核酸の性質と基本操作
核酸自体に遺伝情報があり，それを使って生命活動を直接制御したり遺伝子産物をつくった りすることができ，またその合成，構造解析，検出が容易にできるなどの理由により，核酸に 関する生命工学は他の分野に比べて格段に進んでおり，生命工学の中心をなしている．
核酸（DNA と RNA）のなかでも DNA は，扱いやすさや，酵素処理や化学合成の容易性といっ た多くの利点により，その利用性はきわめて高い．DNA を細胞から抽出する場合，細胞を壊し，
DNA に結合しているタンパク質を DNA から分離し，DNA を水に溶けた形で抽出してエタノー ルを使って濃縮するという手法が基本となる．DNA は二本鎖構造をとり，塩基対が相補的で あるため，二本鎖形成反応：ハイブリダイゼーションを利用したさまざまな分析技術が可能で ある．さらに合成 DNA であるオリゴヌクレオチドを使うことにより，DNA 合成，PCR，DNA シークエンシングなどが行える．DNA シークエンシングは，ゲノム解析など多くの分野で成 果を上げているが，近年，圧倒的な解析能力をもつ次世代シークエンサーが登場し，DNA 構 造解析に革命的な進歩をもたらしている．DNA の分離や分析には主に電気泳動が使われるが，
これにもさまざまな方法がある．
生体分子の分析などに汎用されるものに，β線やγ線といった放射線を出す（放射能のある）
放射性同位元素（RI）がある．RI は必要以上に被ばくしないように注意して使う必要があるが，
高感度に検出することができるという性質を利用し，物質の反応，生体内での分子の追跡，構 造解析など，多くの局面で用いられる．
3 章
○
○ ＋
－
○ 機器による検出
○ オートラジオグラフィー （写真による）
○ in vitro標識
○ その他の方法
抽出
精製 DNAの調製
DNA
ゲル電気泳動による分離
エチジウムブロマイド による染色・検出
PCRによる増幅
ＤＮＡ量
耐熱性酵素 高温シフト，など
時間
応用
・パルスフィールド
・ゲルシフト
・SSCP
・変性ゲル，など
（クローン化）
GAC T T A
古典的シークエンサー
次世代シークエンサー
DNAシークエンシング
DNA
放射性同位 元素（RI）
32P/β線など DNA
高感度検出 核酸の追跡
RIの利用
■核酸／DNAに関するさまざまな操作，解析法■
3-1 抽出とゲル電気泳動による分離 ･ 検出
3核酸の性質と基本操作
■□
DNA の分離：ゲル電気泳動
DNA を大きさ（長さ）で分離する一般的な 方法はゲル電気泳動である．DNA は負電荷を もつので，電圧をかけると陽極に移動するが，
ゲル（
⇨網目構造をとって内部に多量の水を 含む．ゼリー状物質）中では小さい分子ほど 速く移動するため，DNA を長さで分離できる．
DNA 変性剤を加えれば，一本鎖 DNA としても 分離できる．使用されるゲルはポリアクリルア ミドか寒天に似たアガロースのいずれかで，後 者は長い DNA の分離に適している．ゲル電気 泳動は DNA シークエンス解析，巨大 DNA の 分離，DNA－タンパク質検出，変異解析などと 応用範囲が広い．
■□
DNA の検出
DNA の存在を知る普通の方法は染色である．
DNA 二本鎖に入り込むエチジウムブロマイド
（臭化エチジウム）溶液に電気泳動したゲルを 浸けて紫外線を当て，DNA をオレンジ色に光 らせる．他のアプローチは，検知しやすい物質 をもつヌクレオチドで合成した DNA を使う方 法である．一つは蛍光色素結合ヌクレオチドを 使うもので，レーザー光を当てて光らせる．他 の方法は放射性リンをもつヌクレオチドを使う 方法で，DNA 位置を写真に記録する（3-7）．
■ 図3 DNAはいろいろな方法で検出できる ■ コラム：遠心分離機による核酸の分離 DNA ／ RNA は大きいほど速く沈降するの で，遠心分離法で分離でき，密度の大きな塩化 セシウム溶液を使うと DNA と RNA の分離も できる．エチジウムブロマイドがプラスミド DNA に結合し難く，それが結合した DNA が しないものに比べて塩化セシウム溶液中での 比重が線状 DNA より小さくなることを利用し て，プラスミドを分離・精製することができる．
－ ＋
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
DNA（負［－］に
荷電している） 写真などで記録
ゲル（網目状の分子構造） 紫外線ランプ
エチジウムブロマイド
（臭化エチジウム）
Ｘ線フィルム RIを含む
DNA
（a）染色法
紫外線
（c）放射性同位元素（RI）を使う（リン32の場合）
（b）蛍光色素を使う
エチジウム ブロマイド
色素 他にサイバーグリーン
なども使われる
レーザー光 実際は見えない
ゲル電気泳動
（ネガ）フィルム
感光
現像
オートラジオグラフィー
■ 図2 DNAはゲル電気泳動で分離できる ■
3-1
■□
DNA の抽出・精製
DNA を安定な条件で扱う必要があり，pH は 中性〜微アルカリ性に合わせる．高温になると 変性し，100℃近くになるとリン酸ジエステル 結合が部分的に切れて断片化する．生物のか かわる環境で DNA を分解する主な原因は DNA 分解酵素（DNase）なので，DNA を扱う場合 には必ず DNase 阻害剤を加える．DNase はマ グネシウムイオンなどの二価金属イオンを活性 発揮に必要とするため，操作を通して金属イ オンと結合するキレート試薬（例：EDTA，クエン 酸）を加える．
細胞内には大量のタンパク質があり，DNA にもタンパク質が結合しているので，DNA 抽
出は DNA をタンパク質と分けることがポイン トとなる．まずフェノールなどのタンパク質変 性剤を加えて細胞を壊し，その後遠心分離する．
フェノールが水より重いため，抽出 DNA は上 部の水層に集まり，変性タンパク質はその下に くる．抽出したばかりの DNA 溶液にはまだ雑 多な物質が混ざっており，DNA を精製する必 要があるが，一般的な方法はエタノールを加え て DNA を沈殿させることである（エタノール 沈殿）．遠心分離によって DNA を沈殿として 集め，それを溶かすことにより濃い精製 DNA 溶液が得られる．低分子物質や脂質などはこの 操作で除かれる（多糖類が入る場合があるが，
他の方法で除ける）．
細胞から DNA を抽出する場合はタンパク質を変性させ，遠心分離によって DNA と分け，
エタノール沈殿によって精製・濃縮する．DNA を分離する一般的方法にゲル電気泳動があり，
DNA 検出法にはエチジウムブロマイドによる染色法や，各種の標識法がある．
抽出とゲル電気泳動による分離 ･ 検出
細胞や組織
上清を回収 繊維状のDNA沈殿を
巻き取る＊2 溶解
精製DNA
ガラス棒 振とうする 細胞を壊す
DNA 遠心分離
安定化剤 タンパク質
変性剤
バッファー エタノール
を加える
水層（DNAを含む）
変性タンパク質 フェノール SDS＊1
フェノール
■ 図1 生物材料からDNAを抽出する方法 ■
◆ 巨大 DNA を分離する
ゲル電気泳動では DNA が 20kb 以上になると DNA が進行方向に線状に並び，ゲル篩ふるい効果が働か なくなるために長さによる分離ができない．これを 克服するパルスフィールドゲル電気泳動では，電 圧を 90 度で変えながら短時間，周期的にかける．
DNA がジグザグに進むためにゲル分子の篩効果が 発揮され，巨大 DNA も分離することができる．
◆ タンパク質の付いた DNA を分離する
核酸は強く負に荷電しており，タンパク質が結合 しても陽極に移動するが，分子形態が大きくなった 分だけ移動が遅くなる．この原理を利用して DNA 結合タンパク質を検出できる（ゲルシフト解析）．
タンパク質のもつ固有の電荷で遅延の程度が変化す るため，結合タンパク質の検討もできる．
◆ わずかな配列の違いの有無で分離する
熱で変性した DNA を急冷などによって急激にア ニールさせると，DNA は安定なランダムコイル状 になって折り畳まれるが，突然変異があると少し異 なる立体構造をとるので，その違いをゲル電気泳動 で検出できる．この方法で変異や多様性を検出する 方法を SSCP（単鎖構造多型）解析という．この原 理で DNA 相補鎖の分離もできる．
◆ 変性ゲルは塩基数に応じて 1 本を分離できる 尿素のような変性剤をゲルに入れると核酸を一本 鎖で電気泳動できる．RI などの標識物質を使って 核酸を合成したものをこの方法で分離・検出すれ ば，標識をもった鎖のみが長さに応じて検出され，
DNA 配列解析や RNA 構造解析などに応用される．
特別な目的のための核酸の電気泳動
3 章発展
さまざまなゲル電気泳動法により，巨大 DNA やタンパク質結合 DNA，そして変異をもつ DNA を分離することができ，変性条件にすると塩基配列解析などの構造解析も可能である．
－ －
＋ ＋
＋ ＋
A
B a）パルスフィールド電気泳動
巨大DNA
b）ゲルシフト解析 タンパク質
DNA＋
タンパク質
c）変性ゲル電気泳動 標識
検出できる 核酸
尿素入りゲル AとBを交互にかける
DNA
■ 図 さまざまに工夫されたゲル電気泳動 ■
2-12 生体分子の網羅的解析
2[生命工学の基礎
2]
：遺伝子と遺伝情報
2-1 関係を解き明かす，比較ゲノミックスという領
域でも力を発揮する．機能ゲノミックスとは DNA を遺伝子として解析することで，DNA 配 列に意味をもたせることを目的としている．遺 伝子の発現パターンなどからその機能を知ろう とするもので，実施する内容はトランスクリ プトミックスとあまり違わない．このバリエー ションであるケミカルゲノミックスは，細胞に 与えた化学物質によって発現が変化する遺伝子 を同定する戦略である．
■□
網羅的な解析手法
生体分子の網羅的解析には個々の試料を一つ ずつ解析するやり方がある．たとえばゲノミッ クスではすべての DNA 断片をとにかく解析す る（⇨ その後，パソコン上でデータをつなげ る）．mRNA 解析では調製した cDNA を一つ一 つシークエンスし，タンパク質解析ではそれぞ れを分離後に一つずつ分析する．もう一つのや
り方に，ハイスループット法（⇨ 多数に通し，
付けるという意味）といい，結合性を利用する 方法がある．ガラスなどの基板に同定済み分子 を多数付け，そこに対象となる物質を反応させ，
結合したものの位置から，結合物質を決定でき る．核酸であればハイブリダイゼーションに よって DNA や RNA を同定でき（⇨ 基板に付 ける方をプローブという），核酸，タンパク質，
その他の分子と相手の分子との結合性解析にも 利用できる．小さな基板（チップ）を使うので チップ技術，あるいは縦横多数の列に付けるの でアレイ解析ともいわれる．
コラム：メタゲノム解析
ゲノミックスはある特定の生物を材料とする が，自然環境の中に棲んでいる微生物の中には 培養できない未同定のものも多数存在する．こ のような集団内の生物種を分離しないで，一つ のまとまりととらえてゲノム解析を行う場合が あり，メタゲノム解析といわれる．
■ 図 3 メタゲノム解析 ■
■ 図 2 網羅的に解析する ■
環境 微生物
の集団の 混合物
DNA
抽出 DNAシーク エンシング
ある環境に おけるDNA プロファイリング
（a）個別に解析する
試料 分
離
個別解析 試料
標識
D反応性物質
（b）ハイスループット解析
流す
基板
既知物質
（＝>プローブ） 検出
試料中に”D”関連物質があることがわかる
A B C D E F
■□
オーム（-ome）とオミックス（-omics）
すでに述べたように染色体全 DNA の配列を ゲノムというが，その分析はゲノミックスとい う．これにならい，細胞の全 RNA はトランス クリプトーム，その解析をトランスクリプト ミックス，さらに全タンパク質はプロテオー ム，その解析をプロテオミックスという．オー ムとオミックスの用語はより広い意味でも使わ れる．物質同士の相互作用（例：タンパク質同士）
はインタラクトーム，代謝産物の総体はメタボ ロームというが，後者の解析のメタボロミック スでは，液体クロマトグラフィー，ガスクロマ トグラフィーなどの分離 ･ 分析機器が用いられ
る．細胞内情報（シグナル）伝達を扱うシグナ ロミックスでは情報伝達物質に特異的な阻害剤 が使用される．
■□
ゲノミックス
ゲノミックスは DNA シークエンサーを使っ て行われ，近年利用頻度が高くなっている次世 代シークエンサーは解析の速度を大幅に速めて いる．ゲノミックスは生物ゲノムの配列情報を 得るという単純な目的以外に，突然変異や病気 の原因遺伝子を同定する目的でも使われ，ヒト における多型解析や個人識別にも使われる．ま た，複数のゲノム情報の比較から，進化 ･ 系統
細胞内の分子やその動態の全体，あるいは総体をオーム，その解析をオミックスという．オ ミックスには DNA，RNA，タンパク質，糖などの一群を対象とするもののほか，分子相互作 用や生体反応，代謝を扱うものまであり，解析にはそれぞれ独特の手法が用いられる．2-12
生体分子の網羅的解析
■ 図 1 代表的なオミックスの例 ■
ゲノミックス
ゲノム，DNA（DNAシークエンシング）
メタゲノミックス
メタゲノム，集団（バイオーム）の DNA解折
インタラクトミックス 多くの物質の相互作用
グライコミックス
ケミカルゲノミックス 化学物質→RNA
オミックス
（-omics)
メタボロミックス 糖，脂質などの代謝過程
（各種クロマトグラフィー，MS解析）
トランスクリプトミックス
RNA（→cDNA・シークエンシング）
機能ゲノミックス RNA
シグナロミックス シグナル伝達物質（阻害剤など）
プロテオミックス
タンパク質（2D電気泳動，MS解析）
10-4 バイオセンサー：物質測定への応用
10･生命反応や生物素材を利用模倣する
サーには電極（陽電荷，陰電荷が集まる二つの
極からなる），光学センサー，圧電センサーな どがあるが，主には電極が使われる．電極は種々 あるが，酵素反応の場合，酸化酵素は酸素を消 費して過酸化水素を生成するので酸素電極が使 われる．酵素の活性中心はタンパク質に包まれ て電極との直接の電子授受はできないので，酵 素の補酵素との間で電子授受を行うに適当な物 質（メディエーター）を加えて測定する．
■□
実用化バイオセンサー
（1）最も成功しているものはグルコースセン サーである．固定化されたグルコースオキシ ダーゼにメディエーターとグルコースを加える と，前述の原理によって濃度を測定できる．酵 素が安定でメディエーターの電子授受が比較的 低い電位で起こり，溶存酸素濃度に影響されに くいために使いやすく，携帯血糖値測定器とし て広く普及している．相当する原理は，他の多 くの生体分子の測定に使われる．
（2）抗原抗体反応を利用するイムノセンサー
では，センサーチップに抗体を結合させておき，
抗原の結合は光を使う方法（例：プラズモン共 鳴法）などで検出する．このような光学的検出 法は研究機器では広く利用されている．
（3）水質汚染度合いの目安に BOD（生物化 学的酸素要求量）があるが，この測定の識別素 子には微生物がそのまま使われる．BOD セン サーに有機物を入れるとこれを微生物が利用 し，酸素を消費するので，酸素電極で測定できる．
■□
研究領域での応用
左記の（2）は，発展型としてタンパク質同 士，あるいは DNA とタンパク質の結合の測定 でも使われる．核酸を蛍光プローブハイブリダ イゼーションで検出することは DNA センサー といえ，酸化還元酵素を分光光度計で測定した り，ルシフェラーゼ活性を光量計で測定するこ とも，酵素が識別部，基質が測定物質，検出機 器がトランスデューサーと見ることができる．こ のように，医学研究やバイオ研究での測定は広 い意味でバイオセンサーを使って行われている．
Mred：還元型メディエーター Mox ：酸化型メディエーター グルコース
グルコノ ラクトン
FAD FADH2
2×Mred
電子 2×Mox
電極
グルコースオキシダーゼ O2
H2O2
屈折率が変化 抗体
レーザー 検出器 センサー 抗原
チップ
酸素電極
酸素
好気性微生物 A
有機物 A
BOD量増加
■ 図 3 グルコース濃度測定用バイオセンサー ■
■ 図 4 表面プラズモン共鳴によるタンパク質（抗原）の測定 ■
■ 図 5 BOD センサー ■
■□
バイオセンサーとは
生体分子の特異的な認識 ･ 反応機構を使い，
そこで生ずる生成物を電気信号に変えて目的物 質の検出・定量を行うものをバイオセンサーと いう．バイオエレクトロニクスの一つで，一般 のセンサーに比べて夾雑物の影響が少ない．
■□
バイオセンサーの構成要素と特徴 センサーは化学物質の識別部とそれを情報
（⇨ 電気信号）に変える変換部（⇨ トランス デューサー）からなる．バイオセンサーの識別
部には酵素，抗体や抗原，結合タンパク質や受 容体，微生物などが使われる．トランスデュー
生体分子や生物を介して目的物質の量を測定する器具をバイオセンサーといい，物質の識別 部には酵素などが，識別量を電気信号に変えるトランスデューサーには電極などが使われる．血糖量を計る携帯用グルコース測定器はこの原理を利用した代表的なものである．
バイオセンサー：物質測定への応用
10-4
<識別素子>
酵素，抗体／抗原，結合タンパク質 細胞，微生物，その他
<トランスデューサー>
電極［酵素，H2O2，pH，その他］，サーミスタ，光ファイバー，
表面プラズモン共鳴，分光光度計，フォトカウンター 測定対象
物質
トランスデューサー
識別素子 電気信号
化学情報 ―（物理情報）→ 電子シグナル
センサーの種類 識別素子 トランスデューサー 酵素電極
電流計 電圧計
ほとんど酸化酵素 ほとんど加水分解酵素
酸素電極 イオン選択制電極 酵素 FET（電界効果
トランジスター）
ほとんど加水分解酵素 電界効果トランジスター 微生物センサー 微生物 酸素電極
イオン選択制電極
圧電センサー 抗体 圧電性水晶結晶
光学センサー 抗体，DNA 表面プラズモン共鳴または
グレーティングカプラー装着の光ファイバー
■ 図 1 バイオセンサーの構成 ■
■ 図 2 バイオセンサーの例 ■ コラム：天然のセンサー
動物はにおいや味を特異的センサー（受容体）
で受容し，それを電気シグナルに変換して神経 系で処理する．これらに相当する機器（味セン サー，においセンサー）が半導体センサーや脂 質膜センサーなどの素子を利用した製品となり 利用されている．しかし麻薬探知犬や調香師に 代わるものがないことからわかるように，これ ら人工センサーは特異性と感度において動物の 感覚器の性能にはまだ及ばない．
