コレステリルエステル転送蛋白欠損症と動脈硬化に 関する研究

コレステリルエステル転送蛋白欠損症と動脈硬化に 関する研究

著者 小泉 順二

著者別表示 Koizumi Junji

雑誌名 平成3(1991)年度 科学研究費補助金 一般研究(C)  研究成果報告書

巻 1990‑1991

ページ 13p.

発行年 1992‑03

URL http://doi.org/10.24517/00049282

Creative Commons : 表示 ‑ 非営利 ‑ 改変禁止 http://creativecommons.org/licenses/by‑nc‑nd/3.0/deed.ja

コレステ'ノルエステル転送蛋白欠損症と 動脈硬化に関する研究

研究課題番号02670278

平成3年度科学研究費補助金 研 究 成 果 報 告

(一般研究C)

童冨

平 成 4 年 3 月

研究代表者小 泉 順

（金沢大学医学部附属病院講師）

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研 究 組 織

研究代表者：平成2，3年度小泉順二（金沢大学医学部附属病院・講師）

研 究 経 費 平成2年度 平成3年度

計

円円円千千千００００００９２１Ｌｚ

研 究 発 表

（ 1 ） 学 会 誌 等

1.KoizumiJ.,ThompsonGR.

EffectsofinfusingapoHDL/phosphatidylcholinecomplexesintonormaland

hypercholesterolemicrabbits.

50thAnniversaryofphospholipidresearch(EPL).edbyGundermannKJ,andSchumacher R,wbn‑Verlag,Bingen/Rheinl49‑159,1990.

｡

2.KoizumiJ.,Michishital.,ThompsonGR.

Cholesterol‑mobilizingcapabilityofapolipoproteinA‑1/phosphatidylchOline complexes.

DisordersofHDL・edbyLACarlson,Smith‑Gordon,London225‑232,1990.

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Increasedhigh‑densitylipoproteinlevelscausedbyacommoncholesteryl‑ester transferproteingenemutation.

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●

5．小泉順二・

CETP欠損症とコレステロール代謝

「 雨 戸 三 三 z 豆 司

TherapeuticResearchll:3301‑3306,1990.

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コレステリルエステル転送蛋白(CETP)欠損症 治療学24:246‑250,1990.

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TallAR.,MabuchiH.,TakedaR.

Serumlipoproteinlipidconcentrationandcompositioninhomozygousand heterozygouspatientswithchOlesterylestertransferproteindeficiency・

Atherosclerosis90:189‑196,1991.

8．小泉順二・

8000−15348−3

HDL代謝と冠動脈硬化．

循環器科29:353‑360,1991.

9 ． 稲 津 明 広 ， 小 泉 順 二 ， 馬 渕 宏 ．

コレステリルエステル転送蛋白欠損症と高HDL血症の分子生物学．

医学のあゆふ157:811‑816,1991.

( 2 ) ロ 頭 発 表

1 ． 小 泉 順 二 ， 稲 津 明 広 ， 八 木 邦 公 ， 小 泉 一 郎 ， 宇 野 欣 秀 ， 梶 波 康 二 ， 藤 田 一 馬渕宏，竹田亮祐,A.Tall.

ヘテロ接合体性コレステリルエステル転送蛋白(CETP)欠損症の高比重リポ蛋白(HDL)の脂 質 組 成 の 異 常

平成2年度日本動脈硬化学会冬季大会Dec.13,1990.(宮崎）

2 ． 小 泉 順 二 ， 宇 野 欣 秀 ， 小 泉 一 郎 ， 梶 波 康 二 ， 馬 渕 宏 ， 竹 田 亮 祐 竹 越 忠 美 ， 若 杉 隆 伸 ， 藤 田 − ， 上 田 幸 生 ， 宮 元 進 ， 大 家 他 喜 男 ．

HMG‑CoA還元酸素阻害剤(MK‑733)とプロプコール投与によるアポE含有HDLの減少．

第22回日本動脈硬化学会総会Jun.7,1990.(甲府).

3 ． 小 泉 順 二 ， 稲 津 明 広 ， 八 木 邦 公 ， 小 泉 一 郎 ， 宇 野 欣 秀 ， 梶 波 康 二 ， 馬 渕 宏 竹田亮祐,A､Tall.

CETP欠損症のヘテロ接合体におけるHDLの脂質組成の異常 第32回日本老医学会総会Nov.15,1990.(高知）

4 ． 稲 津 明 広 ， 小 泉 順 二 ， 小 泉 一 郎 ， 宇 野 欣 秀 ， 藤 田 一 ， 梶 波 康 二 ， 馬 渕 宏 竹田亮祐，上田幸生,M､L.Brown,A.Tall.

コレステリルエステル転送蛋白欠損の遺伝子異常 第22回日本動脈硬化学会総会Jun,7‑8,1990.(甲府）

5 ． 稲 津 明 広 ， 小 泉 順 二 ， 小 泉 一 郎 ， 宇 野 欣 秀 ， 藤 田 一 ， 梶 波 康 二 ， 馬 渕 宏 竹田亮祐，上田幸生,A.Tall,黒田継久，丸浜喜亮，高田耕基，平田康彦，

梶 山 梧 郎 ．

CommonCETPgenemutationのgeneticbackgroundの検討 第22回日本動脈硬化学会総会Jun.7‑8,1990.(甲府）

6 ． 宇 野 欣 秀 ， 稲 津 明 広 ， 小 泉 一 郎 ， 藤 田 一 ， 梶 波 康 二 ， 小 泉 順 二 ， 馬 渕 宏 竹田亮祐，伊藤英章,A.Tall.

CommonCETPの遺伝子異常のdotblothybridizationによるスクリーニング法 第22回日本動脈硬化学会総会Jun.7,1990.(甲府）

7 ． 稲 津 明 広 ， 小 泉 順 二 ， 馬 渕 宏 ， 竹 田 亮 祐 ． コレステリルエステル転送蛋白欠損症のリポ蛋白代謝．

第28回日本臨床代謝学会総会Apr.26,1991.(岐阜）

8．稲津明広，小泉順二，八木邦公，小泉一郎，宇野欣秀，梶波康二，馬渕宏 竹 田 亮 祐 ， 藤 田 − ， 伊 藤 英 章 ， 上 田 幸 生 ， 宮 元 進 ， 太 田 正 之 ， 竹 越 忠 美 コレステリルエステル転送蛋白による高HDL血症の分類．

第23回日本動脈硬化学会総会Jun.7.1991.(神戸）

研究成果

I:研究目的

動脈硬化症の成因および進展に低比重リポ蛋白(LDL)などアポB含有リ ポ蛋白が重要である。同時に、高比重リポ蛋白(HDL)の重要性も疫学調査 より認識されており、HDLコレステロールは冠動脈硬化症の負の危険因子 とされている。しかし、HDLの代謝および調節機構には不明の点が多い。

コレステリルエステル転送蛋白(CETP)は、高比重リポ蛋白(HDL)のコレス テリルエステル(CE)をアポB含有リポ蛋白へ転送するHDL代謝に重要な蛋白 である'〉。

我々は、コレステリルエステル転送活性(CETA)欠損患者では、高HDL‑コ レステロール(C)血症が認められ2)、この疾患はCETP遺伝子のイントロン 14のスプライスドナーサイトのGよりAへの点変異によるCETP欠損症である ことを報告した3>oCETP欠損症のホモ接合体では著しい高HDL‑C血症を認 め、血清リポ蛋白は抗動脈硬化的と考えられているが、ヘテロ接合体での 異常は明かでない。CETP欠損症はわが国においてのみ発見されている疾患 である4>・わが国における高HDL‑C血症におけるCETP欠損症の占める重要 性と動脈硬化症との関係は興味のあるところであるが、ヘテロ接合体の確 定 診 断 に は 遺 伝 子 診 断 が 不 可 欠 で あ る 。 今 回 、 我 々 は ヘ テ ロ 接 合 体 を 診 断するためのCETP遺伝子異常のスクリーニング方法を開発し、その臨床像

を明らかにした。

Ⅱ：研究方法

(1)ヘテロ接合体のリポ蛋白代謝異常を検討するために、CETP欠損症の家 系 で 早 朝 空 腹 時 に 採 血 し 、 血 漿 に て 超 遠 心 法 に よ る リ ポ 蛋 白 分 析 を 行 っ た 。 比重l.006kg/L以下(VLDL)、l.006‑1.019kg/L(IDL)、1.019‑1.063kg/L(LD L)、1.063kg/L以上(HDL)に分け、脂質組成の検討をおこなった。血球成分 よりTritonX‑1001ysis法でDNAを抽出し、イントロン14のスプライスド

ナーサイトの異常を明らかにするためにその部位をpolymerasechainre action(PCR)で増幅し直接塩基配列決定法にてヘテロ接合体、ホモ接合体 の診断を行った4>・血清CETP量の測定は抗CETPモノクロナール抗体(TP2) を用いたRIA法でコロンビア大学のA・Tall教授の協力で測定した5)。

(2)わが国におけるCETP欠損症がすべて同一起源の遺伝子変異によるかを 検討するために、家系の異なる5例のホモ接合体でCETP遺伝子のハプロタ

イプの検討を行った。

(3)わが国におけるCETP欠損症の頻度を検討するために、血清HDL‑Cが60m g/dl以上の血縁のない109例を対象に、イントロン14の点変異の有無を検 討した。変異の検討のため、PCRを利用して新しい制限酵素切断部位を作 成 す る 簡 便 な ス ク リ ー ニ ン グ 方 法 を 開 発 し た 。 イ ン ト ロ ン 1 3 の 部 位 の 1 4IAプライマーとイントロン14の141B47プライマーでPCRを行い、変異 のある場合はNdel制限酵素の切断部位ができるように設計した。

141A:5'‑AGCATCTGCCTTGTGGGT‑3'

14IB47:5'‑AAGCTCTGTCAGCCTCGGCACCCAGTTTCCCCTCCAGCC CACACATA‑3'

PCRで増幅されたDNAをNdelで切断後、3．0%NuSieve3:lagarosegelで 泳動した。

Ⅲ ： 結 果

(1)CETP欠損症のリポ蛋白脂質の検討

CETP欠損症患者のリポ蛋白の脂質濃度測定の結果を表1に示した。ホモ 接合体のHDL中の遊離コレステロール(UC)とコレステリルエステル(CE)は

0.93mmol/Lと3.28mmol/Lでヘテロ接合体、対照群より有意に高値であった (p<0.01)。隣脂質(PL)もヘテロ接合体、対照群より高かったが、トリグリ セライド(TG)は逆に低下していた。ヘテロ接合体のHDL‑CEは1.48mmol/Lで 家系内対照者および正常血清脂質の対照群のl.27mmol/Lと1.21mmol/Lより 僅かに高いが、有意差は認められなかった。しかし、HDL‑TGは対照群より 低下していた(p<O．05)｡VLDL分画では、ホモ接合体でUC，TGとPLの増加が

みられたが、CEの増加はみられなかった。IDL分画では、ホモ接合体でCE の低下が認められた(p<0.05)｡

各リポ蛋白分画の脂質組成を検討した〔表2）。ホモ接合体では、VLD LとIDLではEC/TG比の低下、HDLではEC/TG比の増加が認められた(p<0.01)。

ヘテロ接合体では、IDLのEC/TG比が家系内対照者より有意に低下していた (p<0.01)。

血清CETP量と各リポ蛋白の脂質濃度および脂質組成比との相関関係を検 討した（表S)｡VLDL‑UC,VLDL‑TG,VLDL‑PL,HDL‑UC,HDL‑CE,HDL‑PLはCET Pと有意の負の相関が(p<0.05)、IDL‑CE,HDL‑TGはCETPと有意の正の相関が 得られた(p<0.05)。脂質組成比とでは、IDL‑EC/TG比がr=0.843(p<0.001) と正の相関が、HDL‑EC/TG比がr=‑0.739(p<0.001)と負の相関が認められた。

以上の結果は、CETPがHDLとIDLなどのTG‑richリポ蛋白との間のCEの転送 に重要であることを示唆していると考えられる。

(2)CETP欠損症のハプロタイプの検討

このCETP欠損症はわが国でのみ発見されている代謝異常である。イント ロン14のスプライシング異常によるCETP欠損症が同じ起源を持つ遺伝子変 異かを検討するために、CETP遺伝子のハプロタイプを4種の多型性(Taq

IA,TaqlB,BamHI,Stul)で分類した。家系の異なる5例のホモ接合体の ハプロタイプは同じであり、同一の起源による変異と考えられた（表4）。

(3)CETP欠損症のスクリーニング

イントロン14のスプライシング異常のCETP遺伝子を方法に述べたように、

PCRで新しい制限酵素部位を作成し検討した。PCRで増幅生成したDNAの塩 基配列を図1に、泳動のパターンを図2に示した。異常の見られたDNAの 塩基配列を直接塩基配列決定法で検討したが、すべてGよりAの変異が確認

された。ホモ接合体とヘテロ接合体の鑑別は直接塩基決定法を併用して行 った。

血清HDL‑C値が120mg/dl異常では、21例中8例がホモ接合体、6例がヘテ ロ接合体で、異常遺伝子の頻度は52%であった（表ら)｡HDL‑Cが100‑119 mg/dlでの異常遺伝子頻度は8%、80‑99mg/dlでは3%、60‑79mg/dlでは1%で あった。現在、我々は7家系13例のホモ接合体を確認している（図8）。

Ⅳ ： 考 察

CETPはHDLとアポB含有リポ蛋白との間で、CEとTGを相互に交換し、また、

CEのみを転送すると考えられている。CETPの活性が認められないラットな どは高コレステロール食にても動脈硬化は発生し難く、ウサギなどのCET P活性が高い動物では動脈硬化を起こしやすい食事で容易に動脈硬化が生

じる。これらのことよりCETPの低下は抗動脈硬化的に働くと考えられてい る。遺伝子異常が明らかになる以前は、ヘテロ接合体の診断ができず、C ETPが正常の半量であるヘテロ接合体のリポ蛋白がどのような変化を示し ているかは明かでなかった。今回、我々は遺伝子診断法を確立し、へテロ およびホモ接合体の診断を行った。

今回の検討では、ヘテロ接合体のHDLは量的には僅かのCEの増加を示す のみであったが、脂質組成では明らかなCETP量の低下の影響が認められた。

さらに、注目すべきことはCETP量とIDLのECおよびEC/TG比との間に正の相 関が認められたことである。以前、我々はLDL‑CとCETPとの正の相関関係 を示し、CETPの低下はLDL‑Cの低下をもたらすことにより動脈硬化を発生 し難くしている可能性を示唆した4>･今回、LDLと同様に動脈硬化を促進 するIDL‑Cの増加とCETPとの関係が示唆された。Bisgaieretal.はCETP欠 損症患者でのVLDL,LDLのCEの脂肪酸分析より、invivoでのCEの転送障害 の存在を証明し、LDLの生成過程におけるHDLよりVLDL,IDLへのCEの転送の 重要性を示唆した6)。従って、CETP欠損症ではCETPの量の程度により動脈 硬化を促進するリポ蛋白が減少し、また、動脈硬化を予防するリポ蛋白が 増加していると思われた。

上 述 の よ う に ヘ テ ロ 接 合 体 の リ ポ 蛋 白 も ホ モ 接 合 体 と 同 様 に 抗 動 脈 硬 化 的と考えられ、ヘテロ接合体を含めたCETP欠損症のスクリーニングの重要 性が考えられる。すべての対象で塩基配列を決定するのは膨大な労力と時 間が必要であり、また、Fツトプロット法などでは条件により疑陽性、疑 陰性を生じる可能性があり、我々はPCR法により新しい制限酵素切断部位 を作成する方法を開発した。この方法では条件設定が他の方法より容易で あり、アイソトープを使用せず短時間で結果が判定できるスクリーニング に適した方法と考えられる。

HDL‑Cが60mg/dl以上の109例の遺伝子異常の有無の検討で、HDL‑Cが120 mg/dl以上での異常遺伝子発現頻度は52%であり、100mg/dl以上では28%で あった。血清HDL‑Cが120mg/dl以上の21例中14例にこの遺伝子異常が認め られたが、残り5例は別の原因による高HDL‑C血症であった。わが国におけ る高HDL‑C血症の成因でのCETP遺伝子異常の占める割合は大であり、今後、

実際にヘテロ接合体を含めたCETP欠損症で動脈硬化症が少ないかどうかを 検討しなければならないと思われる。

V:結論

CETP欠損症ではヘテロ接合体においても血中リポ蛋白は抗動脈硬化的で あった。CETP遺伝子異常のスクリーニング法が開発され、わが国における 高HDL‑C血症の原因疾患としてのCETP欠損症の重要性が認識された。今後、

CETP欠損症で実際に動脈硬化が抑制されているかの検討が重要である。

References

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6)BisgaierCL,SiebenkasMV,BrownML,InazuA,KoizumiJ, NabuchiH,TallAR.Familialcholesterylestertransferprotein deficiencyisassociatedwithtriglyceride‑richlowdensity

lipoproteinscontainingcholesterylestersofprobableintra‑

cellularorigin．』・LipidRes、32:21．1991.

Tablel:

CONCENTRA･FIONSOFSERUMANDLIPOPROTEINLIPIDSANDCETPINFAMILYMEMBERSWITTICETP DEFICIENCy

；？：、

Valucsaremcan士SD．、.＄.．notsignifican【；、.｡.，notdcに『mincd；ANOVA幸an3Iysis⑥fvariancc． mpari nshcIwccngrOup5 w亡rcdcにrmin&dbyIhcBonferronif,mclhod

( A ） （ B ） （ C ） 間omozygouslIeにrozygouSUnafYecに。

(B)vs (C） (P）

(B)垢 (D） (P） (D）

ConIroI

A N O V A (P）

(A)vs (C） (F）

(A)応 (D） (P） Age(y応）58．7士5．5

Sex(M/F)1/5 Semm(mmol/1)

UneStCrined

t h o l . 2 . 0 7 0 5 4 Esにrificdchol．5．19士0．98 Triglyceridesl．62±0．75 PhosphoIipids4．36±0．91 VLDL(d<l.m,mmOl/i)

Un塵terified

cIml．025士0.18 ESにrifにdcho1．0．12士0．

T耐g睦而desO. 士O‑S3 Ph"PimlipidsO3210．18 IDL(1.唖く。＜1.012mmol/I)

U､霞teri画

choI．0. 士0．02 ESにrifiedchol．003士0．02 TrigI涯而des0．10±0.O4 PIEPholipidSO.08iO．03 LDL(1.019＜d＜1. 3.mmol/1)

Unesterified

choI．0.73士0．26 陸terifiedCho1．1．55士0．43 Trigi…『id壷 0.23士0．07 PImSphOlipidS 1.07士oS3 HDL(。＞I. 3.mmol/1)

Unesにrined

Chol．0．93士0．24 Eslerinedc胸1.3.28＋0．94 Trigl…rides0．10±0．03 Phospholipids2.83±0．63 CEIT("g/ml)0.OiO.0

51.5±14.532．9±15．5 5 / 5 3 / 5 ．

34.7士16．3＜0．01＜0．01，．s．＜0．01＜0．05 8/12

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＜0．05 1.35±0．23

4．24±0.71 0.95±0.49 2.97士0．43

1.07±0．14 3．16士0.23 0.72士0．35 2．41±0．20

1.01±0．16 3．41±0．40 0．91±0.26 2.37±0．34

１１ｌｍｍｍｍＯＯＯＯくくくく

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2.04±0.61 0.18士0.07 0.93±0．24

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Table2:

MOLARRATIOSOFLIPIDSINEACHUPOPROTEINFRACnON

Valuesaremean士SD.、.S.,notsignificanl;ANOVA.analysisofvariance.mmparisonsbeIwecngroupsweredelerminedby!he Bonfeu丁Oniルmeth

( A ） （ B ） （ C ） （ D ） Homo"gousHelero"gOusUnaffectedmntrol

ANOVA（A)vs.(C）（B)vs.(C）（A)vs.(D）（B)庵.(D）

( P ） （ P ） （ P ） （ P ） （ P ） VLDL(d＜1.m6）

EC/T℃0．19士0.170.38士0.l6 PL/UCZ.18i2.161.61i0.38 EC+TG/UC+PLI.89±0.281.76士0.27 IDL(1.唖く。＜1.019）

EC/I℃031i0.191.10±0.42 PL/UC158±0521.85±OS1 EC+TG/UC+PLI.03±0．181. ±029 LDL(1.019＜d＜1. 3）

EC/I℃7.16i25511.66±z31 PL/UC1.42±0.181.28士0.1O EC+TG/PL÷UCl. 士0．16132士0.10 HDL(d＞1． 3）

EC/rG40.39il7.9712.82±3.14 PL/UC3."±0.264.95＋0.69 EC+TG/UC+PLO.89±0．070．88士0．09

057士0．180コ9±0.24＜0.01 1.62±0. 1.88±0.48,.s、

1. 士0.391.84±031，．s．

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ＳＳＳ○◆今︑ｎｎ ふふｓｎｎｎ

1‑83±0.451.43±039＜0．m1 1.40士0.351.98± 6，．s、

132士0.22152±0.44＜0．05

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10.49士1.879.85±2.46＜0．01 1．20±0.肥138士0．16＜0．05 1．28±0. 1．43士0.12＜0． 1

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侭＄Ｓ◆●ｏｎｎｎ

Table3:

CORRELATIONCOEFFICIENISBETWEENCETP,ANDLIPIDCONCENTRATIONANDMOLARRATIOINEACH UPOPROTEINFRACrION

P

P 「

『

VLDL(d<1.N6) Unesterifiedchol･

Esterifiedchol.

Triglre㎡dcs PhospholipidS IDL(1."6<d<1.019)

UneSterifIedChOL Esterifiedchol.

Trigl"rides Phospholipids LDL(1.019<d<1．"3)

Unesterifiedchol.

Esterifiedchol.

Triglkcrides Phospholipids HDL(d>1."3)

Umesterifi choI，

陸Ierifi Cl麺1．

TriglWrides PhoSpholipidS

EC/rG PL/UC

EC+TG/UC+PL

恥郵型０００一一 １郵砺︑３３０００ 蛇巧弼妬４０５５●口●一００００一一一一 唾恥叱皿００００

唾蝿狸皿００００ののロ● EC/Tc

PL/UC

EC+TG/UC+PL

郡唖如●●●０００−一 皿加唖●●●０００

皿血麹００００

睡坤翠麺００００−一一 _EC/Tc

PL/UC

EC+TG/UC+PL

理迦０００

− 皿皿蠅０００

罪罪唖率００００

EC/T℃

PL/UC

EC+TG/UC+PL

９７２沼和昭ＱＱＱ一一 皿報０００ 油私邸芯００００●︒●の一一一 側皿唖唖●◆●●００００

Table4:

Hapiotypesofthecholesterylestertransferprotein(CETP)gene inCETPdeficiencyandthe、lapanesecontroIs

‑ ‑ ｰ 一 一 一 一 一 − 一 − ‑ 一 一 − 一 ● ｰ ｰ − − − − − − − − − − − − − − ■ ■ − − 一 一 一 一 一 一 一 一 一 − 一 一 一 一 − − − ー 一 一 一 ‐ 一 − 一 一 − 一 ‑ 一 一 ‐ ‐ 一 − 一

Haplotype Locationofpolymorphicsites AIIelesstudied TaqIABamHITaqIBStuICETP

Intmn2Intmn.9Intron9NDdeficienWContmIs

n = 1 0 n = 3 0

− − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − ｰ − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − 1 ■ ■ − − − − − − − − − 一 一 一 一 一 一 一 ‐ 一 一 一 一

＋ ＋ ＋ ＋ 2（6.7%）

I I + ‑ + + 1014(46.7%)

III ＋ ＋ 9(30.0%)

I V ‑ ‑ ‑ + ‑

｜ V ‐ 5(16.7%)

− − − − − 一 一 ロ ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ■ ■ ‐ ｰ − − − − − − − ｰ 一 一 − − − − − − − − − − − ■ ■ − − − − − − − − − − − − − − 一 一 ‑ 一 一 ‑ 一 一 ‐ ‐ 一 一 ‐

Aplussigndenotesthepl､esenceofthereStI､ictionsite.and aminussignitsabsence･ThelocationoftheStuisitewasnot determined(ND)．ControialleleswerethoseofcontroIsfromvarious regionsofjapan,andCETP‑genealleleswerethoseoffiveprobands ofthefivefamiliesstudied.Chi‑squareanaIVsisshowedasignificant associationbetweenhaplotypellandtheGoAmutationgenes(P=0.0068 fortwo‑tailedanalysiscomputedbyFisher'sexacttest).

Fig．1

ThesequenCs@fthe色汰@n14‑intrcnl4b@undary

@ft恥睡C蘆了Pgene

normal mutant

5'...CATGTCTCgtaagtg……￨3m5'...､CATGTCTCataagtg....3'

sequence

amplined

sequence ...CATGTCTCGTATGTG̲̲. .CATGTCTCATATGTG...．

…

制。＠I

Fig.2:

RapidDetectiOnMethodOfC冒了PDeficiencyDuetotheint『◎、

14SplicirigDe"ctwithMutagenicPrimerMediatedRestriction MapModificaticn

麹挽

識:蝿･鴬議§鱈:";.i"'.":§鰯総

■でざ征■

蕊 謹 韓

#灘蕊

鱗鋳

＊ 民 0 1 沙

NdeldigestionofthePCRproductsencompassingexonl4‑intronl4 boundaryoftheCETPgene・AfterdigestionwithNdel,thePCRI]roductsofthe

mutantalleleonlygeneratetwofragmentsofl38bpand47bp.LanelisnotemplateDNA intheassay．Normaisubject(lane6),heterozygote(Iane8,9,10).andhomo‑

zygote(1ane2.3,4.5,7)fortheG→Amutationweredeterminedbydirectsequencing.

Rightlane(N)isthemoleCularsizemarkerofdX/HincⅡ、PCRpl･oductsofa homozygoteforthemutation(iane5)Werenotcompletelydigested・showingdoubie bandsofl85andl38bp.AI1othel、predictedDNAfragmentof47bpwasnotclearonl;he a8arosegel.

一一ｅ一一１−︐Ｊ︑ノ︑ノ︑ノ︑ノー・皿一に一艶肥田Ⅲ過一Ⅲ−．１ｙ一︒︒︒︒・一ｅ−４ＡＣ一ｎＶｎＵハＵｎＵｎｕ−ｎ一︑一〃！Ｊ１ノーノー〃一．一十︾ｅ一ワハＵｎＵ︽ｂＲＵ−ｅ一︑ｕ一４今ＦＤ八︑穴ｂ一一ｔ一ａｑ−ｍ−此祀一″〃″Ｖ晩一

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3：

Distributi@nofCETPDeficiencyduetoalnt『◎nl4 SplicingDefectinJapan

Fig.

homozygote7fa heterozygotel2fe

milies milies