Monitoring. of relative mitochondrial. membrane. potential in living cells by fluorescence microscopy. J Cell Biol (1981) 88, 526-535. 11) Benel L, Ronot X, Mounolou JC, Gaudemer F, Adolphe M: Compared flow cytometric analysis of mitochondria. using 10-n-Nonyl Acridine Orange and Rhodamine 123. Bas Appl Histochem. (1989). 33, 71-80. 12). 柏 谷 尚 子:. Ehrlich腹. 間 山 医 誌(1989). 13) Takahashi. 水 癌 細 胞 の 薬 剤 耐 性 細 胞 に お け る 温 熱 に よ るAdriamycinの. 101,. M: A multichannel. cytometric data. 14). 佐 々 木 功 典,村. 効 果 増 強 と そ の 修 飾.. 315‑325.. method for the analysis of DNA content distribution. using flow. Comput Biomed Res (1981) 14, 506-517.. 上 知 文,高. 橋. 学:. FACSア. ナ ラ イザ ー に ごよ る細 胞 動 態 の 解 析. Med. Immunol. (1985). 10,. 389‑392. 15). 井 上 信 浩:. Ehrlich腹. 水 癌 細 胞 に お け るAdrlamycin耐. 性 と そ の 克 服 に 関 す る 研 究,岡. 山 医 誌(1990). 102,. 679‑690. 16) Watanabe. S: Inhibition of platelet aggregation by cepharanthine. membrane-related. activation. process.. Acta Med Okayama. 17) Sheetz MP, Singer SJ: Biological membranes erythrocyte 18) Nagaoka. interactions. S, Kawasaki. cytotoxicity -1302 .. is accomplished during the early,. (1984) 38, 101-115.. as bilayer couples.. A moleular mechanism of drug. Proc Natl Acad Sci USA (1974) 71, 4457-4461. S, Karino Y, Sakai K, Nakanishi. T: Modification. of cellular efflux and. of adriamycin by biscoclaulin alkaloid in vitro. Eur J Cancer Clin Oncol (1987) 23, 1297. 19) Neyfakh AA, Dmitrevskaya. TV, Serpinskaya AS: The membrane transport system responsible for. multidrug resistance is operating in nonresistant. cells. Exp Cell Res (1988) 178, 513-517.. 20) Welch WJ, Suhan JP: Morphological study of the mammalian stress response: changes in cytoplasmic. organelles, cytoskeleton, and nucleoli, and appearance. filaments in rat fibroblasts after heat-shock treatment. 21). 田川. 泰,石. 川. 啓,古. 川 素 蔵,白. 石 円 樹,佐. 藤 哲 也,渡. 胞 に お け る ミ ト コ ン ドリ ア の 局 在 変 化 とrhodamine. Characterization. of. of intranuclear actin. J Cell Biol (1985) 101, 1198-1211.. 部 誠 一 郎,綾. 123 uptakeの. 部 公 よ し,富. 変 動.医. 田正 雄:加. の あ ゆ み(1987). 温 後 の癌 細 140,. 687‑. 688.. 22) Kim 7H, Kim HS, Alfieri AA: Interaction of hyperthermia. and rhodamine 123 in HeLa S 3 cells in.
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(10) 788. 岡. Study of mitochondrial. 崎. 良. 夫. activity (Rhodamine. 123 uptake) on Ehrlich. ascites tumor cells and its adriamycin resistant. cells. Yoshio OKAZAKI Department of Radiology, Okayama University Medical School, Okayama 700, Japan (Director: Prof. Y. Hiraki) The positivelychargedfluorescentdyeRhodamine123(Rho123) accumulatesin mitochon dria. An adriamycin (ADR)-resistantcellline derivedfrom Ehrlich ascites tumor cells (wild EATC)was establishedin our laboratory. Overallmitochondrialactivity of wild EATCand ADR-resistantEATCwas investigatedby the staining methodwith Rho 123. The uptake of Rho 123into living cellswas analyzedby flow cytometry. The intracellular Rho 123uptake of ADR-resistant EATCwas lower than that of wild EATC. The intracellular Rho 123 uptake of wild EATCincreased when cells were treated with cepharanthine (CP). The intracellular Rho 123uptake of ADR-resistantEATCincreased markedlyby CP treatment. ADR-resistantEATCcosumedmoreendogenousoxygenthan wild EATC. The energy level of ADR-resistant EATCwas discussed..
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