蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動による 三方湖産と緑川産タナゴの水晶体タンパク質組成の 比較
著者 川内 一憲, 川崎 隆徳, 田中 幸枝, 小鍛治 優, 木 元 久, 藤井 豊
雑誌名 福井大学医学部研究雑誌
巻 15
号 1
ページ 47‑51
発行年 2015‑01
URL http://hdl.handle.net/10098/8703
福 井 大 学 医学 部 研 究 雑 誌 第15巻 第1号(2015)
蛍 光標 識 二 次 元 ディファレンスゲ ル 電気 泳 動 による三方 湖 産 と緑 川産 タナゴの 水 晶体 タンパ ク質 組 成 の比 較#
川 内 一・ 憲1,川 崎 隆 徳2,田 中 幸 枝3,小 鍛 治 優4,木 元 久5,藤 井 豊3$
3医 学 科 生 命 情 報 医 科 学 講 座 分 子 生 命 化 学 領 域
Comparison of Lens Protein Composition of the Endangered Bitterlings Inhabiting in the Mikata Lake and the Midori River by 2 Dimensional Fluorescence Difference Gel
Electrophoresis(2D-DIGE)#
KAWAUTI, Kazunoril, KAWASAKI, Takanori2, TANAKA, Yukie3, KOKAJI, Masora', KIMOTO, Hisashi5
and FUJII, Yutaka's
'Division of Molecular Biology and Chemistry
, Department of Biochemistry and Bioinformative Sciences, Faculty of Medical Sciences, University of Fukui
三 方 湖 産 タナ ゴ に,琵 琶 湖 産 の 遺 伝 形 質 が4個 体 中1個 体 か ら検 出 さ れ た 。 そ こで,三 方 湖 産 の新 た な 遺 伝 形 質 を 検 索 す る 目 的 で,水 晶 体 タ ンパ ク 質 の 解 析 を2D‑DIGE法 で 行 っ た 。統 計 処 理 し た結 果,有 望 な形 質 が 幾 つ か 検 出 さ れ た 。
A hctrart .
The cytochrome b genetic trait of the Lake Biwa endemic species was detected from one among four individuals of the Mikata lake. In order to search the new genetic trait of the Mikata lake endemic species, lens protein composition was analyzed by the 2D-DIGE method. As a statistical result, some promising characters were detected.
キ ー ワ ー ド:タ ナ ゴ,三 方 湖,タ ン パ ク 質,水 晶 体,2D‑DIGE Key Words: striped bitterling, Mikata lake, protein, lens, 2D-DIGE
#
1
2
こ の 研 究 は,福 井 大 学 ・地 域 環 境 研 究 教 育 セ ン タ ー ・平 成26年 度 研 究 支 援 経 費,福 井 大 学 ・H25年 度COC事 業, 科 研 費(26505002,26924016)お よ び 住 友 財 団 研 究 助 成(123340)の 助 成 を 受 け て 実 施 した 。
福 井 県 両 生 爬 虫 類 研 究 会,〒919‑0747福 井 県 あ わ ら 市 御 簾 尾7‑17 Fukui Amphibians Reptiles Society, Misunoo 7-17, Awara,
ヘ ラ ク レ ス ワ ー ル ド,〒910‑0804福 井 県 福 井 市 高 木 中 央
Fukui 919-0747, Japan Hercules World, Takagi-chuo, Fukui 910-0804, Japan
4 永 平 寺 町 吉 野 小 学 校,〒910‑1121福 井 県 吉 田 郡 永 平 寺 町 松 岡 吉 野26‑3
Yoshino Elemental School, 26-3Yoshino, Matsuoka, Eiheiji-cho, Fukui 910-1121
5
$
福 井 県 立 大 学,〒910‑1195福 井 県 吉 田 郡 永 平 寺 町 松 岡 兼 定 島4‑1‑1 Fukui Prefectural University, Matsuoka-kenjojima,
問合 せ 先,別 刷 り請 求先
(Received 4 November, 2014Eiheiji-cho, Yoshida-gun, Fukui 910-1195
; accepted 27 November, 2014)
一47一
川 内一 憲,川 崎 隆 徳,田 中幸 枝,小 鍛 治 優,木 元 久,藤 井 豊
1.は じめ に
環 境 省 絶 滅 危 惧IA類(CR)に 指 定 され て い る本 報 タ ナ ゴ の 自然 分 布 は,琵 琶 湖,三 方 湖,由 良 川,紀 ノ 川 お よ び 濃 尾 平 野 で あ る 。 近 年,生 息 環 境 の 悪 化 に伴 い 急 速 に生 息 数 を減 ら して い る(1‑4)。 特 に琵 琶 湖 で は 滋 賀 県 の 「 指 定 希 少 野 生 動 植 物 種 」 に指 定 ・保 護 され 捕 獲 が 禁 止 さ れ て い る。 一 方 で,琵 琶 湖 産 稚 ア ユ に紛 れ て全 国 の 河 川 に放 流 さ れ,熊 本 県 緑 川 で は 定 着 し, い わ ゆ る 国 内移 入 外 来 種 とな っ て い る(5)。 さて,三 方 湖 で も ミ トコ ン ド リア ・シ トク ロ ムbの 遺 伝 子 解 析 に よ り,湖 北 型 遺 伝 子 形 質 が4匹 中1匹 に見 られ た(6)。
そ こ で,新 た な 三 方 湖 産 固 有 の 形 質 を 検 索 す る 目的 で, 生 涯 タ ー ンオ ー バ ー さ れ る こ との な い 眼 の 水 晶 体 タ ン パ ク質(7‑12)の 発 現 パ ター ン を2D‑DIGE法 で 解 析 し た(13)。 そ の 結 果,両 者 に 大 き な 相 違 が 認 め られ た の で, さ ら に 統 計 的 な 解 析 を実 施 した 。 本 報 は,そ の 結 果 を 報 告 お よ び考 察 す る も の で あ る。
2.実 験 方 法
タ ナ ゴ は,琵 琶 湖 産 の 移 入 種 で あ る 熊 本 県 緑 川 産 雌3 個 体 と 三 方 湖 産 雌3個 体 を 用 い た 。 各 個 体 に 識 別No.
を 付 し,全 長,体 重,水 晶 体 重 量(2コ 分)お よ び シ ト ク ロ ムb遺 伝 子 ハ プ ロ タ イ フ゜HT(HT:01琵 琶 湖 木 之 本 型,HT:02琵 琶 湖 湖 北 型,HT:07三 方 湖 型)を そ れ ぞ れ 計 測 お よ び 同 定 し た(6)。
水 晶 体 タ ン パ ク 質 の 抽 出,ラ ベ ル 化 は 前 回 の 方 法 と 同 様 に 行 っ た(13)。統 計 的 解 析 を 可 能 と す る た め,Alban ら の 内 部 標 準 法(14)を 用 い て 蛍 光 デ ィ フ ァ レ ン ス ゲ ル ニ 次 元 電 気 泳 動(2D‑DIGE)分 析 を 行 っ た(15)。 内 部 標 準 法 で は,No.291〜293お よ びNo.301〜303の6サ ン プ ル 等 量 混 合 物 を 内 部 標 準(IS:InternalStandard)
と し て 用 い た 。1次 元 目 の 等 電 点 電 気 泳 動 は ImmobilineDryStrippH3‑11NL,18cm(GE社 製)を 用 い,泳 動 後pI4.4‑8.4(13cm)に カ ッ ト し て2次 元 目 の12.5%‑SDS‑PAGEを 行 っ た 。DIGE‑1(IS:Cy2, No.291:Cy3,No.301:Cy5),DIGE‑2(IS:Cy2,
No.292:cy5,No.302:cy3)お よ びDIGE‑3(Is:cy2, No.293:Cy3,No.303:Cy5)の3回 の2D‑DIGEを 行 い,蛍 光 パ タ ー ン はTyphoon(GE社 製)で イ メ ー ジ 化 し,Progenesis(PerkinElmer社 製)で 統 計 解 析 し た 。 三 方 湖 産 に 固 有 な タ ン パ ク 質 ス ポ ッ トは,ゲ ル か ら ト
リ プ シ ン ペ プ チ ド と し て 抽 出 し飛 行 時 間 型 質 量 分 析 装 置(auto且ex,BrukerDaltonics社 製)で 分 析 し,マ ス コ ッ トサ ー チ で ホ モ ロ ジ ー 検 索 し た 。
3.結 果
解 析 した タナ ゴ の計 測 お よび 同定 結 果 を 表1に ま と め た。
産地
識 別No.
性 別
全 長 (mm)
体 重 (9)
水 晶 体 (mg/2コ)
シ トク ロ ムb ハ プ ロ タ イ プ
HT(6)
熊本県 緑川
291 ♀ 60.8 2.2 3.6 HT:02
292 ♀ 66.0 2.4 4.3 HT:01
293 ♀ 75.3 4.3 6.8 HT:02
福井県 三方湖
301 ♀ 68.5 3.5 4.7 HT:07
302 ♀ 69.8 4.0 5.4 HT:07
303 ♀ 58.7 2.3 3.4 HT:07
表1解 析 に 用 いた タ ナ ゴ の 概 要(琵 琶 湖 産 タ ナ ゴは 滋 賀 県 の 条 例 に よ り捕 獲 等 が禁 止 され て い る た め,そ の 国 内 移 入 種 で あ る熊 本 県緑 川 産 個 体 を用 い た 。)
DIGE‑1〜3の 蛍 光 イ メ ー ジ ン グ は,低 感 度 と高 感 度 (図1〜3)で 画 像 化 し た 。 三 方 湖 産 の 水 晶 体 タ ン パ ク 質 は,DIGE‑1(図1)とDIGE‑3(図3)でCy5の
赤 色 で,お よ びDIGE‑2(図2)でCy3の 緑 色 で イ メ ー ジ ン グ さ れ て い る 。
図1DIGE‑1の 低 感 度 と 高 感 度 イ メ ー ジ ン グ lS:内 部 標 準,熊 本 県 緑 川 産No.291(♀,HT:02,Cy3 ラ ベ ル)と 三 方 湖 産No.301(♀,HT:07,Cy5ラ ベ ル)
一48一
図2
DIGE‑2の 低 感 度 と 高 感 度 イ メ ー ジ ン グ IS:内 部 標 準,熊 本 県 緑 川 産No.292(♀,HT:01,Cy5 ラ ベ ル)と 三 方 湖 産No.302(♀,HT:07,Cy3ラ ベ ル)図3
DIGE‑3の 低 感 度 と 高 感 度 イ メ ー ジ ン グ IS:内 部 標 準,熊 本 県 緑 川 産No.293(♀,HT:02,Cy3 ラ ベ ル)と 三 方 湖 産No.303(♀,HT:07,Cy5ラ ベ ル)低 感 度 イ メ ー ジ ン グ で は,三 方 湖 産 に 特 に 多 く発 現 さ れ て い る4つ の ス ポ ッ ト領 域 が 観 察 さ れ る 。 こ れ ら は,A1415(38kDa,pI7.1),A1588(30kDa,pI6.8)
Al844(24kDa,pI6.4),お よ びA2138(18kDa,pl6.0) と し て 検 出 さ れ た(図4)。
図4三 方 湖 産 ♀No.301‑303個 体(上)と 熊 本 県 緑 川 産
♀No.291‑293個 体(下)の 統 計 的2D‑DIGEイ メ ー ジ ン グ の 比 較
全 部 で 約2,200タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト領 域 が 識 別 さ れ, 統 計 的 に 三 方 湖 産 に 有 意 に2倍 以 上 多 く 発 現 し て い
る31ス ポ ッ ト(上 段 ・緑 囲 み 線 領 域)と 緑 川 産 に 有 意 に2倍 以 上 多 く発 現 し て い る30ス ポ ッ ト(下 段 ・緑 囲 み 線 領 域)が 検 出 さ れ た 。 こ の 中 で 三 方 湖 産 に 多 い タ
ン パ ク 質 ス ポ ッ ト領 域 のA482(95kDa,pl7.3),A1067 (50kDa,pl5.5),A1415(38kDa,pl7.1),A1588(30kDa,
pl6.8),A1844(24kDa,pl6.4)お よ びA2138(18kDa, pl6.0)の タ ン パ ク 質 の 質 量 分 析 を 行 っ た 。
低 感 度 で は,発 現 量 の 多 い 共 通 ク リ ス タ リ ン で あ る α一, β一,お よ び γ一ク リ ス タ リ ン が 主 に 観 察 さ れ る 。 た だ し,そ の 分 子 量 は18〜32kDaが 普 通 で あ る 。A1588, A1844お よ びA2138は こ の 範 囲 に 入 る の で 恐 ら く共 通 ク リ ス タ リ ン と考 え られ る が,質 量 分 析 で は そ れ と 同 定 で き な か っ た(図5)。
図5三 方 湖 産 固 有 タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト領 域 の 質 量 分 析 マ ス コ ッ トサ ー チ で タ ン パ ク 質 の 同 定 が で き た の が,A1067の み で あ った 。細 胞 質 ア クチ ン と 同定 され て い る 。 しか し,他 の ス ポ ッ トで は確 実 な タ ンパ ク質 の 同定 が で き なか っ た。
A1415は 分 子 量 が38kDaと 大 き い の で,い わ ゆ る 種 特 異 的 ク リ ス タ リ ン の 可 能 性 が あ る 。質 量 分 析 の 結 果, ス コ ア が 低 い も の の,グ ル コ ー ス6一 ホ ス フ ァ タ ー ゼ
と の ホ モ ロ ジ ー を 一 部 検 出 し た 。
一 方,高 感 度 イ メ ー ジ ン グ で は,発 現 量 の 低 い 高 分 子 量 の タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト領 域A482(95kDa,pl7.3)
とAlO67(50kDa,pl5.5)が 検 出 さ れ た 。 質 量 分 析 の 結 果,A482は 同 定 で き な か っ た が,AlO67は,細 胞 質 ア ク チ ン と 同 定 さ れ た 。
4.考 察
熊 本 県 緑 川 産 ♀3個 体 は,シ トク ロ ムbハ プ ロ タ イ プ別 で01(木 之 本)型 が1個 体 お よ び02(湖 北)型 が2個 体 で確 か に琵 琶 湖 産 の タ ナ ゴ の 国 内移 入 種 で あ る こ とが 確 認 で き た。 一 方,三 方 湖 産3個 体 は何 れ も 07型 で三 方 湖 型 で あ っ た。Kitazimaら(6)が 三 方 湖 産
4個 体 の うち1個 体 で検 出 した02型 の個 体 は,我 々 の分 析 で は見 つ か らな か っ た。 今 後,分 析 個 体 数 を増 や して実 態 を明 らか にす る必 要 が あ る。
今 回 の統 計 解 析 に よ り,水 晶体 タ ンパ ク質 ク リス タ リン の2D‑DIGEで2,200ス ポ ッ ト領 域 が確 認 さ れ, うち三 方 湖 産 で2倍 以 上 有 意 に発 現 量 が多 い31ス ポ ッ ト領 域,お よ び緑 川 産 で2倍 以 上 有 意 に発 現 量 が多 い30ス ポ ッ ト領 域 が それ ぞれ 検 出 され て い る。 この こ とか ら,琵 琶 湖 産 と三 方 湖 産 との 間 で,少 な く とも 水 晶体 タ ンパ ク質 ク リス タ リン組 成 割 合 に統 計 的 に有 意 な差 異 が あ る こ とが確 か め られ た。 しか し,三 方 湖 産 で特 に発 現 量 が多 い6つ の ス ポ ッ ト領 域 の質 量 分 析 か らは,具 体 的 な タ ンパ ク質 の 同定 がAlO67の ア ク チ ン を除 い て確 定 で き な か っ た。 恐 ら く,こ れ らの ス ポ ッ ト領 域 に は複 数 の異 な る タ ンパ ク質 が混 在 し,結 果 と して不 完 全 な ト リプ シ ン消 化 と不 十 分 な消 化 ペ プ チ ドの ゲル 抽 出 な どが質 量 分 析 シ グ ナル の強 度,分 離 お よ び精 度 に影 響 した た め と思 われ る。 三 方 湖 産 に特 有 なA1067の 酸 性 隣 に分 子 サ イ ズ が 同 じで緑 川 産 に 特 有 な ス ポ ッ トが 認 め られ る こ とか ら,両 種 ア ク チ ン で電 離 性 ア ミノ酸 残 基 の変 異 あ る い は リン酸 化 脱 リン 酸 化 な ど翻 訳 後 修 飾 の相 違 の可 能 性 な どが考 え られ る。
今 後 は,ゲ ル 濾 過 ク ロマ トグ ラ フ ィー お よ びイ オ ン交 換 ク ロマ トグ ラ フ ィー を使 っ て,三 方 湖 産 固有 の タ ン パ ク質 を精 製 ・同定 し,遺 伝 子 レベ ル で三 方 湖 固有 の 形 質 を確 定 したい 。
以 上 の こ とか ら,少 な く とも07型 の タ ナ ゴ は三 方 湖 固有 種 で あ る こ とが強 く示 唆 され た。
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