酵素反応を利用したγ-アミノ酪酸のマイクロプレートアッセイ：

酵素反応を利用したγ-アミノ酪酸のマイクロプレートアッセイ：

γ-アミノ酪酸生産性乳酸菌のスクリーニングへの適用

塚谷 忠之

樋口 智子

松本 清

Enzyme-Based Microtiter Plate Assay for γ-Aminobutyric Acid: Application to the Screening of γ-Aminobutyric Acid-Producing Lactic Acid Bacteria

Tadayuki Tsukatani, Tomoko Higuchi, and Kiyoshi Matsumoto

酵素反応を利用した

-アミノ酪酸のマイクロプレートアッセイ法を開発した。酵素にはGABaseを用い，最適反応 条件を確立した。酵素反応により最終的生じるNADPHを340nmにおける吸光度測定に供することで，

-アミノ酪酸濃 度を算出した。本法により，0.5～10.0mMの濃度範囲で

-アミノ酪酸の正確な定量が可能であった。また，乳酸菌 培養に用いるMRS培地を対象とした回収率も平均100.2%と良好であった。さらに，乳酸菌による発酵液中の

アミ ノ酪酸濃度を測定したところ，HPLCにより得られた値と良好に一致した。本法を

-アミノ酪酸生産性乳酸菌のスク リーニングへ適用したところ，

-アミノ酪酸高生産能を持つ乳酸菌を9株得ることができた。

1 はじめに

γ

-アミノ酪酸(GABA)は降圧作用をはじめ，様々な生 理作用を持つことが知られている。GABAによる降圧作 用は特定保健用食品としても認められており，GABAを 含有 す る食 品 の開 発 が活 発 化し て いる 。 食品 素 材に GABAを高濃度で付与する方法として，乳酸菌を用いた 発酵法が注目されている。自然界からGABA生産能の高 い乳酸菌を取得するには，大量の試料をスクリーニン グする必要がある。しかし，従来のHPLCを用いた方法 では，比較的長い測定時間を要するため，大量の試料 から乳酸菌をスクリーニングする手法としては現実的 でない。このため，GABAを迅速かつ簡便に測定でき，

しかも大量の試料を一斉に分析することが可能な手法 が望まれている。そこで，酵素法とマイクロプレート リーダを用いたGABA測定法の開発を行った。

2 研究，実験方法

2-1 GABaseによる酵素反応

本 法 で 用 い る GABaseは

-aminobutyrate glutamate aminotransferase(GABA-T) と succinic semialde- hyde dehydrogenase(SSDH) の 混 合 系 酵 素 の 総 称 で あ る。GABA測定における１連の酵素反応を下記に示す。

最終的に得られたNADPHを測定することで，GABA濃度 を算出する。

GABA-T GABA +

-ketoglutarate →

succinic semialdehyde + glutamate (1) SSDH succinic semialdehyde + NADP

+ H

O →

succinate + NADPH + H

(2) 2-2 マイクロプレートを用いたGABA測定法

96 ウ ェ ル マ イ ク ロ プ レ ー ト の 各 ウ ェ ル に 反 応 液

（ 30

g GABase ， 1.4mM NADP

， 750mM Na

SO

， 10mM DTTを含む80mMトリス塩酸緩衝液(pH9.0)）を90μl分 注し，これに試料（標準液，乳酸菌発酵液）を10μl 添加して測定を開始した。30℃で60分間反応させた後，

マイクロプレートリーダで340nmにおける吸光度を測 定した。

3 結果と考察

3-1 GABase反応条件の最適化

GABase反応条件の最適化を目的として，賦活剤であ るNa

SO

濃度，DTT濃度，補酵素NADP

濃度，

-ケトグ ルタル酸濃度，酵素量，緩衝液及びpHの検討を行った。

その結果，750mM Na

SO

，10mM DTT，1.4mM NADP

及び 2.0mM

-ケトグルタル酸を含む80mMトリス塩酸緩衝液 (pH9.0)を用いることにした。この条件下で，酵素使 用量を30

g/wellまで低減化することができた。また，

GABA濃度が0.5～10.0mMの範囲において吸光度(340nm) との間に相関係数0.999の良好な直線関係が得られた。

*1 生物食品研究所

*2 九州大学

3-2 MRS培地の影響と回収率

乳酸菌培養に用いるMRSの培地成分がGABase反応に 与える影響について検討した。表1に示すように回収 率の平均は100.2%であり，MRS培地成分の影響を受け ることなく，正確な測定可能であった。

表1 MRS培地中のおけるGABAの回収率

1 2.35 3.00 5.37 100.7

2 2.70 3.00 5.73 101.0

3 0.07 3.00 3.16 103.0

4 0.05 3.00 3.25 106.7

5 3.65 5.00 8.45 96.0

6 1.57 5.00 6.50 98.6

7 0.04 5.00 4.87 96.6

8 0.00 5.00 5.15 103.0

Medium 0.00 10.00 9.67 96.7

Mean 100.2

aCV(%) 3.4

a Coefficient of variation.

また，乳酸菌によるGABA生産にはMRS培地にグルタ ミン酸ナトリウム（Glu-Na）を高濃度に添加されるこ と が 多 々 あ る 。 そ こ で ， 10mM GABA 測 定 時 に お け る GABase反応に与えるGlu-Na濃度（0～10.0%）の影響を 検討した。GABase量が30

g/wellの場合，Glu-Na濃度 が2.0%以上で反応が著しく抑制された。一方，GABase 量 が 120

g/wellの 場合 ， わ ず か に 反 応 は 抑 制 さ れ る ものの，反応時間60分で測定は終了した。この結果か ら，高濃度（10.0%）にGlu-Naが存在する場合は，酵 素量を増やすことで対応可能であることがわかった。

3-3 実試料の測定と有効性の確認

本法の信頼性を評価するために，実試料に対する本 法とHPLCにより測定した値の比較を行った。乳酸菌に はGABA生産能の高い3株を用い，培養時間とGlu-Na濃 度をパラメータとして設定した試料を調整した。測定 の結果，本法とHPLCにより測定した値には良好な一致 が認められ，本法の有効性が確認できた（表2）。

表2 本法とHPLCによる測定値の比較

Present method HPLC Bias

Lactic acid bacteria Glutamate (%) (A) (B) (A-B)

Lactobacillus brevis 0.0 0.04±0.00 0.03±0.00 0.01

NBRC3345 1.0 0.64±0.02 0.62±0.00 0.02

2.5 1.49±0.04 1.56±0.02 -0.07

5.0 2.30±0.03 2.38±0.05 -0.08

Lactobacillus brevis 0.0 0.05±0.00 0.05±0.00 0.00

NBRC12005 1.0 0.65±0.02 0.64±0.03 0.01

2.5 1.45±0.03 1.49±0.06 -0.04

5.0 2.68±0.09 2.75±0.14 -0.07

Lactobacillus brevis 0.0 0.03±0.00 0.03±0.00 0.00

NBRC12520 1.0 0.65±0.00 0.71±0.05 -0.06

2.5 1.45±0.03 1.58±0.12 -0.13

5.0 2.09±0.02 2.05±0.08 0.04

(g/100ml) Sample

3-4 GABA生産性乳酸菌のスクリーニング

自 然 界 及 び 食 品 中 か ら 分 離 し た 乳 酸 菌 を 対 象 と し て，本法を用いてGABA高生産性乳酸菌のスクリーニン グを行った。GABA高生産乳酸菌として知られている

brevis

NBRC 12005のGABA生産量を基準としてスクリ ーニングを行った。

NBRC 12005のGABA生産 量は2.1mMであった。スクリーニングの結果，2.1mM以 上の生産能を持つ乳酸菌を9株得ることができた（図 1）。

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

0 100 200 300 400

菌株 No.

GABA 生産量 (mM)

図1 GABA生産性乳酸菌のスクリーニング

4 まとめ

酵素法とマイクロプレートリーダを用いたGABA測定 法の開発を行った。測定条件の最適化及びマイクロプ レートの使用による試料量と酵素量の少量化により，

コストを大幅に低減化することができた。本法は自然 界及び食品中からGABA生産能の高い乳酸菌をスクリー ニングするのに有効な手段となると考えられる。

5 掲載論文

Analytica Chimica Acta, Vol.540, p.293-297

(2005)