における 頭頚移行部の圧迫性脊髄病変 と頚椎の靭帯骨化の

原 著

遺伝性骨軟骨異常マウス

における 頭頚移行部の圧迫性脊髄病変 と頚椎の靭帯骨化の

病理組織学的及び免疫組織化学的検討

増 谷 守 彦1 ) 原 田 征 行

抄録 自然発 生的 に脊髄圧迫病変 を生ず る

マウスの延髄下部 と上位頚髄部 の経時的な病理組織学的変化 と,脊柱靭帯骨 化発現 に関与す る

と

の局在及 び骨化発現 との関連 につ いて明 らか にす るため免疫組織学的検討 を行 った.上 位頚椎部,延髄部では椎間板 と椎体 に連続 し後方へ突 出 した骨化病変 と後方か らの突 出性病変 によ り圧迫 された部位 に一致 し て 白質の変化 が明瞭 に認め られた.圧迫が特 に顕著な部位では灰 白質 にも細胞 の萎縮 と軽度 の脱落 を認めた. び 慢性 の変化は 白質,灰 白質 を問わず,延髄,脊髄全体 に認め られた.抗

抗体染色では初期 に染色性 の高 い軟骨細胞が増加 していた.

抗

抗体染色では骨髄腔面,線維軟骨,靭帯部分が陽性 に染色 され 特 に変性 して突 出 した部位 では明瞭な陽性像 を 示 した. したがって

マウスでは椎間板線維輪最外側部 を中心 に骨化過程が進行す る ことが示唆 された.

弘前医学

キーワー ド

マウス;頭頚移行部;靭帯骨化;TGF‑ β;デコ リン.

ORI GI NALARTI CLE

HISTOPATHOLOGICAL STUDY OF THE COMPRESSIVE CERVICAL m I.OPATHY AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF

THE OSSIFICATION OF THE LIGAMENT

AT THE CRANIO･CERVICALJUNCTION OF TWY MOUSE

MorihikoMasuya and SeikoHarata2)

い

Abstract Thetiptoewalking‑Yoshimura(twy)mouseisamutantstrainshowingmultipleosteochondrallesions includingdeformityofthevertebralcolumnandcervicalmyelopathy.Thepurposeofthisstudywastoclarify boththehistopathologicalalterationsoccurringinthelowermedullaoblongataandhighercervicalcord,andthe involvementofTGF‑βanddecorininpathologicalossification,ofthetwymouse.Alterationofsubstantiaalba wasfoundinlocicompressedbyossificationlesionsinthehighercervicalcordandmedullaoblongata.Cellular atrophyandslightdefluvium ingraymatterwerepresentinthelociwithremarkablecompression.Diffuse changeswereobservedinthemedullaoblongataandthewholecervicalcord.Therefore,weconsiderthetwy mousetobeausefulexperimentalmodelforcervicalmyelopathyincludingacranio‑cervicaljunction.Itwas suggestedthatossificationoftheposteriorlongitudinalligamentprogressedaroundtheposteriorcornerofthe vertebralbodyandanulusfibrosusofthelateralintervertebraldisc,becausethesewerestainedbyantiTGF‑β antibodyandanti‑decorinantibody.

HirosakiMed

,∫

TGF‑ β;

1)DepartmentofOrthopaedicSurgery,Hirosaki 1)

弘 前大学 医学部 整形外科

2)AomoriPrefecturalCentralHospital Correspondence:M.Masuya

Receivedforpublication,August5,2004 Acceptedforpublication,March8,2005

2

)青森県 立 中央病 院

別刷 請求 先 :増谷守 彦

平成

年

月

日受付

平 成 17年 3月 8日受理

い る可 能 性 が 考 え られ る

は

β と結 合 し

の活 性 を調 節す る作用 を持 ち,

である と考 え られて い る

) .後縦靭帯骨化発現 に際 して

βの作用が 関与 して いる ことが推測 されて いるが, 同部で の

の存在 の有 無 に関 して は明 らか にされ て いな い.

1978

年, 実 験 動 物 中央 研 究 所 にお い て

系 マ ウス か ら近 交 系 を作 出す る 目的で交配 中に,体 型が小 さ く, 脊柱 の琴曲を示 し,前 ･ 後肢 の末梢 関節が拘縮 し, つ ま先立 ち歩行 を示す個体 が発見 され た. この形 質 は常染色体性劣性遺伝子 によって支配 され, こ の 遺 伝 子 を

と命 名 し,

マ ウス

'と呼 ばれ て い る.

マ ウス は骨膜や靭帯 の骨形成 のため脊柱管 の狭窄性病変 を

自然発症 し,特 にそ の狭窄 は大後頭孔 を 含 む 上位 頚 椎 部 に著 明で あ る. した が って

マ ウスは頭頚移行 部 の神経細胞 の変化 を追跡 し, 骨化発現 と骨化 によって圧 迫 され た神経細胞 に関 して検討す るのに適 している と考 え られ る.

本 実験 で は骨 軟 骨 異常 を も

マ ウス の頭 頚移行部 の病変 を病理組織学的 に経時的 に観察す る と共 にそ の脊 椎 にお け る

と

の 局在 及 び骨化進展 との関連 につ いて明 らか にす る ため免疫組織化学的検討 を行 った.

実験材料及 び方法

1.実験動物

1)Twy

マ ウス

匹 を用 いた. これ らは慶 応 大 学 医学 部病 理 学教 室 か ら譲 り受 けた

マ ウス

匹 と 日本 ク レア株 式会社 よ り購入 した

マ ウス

匹 を弘前大学医学部 附属動物実験 施設 にて飼育 した.

2)

対 照群 として

系マ ウス

匹 を用 いた.

前述 の標本 を切 出 し

中性緩衝ホルマ リ ンにて

時間固定 した.

液 にて

時間脱灰後,パ ラフィン包埋 した.延髄部, 上位頚椎 部 につ いて薄切 を行 い,それぞれ横 断 面及び矢状面の 7

の連続標本 を作製 した.

脊 椎, 脊 髄, 及 び延 髄 の病 理 組 織 学 的変 化 を観察す る 目的で, これ らの各パ ラフィン切片 に対 して

染色 を行 っ た.

2)

脊柱 の靭帯肥厚及び骨化過程 の初期変化 を検 討す る 目的で,

週 令 と

週令 のパ ラフィ ン 切片 に対 して以下の染色 を行 った.

( 1)抗

抗体染色

(2)

抗

β1 ) 抗体染色

抗

抗 体 染 色 で は 一 次 抗 体 と し て

社 製 の

, 標 識 二 次 抗 体 と して

社 製 の

を 使 用 した. 抗

抗 体 染 色 で は脱 パ ラ フ ィ ン後

ら

'の 方 法 に準 じて 行 い, 前 処 置 と し て 生 化 学 工 業 社 製 の

r .

にて室温 で

時間の酵素処置 を 行 った.一次抗体 は

社製 の

,標識 二次抗体 は

社製の

を使用 した.

社 の メチル グ リー ンにて後 染色 を行 った.

結 果

1.Twy

マ ウスの運動の変化

経時的 に

マウスの生態 を観察 したが,

週

令では対 照群 と比べて 目立 った変化 は認 めなか っ

串 :環軸膜

×40

図

週令 t w

y マウス.

(a)

延髄上位脊髄標本

染色)×40.小空胞変性 の出現

を認 め る.

( b) 環軸膜標 本

染色)×200.多 くの線維 軟骨細胞 が認 め られ る.

×200×400

図

週令 t wy マウス

.

(a)

延髄横断標本

染色) ×40 ,

( b) 延髄標本

染色)×400.神 経細胞 は軽度萎縮性 変化 を示 し, 小空胞 と軽

度 グ リアの増 生 を認 め る.

た.

週 令 で は生

育不 良が 目立 ち,脊 椎 はやや 後考 し, 四肢関節は

拘縮 してきたがつ ま先立 ち歩 行は していなかった

2.Twy

マウスの頭頚移行部脊椎脊髄病理 .

矢状断 を観察す る と最 週令 組織変化

も著 明な変化 は歯突起先 端か ら背側 にかけて肥厚

した環椎横靭帯 と蓋膜が 一体 とな り不規則 に肥厚

,骨化 し,後頭環軸関節 部で脊柱管 内へ突 出 して い

た. また環軸 関節部 も 骨膜が肥厚す る形で脊髄 を

後方か ら圧迫 し,圧迫 された延髄下部 と頚髄上部

は狭窄 されて いた.上 位頚椎では椎間板外側部

及び椎体終板部での変化 は

週令 で既 に出現 して

お り

染色 で染色性 の低下 を示 し,軟骨細

胞,軟骨基質 の消失 した部 位 を中心 に層板状構造

をもつ変性像や無構造 の変 性像 が認 め られ た. こ

れ は椎体 の石 灰 化 前線 に

よって境界 を有 して いた. また軟骨小宿 の縮小 を 認 めた ( 図 1). 脊

髄 全体 に渡 りび慢性 に小空胞 が 出現 し,特 に延髄

では辺縁部, オ リー ブ核,皮 質脊髄路, 内側毛帯

,及び外側脊髄視床路 の軸索 の腫脹が出現 し,脱

髄 を認 め,そ の近位で グ リア が軽度増生 して いた

.横断面では延髄下部 は圧迫 のためやや扇平化 し

,オ リー ブ核 な どの神経細胞 は軽度萎縮性変化 を

示 し,小空胞 と軽度 のグ リア の増生 を認 めた.脊髄

小脳路,三叉神経脊髄路 に も同様 の変化が認め ら

れた.延髄 の上部,下部 に うっ血 を生 じ,毛細血管

が拡張 し,軽度 のグ リア の増生 を認 めた. 中心側 に

存在す る脊髄視床路 も 同様 で あ ったが, わず か な

変化 で あった.C2高

位では前後か ら圧迫 され,

串:環軸膜

図

1週令 t wy マウス.

(a)

延髄上位脊髄標本

染色)×40.著明な脊髄の圧迫 とそれ

に伴 う神経線維の希薄化が認め られ る.

( b) 環軸膜標本

染色)×200.線維軟骨細胞 と骨細胞及び骨芽細胞 の混在 を認め

×40

る.

図4

週令 t wy

マウス.

(a)

延髄横断標本

染色)×

40.

( b) 延髄標本

染色)×400.神経細胞は軽度萎縮性変化 を示 し,小空胞 と軽

度 グリアの増生 を認める.

髄路,脊髄視床路で小

空胞 が存在 し, 白質 の髄鞘 の腫脹 と崩壊が 目立ち

, グ リアの増生が よ り高度 に認め られた.後索で

は グ リアの増生はわずかで あった (

週 図

令

矢状 断 を観察す る と

週令 に比べ

週令では 環 椎

が歯 突起 と癒 合 し, 骨髄 腔 の狭 小化 を認 め た.後

方か ら環軸椎 間の後環軸膜が肥厚骨化 し, .

あたか

抗TGF‑β抗体陽性 抗decorin抗体陽性

図

週令 t wy マウス.

( a) 延髄 上位 脊髄標 本

染色) ×

40.小空胞変性 の出現 を認める.

( b) 環 軸膜標 本

染色)×200.多 くの線維軟骨細胞が認

め られ る.

抗TGF‑β抗体陰性 抗decor

in抗体陰性

図

週令 t wy マウス.

)

延髄横 断標本

染色) ×40.

( b) 延髄標本

染色) ×400.神経細胞は軽度萎縮性変化 を示 し,小空胞 と軽度 グ リアの増生を認め

マ ウスで軟 骨基 質 と軟 骨細 胞 が 陽性 に染 色 さ る.

れ た.一

週令 の t wyマウスでは隅角部の後

縦靭 帯 と軟骨細胞 が陽性であった.抗

抗

体 染 色 は椎体隅角部 の後縦靭帯

部で陽性であった ( 図

週 令 で の t wyマ ウス の椎 間板 線維 輪 最 外側部 の脊柱管 内への突 出部 に一致 して石灰化軟

骨細胞が出現 し線維軟骨層の基質が増加 して いた が,この部位では抗 TGF‑ β抗体染色は陰性であっ た.椎間板辺縁 の線維軟骨の増生の認め られ る部

位 と後縦靭帯 の線維芽細胞様細胞 と線維性結合組 織

及び この近位部 の椎体骨基質 は抗

抗体 染色陽

性であった ( 考 図

察

本実験 で使用 した t wyマ ウス は遺伝 性 骨軟 骨 異常マウスで あ り,脊柱,四肢 関節な ど全身性

に

石灰化,骨化 を生 じる ことが認 め られて いる

小島原

)によれば椎 間板線維輪 を主体 とした脊柱 管 内へ

の突 出性病変 は週令が進む につれてそ の程 度 は徐

々 に増大 し,

週令 にお いて は脊柱管 の 面積 の

週令 においては

を占め

, 著 明に脊髄 を圧迫 し変形 させ る.今 回 この脊柱

管 内へ の突 出性病変 による神経細胞への影響 を こ

れ まで注 目されて いなか った大後頭孔周辺 の変化

か

らそ の骨性変化 に伴 う延髄部病変 の病理組織学的

消失,壊死,空洞 化 を伴 う灰 白質 の変性 を認 め,

の微 少循環 の障害 によ る ことを 報告 して いる.

福 田

)はイ ヌ を用 いた 頚 髄 の虚 血 性 ミエ ロパ チ‑ の研 究で, ミエ ロパチ‑ の原 因 として前脊髄 動脈

後 脊髄 動脈 を含 めた脊髄 表面 の 血管 の閉塞 の重要性 を示 して いる. また 申

)は脊 髄 に生 じる うっ血 の結果,後索深部 をヰ 心 とした 白質 に脱髄 が生 じ, 内椎骨静脈叢 と前脊髄静脈 を 経 由す る上行経路 の重要性 を説 いて いる.藤野 1 0 ' は家兎 の頚髄腹側圧 迫実験 に

を行 い,慢性 的な頚髄圧 迫で は圧 迫部 を中心 とし た上下 2‑ 3髄 節 にお よぶ,灰 白質,前,後 角部 の神経細胞 の消失,壊死巣,空洞 形成,前索部, 側索部 の脱髄性変化,後索部 の空胞状変化 が認 め られ,髄 内,微細動脈 系 の虚 血性循環 障害 を指摘 して いる.

twy

マ ウスの縦 断標本 を観察す る と,そ の脊髄 圧迫 は後頭環軸 関節 と各椎 間板 レベルで強 い. こ れ は肥厚靭帯 の骨化 と椎 間板 自体 の膨隆 による後 方へ の突 出が合併 して いるためで ある と考 え られ る.

上位頚椎部,延髄部では椎 間板 と椎体 に連続 し 脊柱管 内 に突 出 した後縦靭帯骨化病変 と環椎横靭 帯,蓋膜 の骨化病変 によ り前方 か ら圧迫 され, ま た後環椎後頭膜,後環軸膜 な どの後方要素 の骨化 によ り後方か ら圧 迫 され,圧 迫 され た部位 に一致 して辺縁部 に存在す る前皮質脊髄路,外側皮質脊 髄路,外側脊髄視 床路 な どの 白質 の変化 が明瞭 に 認 め られ た.圧迫 が特 に顕著 な部位 では前角細胞 な ど灰 白質 にも変化 が認 め られ たが,神経細胞 の 著 明な萎縮 は縮窄 が進行 してか ら出現 して いた.

しか し神経細胞 の萎縮 は 目立 つが脱落 は ごく軽度 であった.び 慢性 の変化 は 白質,灰 白質 を問わず, 延髄,脊髄全体 に認 め られ圧迫 の程度 に左右 され

の週令 にお いて も認 め られず, また血管腔 の狭窄 や血栓 も認 めなか った.

ら

は脊髄 へ の圧 迫 が微 小循環や血液脳 関門が破綻 を引き起 こし,虚 血 を生 じる と報告 して いるが,圧迫 による局所 の 浮腫や壊死 な どの循環 障害 を思わせ る変化 は認め られ なか った. しか し,圧迫部位 の上下 にはび慢 性 に うっ血性 の変化 が 明 らか に認 め られ た.脊髄 横 断面で周辺部が侵 されやす く, 白質 に病変が強 い こと,髄鞘 の崩壊 が神経細胞 の変性 よ り目立つ ことな ど長嶋

2 )によって報告 された硬膜外静脈 の 循環 障害 の特徴 を認 めた. また直接圧 迫 を受 けて いない延髄 上部 に生 じて いた脱髄 は圧 迫 による変 化 だけで は考 え に くく,圧迫が高度 にな り長時間 経過す る と脊髄血管 の解 剖 と血行動態 1 3 ) か ら推察 すれ ば,脊髄静脈 な どの静脈還流障害 によるうっ 血 のた め虚血 も生 じて いる と考 え られ る. また狭 窄が進行 した段 階では,灰 白質 の圧迫 によ り特 に 前角が著 明な扇平化 を示 し,神経細胞 の脱落 とグ リオ‑ シス を認 めた とい う橋詰 1 4 'の報告 した後縦 靭帯骨化症 の病理組織 と類似 して いた.今 回認 め られた脊髄 の病理変化 は小野 と藤原

の報告 した 頚椎症性 脊髄症 の病理変化 に類似 してお り,頚椎 症性脊髄症 の病理学的変化 を考察す る上で も

マウスは有用な動物で ある と考 え られ る.

後縦靭帯骨化症や黄色靭帯骨化症 な どの脊柱靭 帯骨化症 の成 因はいまだ不 明で あるが,本来骨形 成能 を持 たない靭帯組織 が骨組織 に置換 され る と い う病態 か ら,そ の成 因 に

βや

が関与 している可能性が考 え られ る

骨組織 には様 々なサ イ トカイ ンや成長 因子 の局

在が知 られて いる.

βは

β

まで

種類 の型が知 られ, この うち

は,

ら

によ り骨 基 質 中 の軟 骨 誘 導 因

子 として 同定 された成長 因子で,骨化靭帯 の骨基

質及 び骨化巣周 囲の軟骨細胞質 に存在す る ことが

明 らか にされて いる.骨基 質 中の

βは分子 量

量体 が結合 し, これ に

β結合 タ ンパ ク質が更 に結合 した不活性型 として骨芽細胞 よ り産 生 され る 1 8 )

βは元 来 は正 常 の線 維 芽細胞 に作用 して軟寒天培地での増殖 を促進す る 因子 として兄 いだ された. また細胞外マ トリック ス の産生を調節 し,線維芽細胞 な どに作用 して コ ラーゲ ンや フィブロネ クチ ンな どの産生 を促進す る 1 8 ) . これ までの実験で

oで間葉系細胞 を軟 骨細胞 に分化 させ

にお いて骨膜下骨形 成 を促進 させ る

ことか ら,骨改変や骨折治癒 過程で骨形成 に重要な役割 を果た して いる と考 え

られている.

細 胞 外 マ トリ ックス に存在 す る

子 サ イ ズ が

本 の グ リコサ ミ ノグ リカ ン糖鎖 が結合 した低 分子 デ ル マ タ ン硫酸 プロテオ グ リカ ンで ある.chi

の卵細胞 に高濃度 に

形態 や成長 に大 き く影 響す る こ とが知 られ て い る.Decor

βへ の結合能が あ り,TGF‑

βは多 くの細胞 中に認 め られ る

誘導す るので,decor

の一つである ことが考 え られて い る.Decor

βと結合 してそ の細 胞 増 殖促 進作用 を阻害す る ことか ら

βの活性 の

' . ヒ ト の骨化後縦 靭帯組織 で の

βに関 して,川 口 ら 2 1 )は

は骨基質及 び骨化 部周 囲の軟骨 細胞質 には存在 していたが周 囲の間葉系細胞 には 分布せず,異所性骨化 のよ り進んだ段 階で,軟骨 細胞や骨芽細胞 に作用 して骨形成 を促進 して いる と報告 して いる.宮 本 ら

帯 内の一部 の線維芽細胞様細胞,非石灰化軟骨層 の線維軟骨細胞 に局在 し,脊柱靭帯 の軟骨化及び 骨化 に関与 している と報告 して いる. また軟骨細 胞 は増殖期か ら成熟期 を経て石灰化軟骨細胞へ と 分化す ることが知 られている.

今 回の実験では骨化前駆状態 と考 え られ る

マウスの脊椎病変 に着 目し

βと

局在か ら骨化 の進行 について免疫組織化学的 に検 討 した.

今 回検 討 した

へ の突 出部 に一致 して石灰化 ( 肥大)軟骨細胞が 出現 し,石灰化軟骨層が増生 して いたが, この部 位 で は抗

抗体 陰性 で あった. 一方 同部 位 と靭帯 内の線維芽細胞様細胞 が抗

陽性であった ことよ りt

か ら椎 間板線維輪外側 の脊柱管 内突 出部 を中心 に 後縦靭帯骨化過程が進行す る とい うことが示唆 さ れ,TGF‑

骨化機序 の解 明に意義 のある ことと考 え られた.

結

1.Twyマ ウス の頭頚移行部 の骨性変化 に伴 う

延髄下部,上位頚髄部 を経時的 に免疫学的手法

を用 いて病理組織学的 に検討 した.

2.

歯突起先端か ら背側 の蓋膜,環椎横靭帯 の骨 化,椎 間板外側部及 び椎体終板部での変化 は

週令で既 に出現 し,軟骨細胞,軟骨基質 の消失

した部位 に変性像が観察 され,週令が進む につ れて拡 大 し,11 週令 で は 同部位 を中心 と した 骨梁の肥厚 と骨形成 を認めた.

3.

脊柱管 内突 出病変 による慢性的な圧迫 によっ て,脊髄周辺部が侵 されやす く,灰 白質 よ りも 白質 に病変が強 い こと,髄鞘 の崩壊が神経細胞 の変性 よ り顕著である ことか ら,t

頭頚移行部 も含 めた頚髄症性脊髄症 の実験 モデ ル として有用であると考 え られた.

4.Twyマ ウス の軟骨細胞 は早期 よ り分化 し,

石灰化軟骨細胞 とな り,椎体 隅角部 と椎 間板線 維輪最外側部 の脊柱管 内突 出病変 を中心 に骨化 過程が進行す る ことが示唆 された.

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