細管式等速電気泳動法による医薬品計測法の開発と 応用

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

細管式等速電気泳動法による医薬品計測法の開発と 応用

藤下, 修

https://doi.org/10.11501/3054298

出版情報：Kyushu University, 1990, 薬学博士, 論文博士 バージョン：

権利関係：

回 ‑

5 S d 

合 一

細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 に よ る 医 薬 品 計 測 法 の 開 発 と 応 用

藤 '‑:...::!"'7!:..̲

; : . ， ̲ 下

199 1 年

目 次

本 論 文 で も ち い た 主 な 記 号 ・ 略 語 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ‑ 1  序 論 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 3 

第 I章 医 薬 品 の 定 性 ・ 定 量 分 析 法 と し て の 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 の 基 礎 的 検討 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一

第 1節 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 と そ の 歴 史 的 背 景

にυRU

第 2節 分 子 量 推 定 の 方 法 と し て の 電 気 泳 動 法 一 一 一 一 一 一 一 一 一 第 3節 推 定 式 の 基 本 型 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一

第 1項 推 定 式 の 基 本 型 を 導 く 順 序 第 2項 移 動 度 の 算 出

第3項 基 本 推 定 式 の 誘 導

第4項 相 対 的 ス テ ッ プ 高 き へ の 変 換 第5項 そ の 他 の 定 性 指 標 と 問 題 点

第4節 βー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 定 量 分 析

1 0  1 2 

第 5節 ま と め

2 0   2 5  

第11章 定 性 指 標 と 分 子 量 ・ 分 子 体 積 と の 相 関 式 の 精 度 に 及 ぼ す 諸 因 子 一 第 1節 電荷 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一

第 1項 定 性 指 標 に 及 ぼ す 電 荷 の 影 響 第 2項 ゾーン p Hの 電 荷 へ の 影 響

第 2節 比 重 に よ る 分 子 体 積 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 3 1  第3節 van  der  Waals分 子 体 積 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 3 3  

第 1項 van  der  Waals分 子 体 積 の 計 算 法

第2項 van  der  Waals分 子 体 積 と 比 重 に よ る 分 子 体 積 と の 比 較

第4節 指 数 一一 一一一 一一一一一一 一一一一 一一 一 一 一 一 一 一 一 3 8   7 7  

つ]円己

第 1項 分 子 量 に か か る 指 数 第 2項 分 子 体 積 に か か る 指 数

第 5節 流 体 力 学 的 な 考 察 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ‑ 4 4  

第 6節 二 価 イ オ ン の 移 動 度 変 化 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ‑ 4 6  

第 1項 フ マ ル 酸 と マ レ イ ン 酸 の 移 動 度 変 化 第 2項 そ の 他 の 二 価 イ オ ン の 移 動 度 変 化

第 7節 相 関 式 の 定 数 aとbの意味 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 5 3  

第 1項 傾 き bの意味 第2項 切 片 aの意味

第 8節 まとめ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 5 7  

第 1項 オ リ ゴ ペ プ チ ド の pH‑hR^{曲 線}

第2項 ジ ペ プ チ ド と そ の 移 動 度 一 分 子 体 積 の 相 関 式

第 5節 β ー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 第 1項 セ フ エ ム 系 抗 生 物 質 の 移 動 度 と 分 子 体 積

第 2項 ペ ニ シ リ ン 系 抗 生 物 質 の 定 性 指 標 と 分 子 体 積

第 6節 ^βー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 と ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 生 物 質 ， カ ナ

マ イ シ ン と の 反 応 生 成 物 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ‑ 85 

第 1項 ペ ニ シ リ ン 系 抗 生 物 質 と カ ナ マ イ シ ン と の 反 応 生 成 物 第2項 セ フ ェ ム 系 抗 生 物 質 と カ ナ マ イ シ ン と の 反 応 生 成 物

第3項 βー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 と ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 生 物 質 と の 併 用 に お け る 問 題 点

第7節 ま と め 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 9 6   第111章 本 法 の 応 用 例 一 一 一 一 一

第 1節 カ ル ボ ン 酪 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 第 1項 カ ル ボ ン 酸 の pH‑h_R曲 線

第2項 個 々 の カ ル ボ ン 酸 の 式 の 係 数

第2節 有 機 系 イ オ ン 性 物 質 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 第 1項 有 機 系 イ オ ン 性 物 質 の 一 般 相 関 式

第 2項 二 価 の 有 機 酸 の pH‑RE^{曲 線}

第 3項 移 動 度 か ら み た 有 機 系 イ オ ン 性 物 質 の 分 子 構 造 の 特 徴 第 3節 ア ミ ノ 酸 一 一 一 一 一 一 一 一 一

第 1項 ア ミ ノ 酸 の 分 子 量 と 定 性 指 標 、hR 第 2項 ア ミ ノ 酪 と そ の 移 動 度 の 推 定 式 第4節 ペ プ チ ド

QUGU 

RU

にυ

:本言命 ~こでもちし-、 r-=..::l三な言己主ラ・回各言吾

6 3  

Ac  :加速度 (cm/s2) a  :相関式の係数，切片 b  :相関式の係数，傾き C  :濃度 (mo1/1) 

CL  :リーディングイオンの濃度 Cs  :サンプルイオンの濃度 CD  ^{:抵抗係数} (Table2‑4) 

C D•s .サンプルイオンの抵抗係数

CD.Cl  : C 1イ オ ン の 抵 抗 係 数

C A  :セフエム系抗生物質の加水分解物

C M  :セフエム系抗生物質とカナマイシンとの結合物

Dr  : drag流 体 力 学 的 抵 抗 (g・cm/s2) D:  :距離 (cm)

d&  :比重 (glcm3) 

72 

7 6  

7 9   diff.  : differential微 分 値

E  :電位勾配 (Vo/cm) 

EL  :リーディングイオンの電位勾配

Es  :サンプルイオンの電位勾配

F  :ファラディ一定数(96，487Cou1omb/mo1)  f  :摩擦係数

h  :ステップ高き

hL  :リーディングイオンのステップ高さ

hs  :サンプルイオンのステップ高さ

h_T  :ターミナルイオンのステップ高さ

hR  : hs/hL ^{(ステップ高きの比)}

:電流

IL  ^{:リーディンゲイ} 寸ンのゾーンに流れる電流

Is  :サンプルイオンのゾーンに流れる電流

K  ^{:電離定数}

Kc  :カウンターイオンの電離定数

Ks  :サンプルイオンの電離定数 k  ^:係数

L  :リーディングイオン M  :分子量 (g/mo1) 

町1 :移動度 (cm2Vo‑1s‑1

= 

(cm/s)/(Vo/cm)) 

ITl

o 

^{:絶対移動度}

ITll  :2価 イ オ ン が1価 の と き の 絶 対 移 動 度

ITl2  ^{:2価 イ オ ン の2}価 の と き の 絶 対 移 動 度

汀lC :カウンターイオンの移動度

1  総 括 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 9 8  

謝 辞 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 1 0 2   実 験 の 部 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 1 0 4   参 考 文 献 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 1 0 8  

研 究 の 対 象 と し た 。 そ し て 、 こ れ ら の 化 合 物 の 等 速 電 気 泳 動 の 測 定 結 果 を も ち いて 、対 象 と す る 化 合 物 や そ の 分 解 物 、 反 応 生 成 物 の 分 子 量 ま た は 、 分 子 体 積 を 求 め る こ と が 可 能 な 相 関 式 の 確 立 を 目 指 し た 。

ま た 、 こ の 方 法 を 医 薬 品 の 配 合 可 否 の 推 測 に 応 用 し 、 臨 床 上 、 βーラクタム 系 抗 生 物 質 と の 併 用 が 望 ま れ て い る 、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 生 物 質 と の 配 合 変 化 を 取 り 上 げ 、 本 研 究 の 有 用 性 を 検 討 し た 。

第 一 章 で は 、 医 薬 品 の 定 性 ・ 定 量 分 析 法 と し て の 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 の 基 礎 的 検 討 を 行 な い 、 ど の よ う な 定 性 指 標 、 お よ び 推 定 式 の 基 本 型 が 適 当 か に つ

第 三 工 毒 童 医 三 藻 さ 面 白 の 支 E : ' 性 ・ 定Z量 正 長 女 本 斤 ず 去 と して‑:O J来 回 乍 雪 王 に ミ 字 示 室 主 霊 会 弐 之 永 重 力 宇 去 CT.:>主走破室白勺 和棄さ言三f

第 1節 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 と そ の 歴 史 的 背 景

い て 述 べ た。

等 速 電 気 泳 動 法 Isotachophoresisの 名 駄 を 最 初 に 用 い た の は 1970年、

Haglundで あり、8)そ の 後Ever、aertsら に よ っ て も 用 い ら れ て い る09，10)その名 の由来は、 risoJがギリシャ語で「等しい」、rtachoJが「速度」という意味で、そ れに「泳動」という意味のrphoresisJを続けたものであり、「等しい速度で泳動す

8)  る」という特徴をよく表した名称と言える。

細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 そ の も の の 歴 史 は 新 し い が 、 そ の 原 理 は 古 く 、 電 気 泳 動 法 の 発 達 の 歴 史 に ま で さ か の ぼ る こ と が で き る 。 そ の 電 気 泳 動 法 は 二 つ に 大 き く 分 類 す る こ と が で き る 。 一 つ は 自 由 溶 液 に よ る 動 界 面 電 気 泳 動 法 で あ り 、 もう一つ は 支 持 体 を 用 い る ゾ ー ン 電 気 泳 動 法 で あ る 。

歴 史 的 に は 動 界 面 電 気 泳 動 法 が 古く、 そ の 原 型 は す で に1893年、¥rIhethamの 報 告 に 見 ら れ る 。11) 動 界 面 電 気 泳 動 法 は 、 分 析 法 と し て の 精 度 の 高 さ か ら 、

̲ 12‑14)  Konstantinovらによ る輸率の測定へと発展した。

一方 、 単 離 を 目 的 と す る 場 合 な ど、動 界 面 電 気 泳 動 法 の 対 流 現 象 を 防 止 す る 意 味 か ら 、 支 持 体 が 用 い ら れ る よ う に な っ た 。 1923年、 Kendallら に よ る 、 泳 動 管 へ の ゲ ル 充 填 の 報 告 な ど や 、15‑18)ろ 紙 を 支 持 体 と し た 多 数 の 報 告 が み ら れる。19‑23)

細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 は 、 前 者 の 動 界 面 電 気 泳 動 法 を 基 に 開 発 さ れ た 方 法 で あるが、24)細 管 を 用 い る こ と に よ り 、 対 流 現 象 が 防 止 さ れ て い る 。

本 装 置 の 分 離 管 に は 内 径O.5rnm、長さ 15cmの テ フ ロ ン 製 キ ャ ピ ラ リ ー 第 二 章 で は 、 定 性 指 標 と 分 子 量 あ る い は 分 子 体 積 と の 相 関 式 の 精 度 に 及 ぼ す

諸 因 子 の 影 響 に つ い て 、 電 荷、分 子 体 積 、 指 数 の 意 義 な どにつ い て 述 べ た。 第三章 で は 上 述 の 個 々 の 有 機 系 イ オ ン 性 物 質について、相 関式の 具 体 例、お よ び そ の 応 用 例 に つ い て 述 べ た。

4  ^民υ

チューブを使用した。 Fig.l‑lのaに 示 す よ う に 、 試 料 を 注 入 す る 前 は 、 試 料 注 入 口 を 境 界 と し て 、 リ ー デ ィ ン グ 液 と タ ー ミ ナ ル 液 が 接 し て い る。等 速 電 気 泳 動 法 で は 、 通 常 、 一 番 速 く 動 く イ オ ン と し て 電 解 液 ( リーディング液)に加 え る イ オ ン を 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン (L一)とし、通常、 一番 遅 く 動 く イ オ ン と して電解液(ターミナル液)に加えるイオンを、ターミナルイオン (T一)とする 。

試 料 注 入 口 よ り 、 マ イ ク ロ シ リ ン ジ に て 、 通 常 1μlから 10μiの 試 料 (例えば、 S1ーと S2の混合物)を注入する (Fig.1 ‑ 1の b)。 次 に 、 通 常 10  0 μ A程 度 の一定 の 電 流 を 流 す と 、 サ ン プ ル イ オ ン (Sl‑，S2‑)は 、 分 離 し 始

Detector  Injection  port 

?f 

L  T 

年

?? 

L 

l m ￨  

^T 

中

~科~

‑宇一 L  T 

め、 S1ーと S2ー の 混 合 ゾ ー ン の 前 に 、 分 離 し た S1のゾーン 、 混 合 ゾーン の 後 に 、 分 離 し たS2ーのゾーンを形成し始める (Fig.1 ‑ 1のc)。やがて、 S1 とS2の混合ゾーンは消失し、 S1 とS2ー に 分 離 し た ゾ ー ン が リ ー デ ィ ン グ イ オ ン と タ ー ミ ナ ル イ オ ン の ゾ ー ン に は さ ま れ て 、 細 管 の 中 を 連 続 し て 等 速 度 で 泳 動 す る 。 こ れ ら の イ オ ン の ゾ ー ン が 検 出 器 を 通 過 し 、 最 後 に タ ー ミ ナ ル イ オ

ン が 検 出 さ れ て 分 離 お よ び 検 出 が 終 了 す る (Fig.1 ‑ 1のd) 

こ れ ら の イ オ ン の 濃 度 は 、 等 速 で 泳 動 す る と い う 条 件 下 で はKohlrausch25) の式

c

^{s/ C L = (旦s旦L+ms旦c)/ (旦s旦L+mLm}で)により、下線部が分子、

分 母 と も 共 通 で あ る た め 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の 濃 度 CL (通常

o

^.0 1 mol) 

を 決 め て お け ば 、 サ ン プ ル イ オ ン の 濃 度Cs は 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の 移 動 度 mLと サ ン プ ル イ オ ン の 移 動 度ms と の 関 係 で 自 動 的 に 決 ま る 。 な お 、 m はカ ウ ン タ ー イ オ ン ( リ ー デ ィ ン グ 液 に 加 え る 陽 イ オ ン ) の 移 動 度 を 表 す 。

古 u

﹁﹄

U + 

T 

このKohlrauschの 式 は 、 次 の よ う に 導 く こ と が で き る 。 サ ン プ ル イ オ ン の ゾ ー ン に 流 れ る 電 流26‑29)1 

，

_s 

， =   E".C ，， (m ，， +m~)F/1000 とリーディングイオンの

‑s ‑s'̲"s  ̲"c  ゾ ー ン に 流 れ る 電 流 1L = E L

・

CL (m L + m c) F 11000は一定であるから、 Es

・

Cs

(m s+mc)=E L・

C

_L (mL +mc)。等速で泳動することから、 U(cm/s)=msEs=

mL E L = (cm2/V

・

^s)

・

^{(VI cm)。従って、 (E}L/ E s =) 

c 

_s ^(m _s ^+m c) / C _L ^(m _L +m c) 

= m  s/m しとなる。

分 離 管 と し て 細 管 を 用 い て い る こ と か ら 、 こ れ ら の ゾ ー ン の 境 界 面 の 検 出 に は 、 ジ ュ ー ル 熱 の 影 響 を 受 け に く い 電 位 勾 配 検 出 器 が 開 発 さ れ た 。30‑33)_{電 位 勾}

配 検 出 器 と は 、 細 管 の 中 に 存 在 す る 液 体 の 電 位 差(V

。

~)を測定し、その単位長さ

(cm)あ た り の 電 位 差 を 電 位 勾 配 値(V_o 

~/cm) として測定するものである。

^{34 ， 35)}

Fig. 1 ‑2のaは、電流がOの と き を 基 点 と し 、 そ の 基 点 か ら 測 定 き れ る 電 位 差 (V₀₎の 変 化 を 示 す 。 横 軸 の 矢 印 (0N)は 、 電 流 を 流 し 始 め た 時 を 示 す 。 等 速 電 気 泳 動 で は 、 一 定 の 電 流 (1 ) を 流 し て イ オ ン を 泳 動 さ せ る た め 、 各 イ オ ン が

唱 U

戸 市 U

一

^L 

  s i

^{1‑1 S2‑1} 

^{i f}  

a : before sample  injection  b : before isotachophoresis 

c : in  process of  isotachophoresis  d : after  isotachophoresis 

c u   n H  

o n  

‑ ‑ 0  

・ ・

・

Ae 

n i g  

ハu n v n u

‑I m‑

‑

a

ふ し

g s a   n n  

. ︐

E A

‑

‑

‑

噌a A

J u m  

2 u

‑ F a  

eηLe 

l s t  

‑ 句

EA

‑

L S T  

Fig. 1 ‑ 1 . Scheme of  the Process of  Isotachophoresis 

6  7 

均 一 の 濃 度 に な っ て 流 れ る と き 、 ゾ ー ン の 長 さ に 比 例 し て 電 位 差 は 大 き く な っ て行く。

従 っ て 、 同 一 の ゾ ー ン で あ れ ば 、 単 位 あ た り の ゾ ー ン の 長 さ (c rn)^に対す

る 電 位 差 (V0)の 増 加 分 、 す な わ ち 電 位 勾 配 (Vo _~/ cm)は一定になる。そこで、

電 位 勾 配 を 縦 軸 に と り 、 時 間 を 横 軸 に と っ て 記 録 す れ ば 、 Fig.1 ‑2のbのよ う に 、 同 ー の ゾ ー ン は そ れ ぞ れ 一 定 の ス テ ッ プ の 高 さ を 示 し 、 各 ゾ ー ン は 異 な っ た 高 き と し て 階 段 状 に 記 録 さ れ る 。36，37)

当 時 、 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 に よ る 定 性 分 析 に 関 し て は 、 次 の よ う な 考 え 方 が 主流となっていた。

一 つ は 、 『 電 位 勾 配 検 出 器 を も ち い た 場 合 に 記 録 さ れ る 電 位 勾 配 値 (potenti a 1  gradient : P G値 ) は 、 隣 接 す る イ オ ン と 目 的 イ オ ン と の 問 の 差 を 測 定 す る こ と に な る の で 、 隣 接 イ オ ン の 種 類 が 変 る と 、

PG

値 が 変 化 す る の で 、 定 性 の 指 標 に は な ら な いJJ38)というものである。

もう一つは、 『 リ ー デ ィ ン グ 液 の 電 位 勾 配 に 対 す る 試 料 ゾ ー ン の 電 位 勾 配 の

比 (EL/Es)

^(中略) .ET/E~ または E ~ _{L ‑ ‑ S  ‑ S}

/ E 

^f_し の い ず れ

。

^{ぅ t}

に し ろ 、 こ れ ら の 値 を 求 め る こ と は 、 装 置 に 付 属 し て い る レ コ ー ダ ー か ら は 直 接 で き な いJJ39)と い う も の で あ る 。 ( 注 : こ の 部 分 は 後 に 改 訂 削 除 さ れ た 。 ) こ れ に 対 し て 、 著 者 は 次 の よ う な 考 え を も っ て い た 。 す な わ ち 、 前 者 に つ い て は 、 電 位 勾 配 値 (PG値 ) と い う の は 、 あ る イ オ ン を 含 む ゾ ー ン の 単 位 長 さ あ た り の 電 位 、 す な わ ち そ の イ オ ン の 抵 抗 の 値 に よ る も の で あ る か ら 、 隣 接 イ オ ン と は 無 関 係 で あ り 、 定 性 の 指 標 に な り 得 る、というものである。なぜなら、

等 速 電 気 泳 動 は 、 電 流 (1 ) が 一 定 の 条 件 下 で お こ な わ れ る の で 、 こ の 電 位 勾 配 値 (

E 

) は 、 オ ー ム の 法 則

(I=E/R)

に よ り 、 間 接 的 に 試 料 ゾ ー ン の 電 気 的 な 抵 抗 (R) を 表 し て い る か ら で あ る 。 ま た 、 等 速 電 気 泳 動 で は 、 各 イ オ ン が 等 速 (crn/s)で移 動 す る こ と か ら 、 下 記 の 式 が 示 す よ う に 、 各 ゾ ー ン の 電 位 勾 配E (V 0/ c rn)は 、 溶 液 中 の イ オ ン の 移 動 度 (crn²/Vos)に よ っ て 規 定 さ れ る か ら で あ る 。

[Vo/crn= (crn/s) / (cm²/Vos) ] 

後 者 に つ い て は 、 試 料 ゾ ー ン の 電 位 勾 配 (E~ s ) は 、 そ の ゾ ー ン に 流 れ る 電 流 に 比 例 す る か ら 、 電 流 を 流 し 始 め た 時 、 す な わ ち 、 リ ー デ ィ ン グ 液 の 電 位 勾 配

(  E  L 

)を測定すれば、

EL/Es

^または

Es/E  L

は 、 レ コ ー ダ ー か ら 直 接 測 定 で き る と 考 え た 。

E 

(V o/cm)  ^{on H   QU} 

n  

‑ ‑ ︒ . ︑

.Aρし 日

n11g  o p n  

‑ I

m ‑

‑

気U

ふ し

g s a  

n u n u   .︐ EA

‑‑

‑

司畠A A u m  

免u

‑ F A

eηιe 

l s t  

‑

‑ t i

‑

TLQUTA  T 

S 2 

。

b  Sl 

L‑

a 

V _o 

↑

^(ON) 

Fig. 1 ‑2. Scheme of the Potential Gradient of  Isotachophoresis 

しかし実際は、 Fig.1‑2の よ う に レ コ ー ダ ー 上 に 現 れ る ス テ ッ プ の 高 き が 、 ど れ だ け の 電 位 勾 配 を 表 し て い る か は 不 明 で あ る 。 そ こ で 、 本 研 究 を 開 始 し た

8  9 

従 っ て 、 レ コ ー ダ ー 上 の ス テ ッ プ の 高 き が 、 実 際 に ど れ だ け の 電 位 勾 配 を 表 し て い る か 不 明 な 点 に つ い て は 、 サ ン プ ル イ オ ン の ス テ ッ プ の 高 き を リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の 高 さ と の 比 で 表 せ ば 解 決 で き る と 考 え た 。

ま た 、 ス テ ッ プ の 高 き が 、 間 接 的 に 試 料 ゾ ー ン の 電 気 的 な 抵 抗Rを表し、等 速 電 気 泳 動 で は 、 電 位 勾 配 が 移 動 度 に よ っ て 規 定 さ れ る こ と か ら 、 ス テ ッ プ 高 き(h ) と 移 動 度(m) の 関 係 式 、 お よ び 、 そ の 移 動 度mと、イオンの大きさ、

す な わ ち 分 子 量 (M) と の 関 係 式 を 求 め れ ば 、 ス テ ッ プ の 高 さ hか ら 分 子 量M を 直 接 推 定 す る 式 を 導 く こ と が で き る と 考 え 、 本 研 究 を 始 め た 。

第2節 分 子 量 推 定 の 方 法 と し て の 電 気 泳 動法

分 子 量Mと 電 気 泳 動 の 移 動 度m と の 関 係 を 式 で 表 し た 報 告 に は、1964年、

Joklによる、 m/Z

= 

a 

+ 

b/M1/2_{の式がある 。}40)Joklは、球状粒子の加速度 A c(cm/s2)=U2/2D・の式とストークスの抵抗力の法則^{1 ‑‑‑‑...  ‑ ̲. .  ‑ ̲. ‑‑4........，.. J. J   ‑ ‑ . ‑ ‑ .  ，.~} 0̲^‑r (g

・

cm/s2)= A~ ^W 

から、 U=(2A~D ・)

_{、 C‑l'}^1/2 = (2 _'‑ ‑ l ‑ r  ^{0・D̲)1/2 / W  1/2 = k} IW 1/2に よ り 、 移 動 度 に 対 し て は 分 子 量 の1/2乗が反比例するとした。 Uは速度(cm/s)、Zは電荷、 Di  は 距 麟(cm)、Wは質量 (g)、a、b、kは係数を表す。この考えは、 Edwardらの m 

= 

^(a 

+ 

b/M1/2) Z の式や、41)わが国の木曽らによるm

= 

^a 

+ 

b 1M 1/2の 式に応用されている。42，43)しかし、すべてのイオン性物質を、球状粒子として 取 り 扱 っ て い る た め 、 精 度 の 点 で や や 難 が あ る 。

この他に、 1966年、Offordは、44)ス ト ー ク ス の 法 則 の 、 速 度 に 対 す る 半 径ra 

の関係 U=Zx/6πr~n から、移動度 m と半径 (M

_a  ^{1/3)をm=kZ/M1/3、あ}

る い は 表 面 積(M2/3)との関係を m=kZ/M2/3と報告している。 xは電場の 強度、 ηは 粘 性 率 を 表 し て い る 。 し か し 、 球 の 体 積Vが 4/3 πr3で、あること から、半径 raは分子量Mの1/3乗 の 関 数 で は な く 、 分 子 体 積Vの1/3乗 の 関 数 で

1 0 

あ り 、 表 面 積 は 、 分 子 体 積Vの2/3乗 の 関 数 で あ る 。 分 子 体 積 に つ い て の 詳 細 は 、 第11章にゆずる。

こ れ ら の 報 告 は 、 ゾ ー ン 電 気 泳 動 法 に よ る も の で あ り 、 Offordが 表 面 積 で 表 し た 理 由 は 、 泳 動 物 質 と 溶 媒 と の 摩 擦 を 考 慮 し た も の で あ ろ う。Edwardらは、

移 動 度 と イ オ ン 半 径 と の 関 係 に は 、 摩 擦 係 数 を 取 り 入 れ て い る が 、45‑47)移 動 度 と 分 子 量 と の 関 係 に は 取 り 入 れ て い な い。41)こ の 点 、 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 は 、 細 管 の 中 に 電 解 液 以 外 の 充 填 物 を 含 ま な い た め 、 支 持 体 と の 摩 燦 係 数 を 考 慮する必要がない。

細 管 式 等 速 電 気 泳 動 と イ オ ン 分 子 量 の 関 係 は 、 木 曾 ら に よ っ て 報 告 さ れ た も のがある。48)し か し 電 荷 に よ っ て グ ル ー プ 分 け さ れ て お り 、 電 荷 の 異 な る も の に 対 し て 共 通 に 適 用 す る こ と が 困 難 で あ る 。 ま た 、 ゾ ー ン 電 気 泳 動 の 場 合 と 同 様 に 、 移 動 度 と 分 子 量 の 関 係 で 表 き れ て お り 、 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 の チ ャ ー トから得られるステップの高さ(電位勾配)をそのまま利用することはできない。

そ こ で 、 著 者 は 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 の チ ャ ー ト の ス テ ッ プ 高 さ か ら 直 接 、 分 子 量 あ る い は 分 子 体 積 を 推 定 で き 、 し か も 、 ど の よ う な 電 荷 の も の に も 対 応 で

き る 式 を 導 く こ と を 本 研 究 の 目 的 と し た 。

イ オ ン の 移 動 度 が 分 子 体 積 や 分 子 の 形 で 決 ま る こ と は 、 重 要 な 点 で あ る が 、 定 性 指 標 と し て の 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 の チ ャ ー ト の ス テ ッ プ 高 き が 、 イ オ ン 性 医 薬 品 の よ り 一 般 的 な 情 報 で あ る 分 子 量 に 対 し て 、 ど の よ う な 相 関 性 を 示 す か の 基 礎 的 検 討 を 本 章 で お こ な っ た 。 分 子 体 積 と 分 子 量 と の 比 較 に つ い て は 第11 章 で 相 関 式 の 精 度 と の 関 連 で 詳 し く 述 べ る こ と に す る 。 ま た 、 医 薬 品 を 分 類 す

る 名 称 は 分 子 構 成 が 基 に な っ て い る の で 、 第111章 で の 相 関 式 の 応 用 性 に つ い て も 、 分 子 体 積 や 分 子 の 形 を 中 心 に 述 べ る 。

1 1 

第3節 推 定 式 の 基 本 型

第 1項 推 定 式 の 基 本 型 を 導 く 順 序

細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 の 、 レ コ ー ダ ー の チ ャ ー ト に あ ら わ れ る ス テ ッ プ の 高 きhから、分子量Mを推定する式を導く前に、推定式の基本型について考察した。

第2節で述べたように、 Joklは 分 子 量Mと移動度mとの関係をm / Z = a + b / M1/2のように表している。40)しかし、「イオンの動きやすさ(移動度m)は、 与 え ら れ る ヱ ネ ル ギ ー ( 電 荷 Z) に 比 例 し 、 イ オ ン の 大 き さ ( 分 子 量 M) に反 比例する」と考えられ、式で表すならば、 m=a+bZ/M1/2_{とすべきである。}

第 1節 で 、 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 の 、 レ コ ー ダ ー の チ ャ ー ト が 意 味 す る も の に つ い て 、 チ ャ ー ト の ス テ ッ プ の 高 さ (

h 

) は 電 位 勾 配 (

E 

) 、 す な わ ち 間 接 的 に 試 料 溶 液 の 電 気 抵 抗 (R) を 表 し て い る と 述 べ た。そ し て 、 試 料 溶 液 の 電 気 的 な 抵 抗 は 、 溶 液 中 の イ オ ン の 動 き や す さ ( 移 動 度 m) に よ る も の で あ る こ

とが推測される。

従 っ て 、 イ オ ン 移 動 時 の 電 気 的 抵 抗 を 間 接 的 に 表 す ス テ ッ プ の 高 き hが、ど れ く ら い の 移 動 度mを 表 し て い る か を 示 せ ば 、 ス テ ッ プ の 高 さ と 分 子 量 の 関 係 を求めることができる。

し か し 具 体 的 に 、 ど れ く ら い の ス テ ッ プ の 高 き hが ど れ く ら い の 移 動 度mを 表 し て い る 、 と い う デ ー タ は 報 告 き れ て い な い 。

そ こ で 、 ス テ ッ プ の 高 さ か ら 分 子 量 を 推 定 す る た め に 、 次 の よ う な 順 序 で 基 本式を導くことにした。

1 ) 移 動 度mと 等 速 電 気 泳 動 法 の チ ャ ー ト と し て 表 さ れ る λテ ツ プ の 高 き h

との関係式を導く。

2) そ の 場 合 に も ち い た 移 動 度mの 値 と 同 じ も の を 使 っ て 分 子 量Mとの関係

1 2 

式を導く 0

3)つぎに、 2)と 3)で 共 通 に も ち い た 移 動 度mを 消 去 す る こ と に よ り 、 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 の ス テ ッ プ の 高 さ hと分子量Mとの関係式を導く。

第2項 移 動 度 の 算 出

1972年、 BeckersとEveraertsは、49) リ ー デ ィ ン グ イ オ ン に

C

1 ‑l(O.Olmol)、 p H調 節 の た め の カ ウ ン ターイ オ ン と し て イ ミ ダ ゾ ー ル を も ち い た pH7.05 の 条 件 で 、 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 に お け る カ ル ボ ン 酸 の ゾ ー ン 抵 抗 、 お よ び イ オ ン濃度 (mol/l) の 値 を 報 告 し て い る (Tab1 e 1 ‑ 1 )。この濃度は第 1節 で 述 べ たKohlrauschの式25)によって決まる値である。

Table  1‑1. Zone Resistance of Carboxylic Acids at  pH7.05 49) 

Acid  Zone  resistance  Concentration  (11κ・103)':~ ^(mol/l) 

Acetic  1.5821  0.0075 

2.  Benzoic  1.9711  0.0065  3.  Caprylic  2.3016  0.0059  4. Crotonic  1.8668  0.0068  5.  Formic  1. 2013  0.0087  6.  Pelargonic  2.3100  0.0059  7.  Isovaleric  2.3022  0.0064  8.  Adipic  1.3499  0.0042  9.  Maleic  1.2207  0.0042  10.  Malonic  1. 0831  0.0046  11.  Oxa 1 i c  0.9634  0.0049  12.  Pimelic  1.4228  0.0041  13.  Succinic  1.1946  0.0044 

(>:~ Beckers  and  Ever、aerts reported that  the zone  resistance 

(p : Q cm) was _th~ rec i proca 1 of the equ i va 1 ent  i on i c conductance  (入:Q ‑1 cm2) . 49)  However， the  rec i proca 1 of. the zone res i stance  is  the  specific  conductance(κ: Q ‑lcm ‑1).29) 

1 3 

こ の 電 荷 の 式 は 次 の よ う に 導 か れ る 。 解 離 度α =1 / ( 1 

+ 

[H +] 1 K)で あ る Maclnnesら(1923)26)に よ る κ=IZlrnC

こ れ ら の 値 を も ち い て 、 そこで、

またα =1  [H

勺

1K = e ‑2yと表すと y= 2. 303/2 (p H ‑p K)となる。

κは 比 伝 導 度 (specificconductance)、 から、

F /1000の 式 か ら 移 動 度mを計算した。

= 1 / 2  [( 1 + e ‑2y) 1 ( 1 + e ‑2y) + (1 + e ‑2y) 1 ( 1 + e ‑2y) 

J 

1 (1 

+ 

e ‑2y)  Cは 濃 度(mol/l)、Fは フ ァ ラ デ 一 定 数 (96，487Coulombl 

I 

Z 

Iは 電 荷 の 絶 対 値 、

y = tanh x = (e x ‑e ‑x) 1 (e x + e ‑X) = ( 1 ‑e ‑2x) 1  双 曲 線 開 数

mo 1)を表す。26) となり、

なお、

α=1/2[ 1 +tanh{2.303/2(pK‑pH)}]となる。

(1+e‑2x)であるから、

BeckersとEver、aerts49)が 泳 動 条 件 と し て も ち い た p H なお、電荷Zの値は、

(双曲正接)を表す。

hyperbolic tangent  tanh x は

Table1 ‑ 2のpKa値、50，51) お よ び 木 曽 ら の 示 し た 電 荷 の 式 、43) 7.05と

移 動 度m の 計 算 例 を 示 す 。 ゾ ー ン 抵 抗(11κ)が 酢 酸 を 例 に と り 、

こ こ で ¥ Z = 1/2 2: [ 1 + tanh {2. 303/2 (pK‑pH)}]に よ っ て 計 算 し た (Tablel‑2)。

濃 度(mole/l)が0.0075であるから、49)m =κx 1000/ I Z I C F = 

︑勺

u︑

AU  

句a

×  A

句EA

qL   OO  

Fh lu  

唱﹄ム

Acids 

Equation  Carboxylic 

Correlative  Some  Values  for 

Derivation  of  the  1‑2. 

for  Table 

( 1 /1 .5821 x1 03 ) x1 000  / ( O. 995xO. 0075x964 87) = 87 . 78x10 ‑5 (cm2 

I V  

os)と 以 上 の よ う に し て 求 め た カ ル ポ ン 酸 の 移 動 度mをTablel‑2に示した。

なる。

IICは カ ウ ン タ ー イ オ ン 移 動 度m と し て 計 算 し た 。 なお、 Table 1 ‑2に は こ れ ら の カ ル ボ ン 酸 の 分 子 量M、52)お よ び Beckers 

が 報 告 し た ス テ ッ プ の 高 さ h(cm)の 値49)も示した。

とEver、aerts h^e) 

28.1  34.0  40.0  32.6  21.6  39.3  36.0  25.2 

ms+mcであるが、27，28)この場合、

( イ ミ ダ ゾ ー ル ) で 各 イ オ ン に 共 通 で あ る た め 、 九グの

60.05  122.12  144.21  86.09  46.02  158.23  102.13  146.14  I Z I^C) 

なお、mは 正 確 に は 0.995 

0.999  0.993  0.996  0.999  0.992  0.995  1.980 

第3項 基 本 推 定 式 の 誘 導 21.6 

116.07  1.870 

20.4  104.06 

1.958 

ま ず 移 動 度m と ス テ ッ プ の 高 き h(c m)の 関 Tablel‑2の{直をもちいて、

18.0  90.04 

1.998 

係 式 を 求 め る と 次 の よ う に な っ た(r=0.981，pく0.01)。 26.4 

160.17  1.974 

[1‑1]  m=46+1197/h 

22.4  118.09 

1.962  pK^bJ 

4.757  4.212  4.894  4.698  3.752  4.955*  4.78  4.409  5.296  1.921  6.225  2.855  5.696  1.271  4.266  4.484*  5.424*  4.207  5.635  ma) 

87.78  80.97  76.86  81.97  99.26  76.65  80.08  92.32  Acetic 

Benzoic  Caprylic  Crotonic  Formic  Pelargonic  Isovaleric  Adipic 

Acid 

ぃ

2345678

108.1  Maleic 

9 

106.2  Malonic 

10 

109.9  Oxalic 

11 

90.00  Pimelic 

12 

100.5  Succinic 

13 

ま た 、 移 動 度mと 分 子 量Mと の 関 係 に つ い て は 、 Joklの ゾ ー ン 電 気 泳 動 法 に よる m/Z=a+bM‑1/2_{の式を基に、} Tab1 e 1 ‑2の 値 を も ち い て 求 め る と

[1‑2J  次 の よ う に な っ た(r=0.951，pく0.01)。

m 

= 

5 6 

+ 

2 5 8 I Z 1/ M 1/2  Electrophoretic mobility X 10⁵ (cm²・V‑1・^S‑l)，according to  the equation of MacInnes et al. ²⁶⁾ 

Values for pK^日)andpK，^串51)are from the literature. 

Absolute values of  the electric charge at  pH 7.05 are calculated from the equation of  Kiωet al. ⁴³⁾ 

Values of  molecular weight were taken from the literature.⁵²⁾ 

49) 

Values for the step height (cm) at  pH 7.05 according to  Beckers et al.  1・7，Monocarboxylic acids; 8・13，bicarboxylic acids. 

A則

的

︑りめり刀

1 5  14 

式1‑1と式1‑2に お い て 移 動 度mを 消 去 す る と 、 次 の よ う な ス テ ッ プ の 高 さ h と分子量Mの 関 係 式 が 得 ら れ た(r=0.962，pく0.01)。

1/2  1/h=O.0082+0.2134IZI/M  こ れ ら の 関 係 を 図 に 表 す とFig.1 ‑3のようになる。

[1‑3J 

ここで、 Table1 ‑2の ス テ ッ プ の 高 き hと分子量Mの 値 か ら 、 ス テ ッ プ 高 きhと分子量Mの関係式を直接求めると、 1/h=O.0084+0.2155 IZI/M1/2_{で 、 式} 1‑3と ほ ぼ 同 様 に な り 、 等 速 電 気 泳 動 法 の ス テ ッ プ の 高 さhか ら 直 接 、 分 子 量Mを 推 定 す る 式 が 誘 導 で き る こ と が 確 認 で き た 。

式 1‑3が ス テ ッ プ の 高 さ の 逆 数 の 式 で あ る た め 、Table1 ‑2の ス テ ッ プ 高 きh、分子量Mお よ び 電 荷Zの値をもちいて、次の式を求めた(r=0.971，p^く0.01)。

h 

= 

^{7 . 0 9 2} 

⁺ 

^{2 . 6 37M 1/2 /} I Z I  ^[ 1‑4J 

訂1

m =46+ 1197  1/ h  ( r 

= =  

0.981 ， P'く0.0002)

m =56+258 

I z l / M

^1/2 

(

γ =0.951 ， P < 0.0004) 

h  M 

l/h =0.0082+0.2134 

I z l / M

^l/2 

γ =0.962( ， P<0.0003) 

Fig. 1 ‑3・ Relationship among Mobility(m)， Step Height(h) and  Molecular Weight(M) of Ions 

1 6 

This chart shows that the correlative equation between the molecular  weight (M) and the step height (h) can be derived directly. These equa‑

tions were derived using the valu^白 inTable 1‑2(N = 13). IZI: Absolute  value of the electric charge. 

第4項 相 対 的 ス テ ッ プ 高 さ へ の 変 換

細 管 式 等 速 電 気 泳 動 に お け る レ コ ー ダ ー の ス テ ッ プ の 高 さ を 、 Beckersと Ever、aertsはm mで表現している。53‑55)しかし、ステップの高き hは、電流の 大 き さ 、 あ る い は レ コ ー ダ ー の 増 幅 機 能 に よ っ て 容 易 に 変 化 す る 値 で あ る 。56) そ こ で 分 子 量 な ど 個 々 の イ オ ン 固 有 の 値 に 対 応 さ せ る た め に は 、 基 準 物 質 と の 比 率 で 表 す こ と が 必 要 で あ る 。

基 準 と な る も の と し て は 、 ど の よ う な サ ン プ ル イ オ ン を 分 析 す る 場 合 で も 共 通 し で も ち い ら れ る も の が 望 ま し い^O 通 常 の 陰 イ オ ン 分 析 で は 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン と し て 、 常 に 完 全 解 離 の 状 態 に あ る CIーが主にもちいられる。著者は、

分 子 量 の 明 確 な こ のC 1ー の ス テ ッ プ 高 き を 基 準 と し て 、 サ ン プ ル イ オ ン の ス テ ッ プ 高 さ を 相 対 的 に 表 せ ば 、 電 流 の 大 き さ 、 あ る い は レ コ ー ダ ー の 増 幅 機 能 な ど 泳 動 条 件 に 影 響 き れ な い 結 果 が 得 ら れ る と 考 え た 。

ここで、細管式等速電気泳動図(lsotachopherogram)の実例をFig.  1 ‑4に示 す 。 基 準 と な る CIーをリーディングイオンとするために、

o. 

0 1 mo 1のHCl

を 電 解 液 と し て も ち い た 。 p Hは ア メ ジ オ ー ル で8.6に 調 整 し た 。 タ ー ミ ナ ル イ オ ン は 通 常 、 測 定 し よ う と す る サ ン プ ル イ オ ン よ り も 遅 く 動 く と 考 え ら れ る も の が 選 択 さ れ る 。 こ の 例 で は 、 サ ン プ ル イ オ ン と し て 酢 酸 イ オ ン (Ac  0‑) と、 βー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 一 種 で あ る セ フ ォ タ キ シ ム (CT X) を 測 定 し た た め 、 こ れ ら の イ オ ン の 等 速 電 気 泳 動 図 を あ ら か じ め 予 測 し て 、 O.

o 

1 molのβー ア ラ ニ ン ( β ‑A 1 a)を タ ー ミ ナ ル イ オ ン と し て 選 ん だ 。 p H は 水 酸 化 バ リ ウ ム で 11 .4に調整した。

具 体 的 な 電 気 泳 動 図 の 予 測 法 は 第111章 に 記 述 し 、 泳 動 条 件 そ の 他 は 実 験 の 部に記載した。

な お 、 図 中 の 炭 敵 水 素 イ オ ン (HC03‑)は 、 電 解 液 中 に 溶 け 込 ん だ 空 気 中

1 7 

，3‑.主Ja

Table 1 ‑2のh (F i g.  1 ‑ 4で は hs に 相 当 す る ) を 、 こ の 相 対 的 ス テ ッ プ 高 き

hR

に 変 換 し 、 分 子 量

M

と の 関 係 を 求 め る と 次 の よ う に な っ た 。

hR= O . 6 5 + 0 . 0 1  M/IZI  ^[1‑5J 

さ ら に 広 川 ら は 、 相 対 的 ス テ ッ プ の 高 き hR^を、酢酪(F^ig. 1 ‑4のAc 0‑)  な ど 移 動 度 お よ び p K値 が 明 確 な 物 質 を 内 標 準 物 質 h std と し て 補 正 し た 値 を 定 性 指 標 RE^値 = Es / E L = ( hs + 6 h ) / ( hL +ムh) : ratio of the  potential  gradient of sample  zone  to that of  leading  zone)と し て 提 唱 し ている。57‑59)従 っ て こ の R

E^はh

Rと 同 僚 に 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の ス テ ッ プ 高 さ に 対 す る 、 サ ン プ ル イ オ ン の ス テ ッ プ 高 さ の 比 の 意 味 を 持 っ て お り 、 よ り 正 確 な 定 性 指 標 を 必 要 と す る 場 合 に は 都 合 が よ い 。 た だ し 、 内 標 準 物 質 ( 酢 酸 ) と 反 応 す る よ う な 試 料 を 扱 う 場 合 に は 使 い づ ら い と い う 難 点 が あ る 。 の 炭 酸 ガ ス で あ る 。 微 分 値 (diff.) は 、 そ れ ぞ れ の イ オ ン の 電 位 勾 配 (PG 

potential  gradient) の 差 を 表 し た も の で あ る 。

そこで、 CIイ オ ン の ス テ ッ プ の 高 き hLを 基 準 と し て 、 試 料 イ オ ン の ス テ ッ プ の 高 さ h sを 相 対 的 ス テ ッ プ の 高 さ hR ^(= h s / h L :relative  step  height) 

と し て 表 し 、 こ れ を を 定 性 の 指 標 と し て も ち い る こ と に し た 。

己ω

一 一

︼

C‑

‑凶 ﹁U T  X 

第5項 そ の 他 の 定 性 指 標 と 問 題 点

一一 戸

﹄ じ

︼C

hミ

。

5  10 

Time (min)

一 一

¹⁵ 

そ の 他 の 定 性 指 標 と し て は 、 タ ー ミ ナ ル イ オ ン か ら 、 リ ー デ ィ ン グ 液 の 亀 位 勾 配 を 引 い た 値 を 基 準 に し た 、

PU

値 (potential unit  value: (h s ‑ h L) 

60) 

/(hT‑hL) 

^{)がある。}

奥 山 ら は 、 分 子 量 と チ ャ ー ト の ス テ ッ プ の 高 き ゃ 、 分 子 量 と

PU

値 と の 関 係 に つ い て 述 べ て い る061)し か し 、 こ れ ら の 関 係 式 に お い て は 係 数 が 示 さ れ て お

「 一 一 一 1 ‑ A c o ‑

I HCOi 

Fig.1‑4・TheIsotachopherogram of a s‑Lactam  Antibiotic， Cefotaxime (CTX) 

The va1ue of RE of CTX was calcu1ated according  to  the  fo110wing equations  RE=EJEL=(h.+.1h)1  (h_L + .1h)， .1h = [h_s'd ‑hLRE(std)]/[RE(std)ー1]，RE(std) 

=E.^引d/_EL=mL/m5ld=79̲08j42A=L865̲  _RE is  the  ratio of the potential gradient of the samp1e zone (E.)  to that of the 1eading zone (Ed， h. is  the observed step  height of the sample zone (CTX)， hL and h"d are the  apparent step height of the 'leading zone (CI‑) and  that of the zone of the internal standard (acetic acid)，  and m is  the absolute  mobility̲  The relative  step  height (h_R) was defined as h，/hL. 

ら ず 、 チ ャ ー ト の ス テ ッ プ の 高 さ は 、 泳 動 条 件 に よ っ て 不 規 則 に 変 化 し て し ま う値であることから、56)分 子 量 を 推 定 す る こ と は で き な い 。

この

PU

値 は 、 分 母 に 大 き な 値 (Fig.l ‑ 4の タ ー ミ ナ ル イ オ ン の ス テ ッ プ 高 さ ) を も ち い る た め 、 同 一 の タ ー ミ ナ ル イ オ ン を 使 っ た 条 件 で は 安 定 し た 値 を示す。60)し か し 、 タ ー ミ ナ ル 液 の 組 成 を 変 え れ ば 、 変 化 し て し ま う 値58，60)

で あ り 、 異 な る 測 定 条 件 下 で 、 デ ー タ の 比 較 が で き な い 欠 点 が あ る 。58)

1 8  ^1 9 

ま た 、 本 来 な ら ば 、 細 管 式 等 速 電 気 泳 動 の ス テ ッ プ の 高 さ は 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン ( 例 え ばClイ オ ン ) の チ ャ ー ト か ら 描 く 必 要 が あ る 。62‑64) しかし、

PU

値 は 、 タ ー ミ ナ ル イ オ ン の ス テ ッ プ 高 き

hT

と 、 サ ン プ ル イ オ ン の ス テ ッ

プ 高 さ hs の 両 方 か ら 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の ス テ ッ プ 高 さ hし を 、 共 に 差 し 引 い た 値 で あ る こ と か ら 、 分 子 量 と の 関 係 を 検 討 す る 値 と し て は 不 適 当 な 値 で あ る 。 こ の よ う に

PU

値 が 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の 電 位 勾 配 を 無 視 し た 理 由 と し て は 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の ゾ ー ン が 長 い た め に 、 当 初 、 リ ー デ ィ ン グ イ オ ン の ス テ ッ プ の 高 き を Oの よ う に 表 現 し た 図 が 、 一 般 に も ち い ら れ て い た か ら であろう。65)

こ の よ う な 背 景 か ら 、 分 子 量Mに 対 応 、 さ せ る に ふ さ わ し い 値 で 、 泳 動 条 件 に よ っ て 変 化 し な い 定 性 指 標 と し て hR、 ま た は そ れ を 補 正 し たR

E^値58)をも ち い て 、 分 子 量 と の 問 の 相 関 式 を 導 く こ と に し た。

第4節 βー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 定 量 分 析 F i g. 1 ‑5.  Isotachopherograms of  Cepha 10th i n 

こ の 試 料 量 ( 単 位 :μg) を 横 軸 に 、 ゾ ー ン の 長 さ ( 単 位 : m m ) を 縦 軸 に 取 り 、 検 量 線 と し て 表 す とFig.1 ‑6の よ う に 5‑‑40μgの 問 で 良 好 な 直 線 性を示した。

Y=.138X + 1.01  (r= 0.9999) 

細 管 式 等 速 電 気 泳 動 法 で は 、 分 子 量 の 推 定 と 同 時 に 、 対 象 と し た 試 料 の 定 量 分 析66)も 可 能 で あ る と 考 え ら れ る の で 、 対 象 と し た 試 料 う ち 、 βー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 に つ い て 、 定 量 性 を 検 討 し た 。 Fig.1 ‑5は 、 セ フ ァ ロ チ ン の 定 量 性 を 示 す 等 速 電 気 泳 動 図 で 、 プ ラ ン ク の 図 と 、 試 料 量5、 10、2 0 μ gの 場 合 の 泳 動 図3枚 を 並 べ た も の で あ る 。 試 料 量 の 増 加 に 伴 う ゾ ー ン の 長 さ の 増 加 が 定 量 性 を 示 し て い る 。

n u n u n u  

z d F U

守qJ

( E E )

￡

OC AW

‑

。 _{1 0   20  30} 

Sample size (μg) 

40 

Fig. 1 ‑6. Calibration Curve for Cephalothin 

2 0   2 1 

F i g. 1一 ? に 示 す よ う に 、 試 料 量 と ゾ ー ン の 長 さ と の 関 係 は 、 他 の βーラク タ ム 系 抗 生 物 質 ( セ フ メ タ ゾ ー ル 、 セ フ ァ ゾ リ ン 、 セ フ ァ ピ リ ン 、 セ フ テ ゾ ー ル、セファセトリル)についても、セファロチンと同様に良好な直線性を示した。

である。 Fig.1 ‑8 Aに 示 す セ フ ァ ロ チ ン の ゾ ー ン は 、 Fig.1 ‑8 Bでかなり 減少し、 Fig.l‑8 Cで は 完 全 に 消 失 し て い る 。 Fig.1 ‑8のA+B+Cは こ れ ら の 試 料 を 混 合 し て 泳 動 し た 場 合 で も セ フ ァ ロ チ ン の ゾ ー ン と 他 の 分 解 物 の ゾ ー ン と は 明 確 に 分 離 さ れ て お り 、 定 量 で き る 可 能 性 が あ る こ と を 示 し て い る 。

ム

10.0 

ト 一 一 一 一 一 ;

一 一

E E 

. . c :  

~ u

、

55.O  ...... 

ωロON Cefrne七azo1(CMZ)  ‑ A ‑ Cefazo1in(CEZ) ー@ー Cefapirin(CEP) ー0 ‑ Cef七ezo1(CTZ) 

一 口 一

Cepha1othin(CET) 

一・‑

Cephacetri1e(CEC)一 企 ー

。

^{Fig. 1 ‑8.} _Cep^I_h^s_a^o_l^t_o^a_t^c_h^h_i^o_n^p _a^her_nd^o _D^gra_e^m_g^s_r ^o_ad^f_a  ^M_tioⁱ_n^x _P^tur_r^e_o ^o_duc^f _ts 

2.5  5.0 

Sarnp1e  size  ( ドヲ

10.0 

Fig. 1 ‑7. Cal ibration Curves for Cephems  ^{試 料A(}溶 解 直 後 ) と 試 料C(溶解後 1 2 0日 の も の ) を 混 合 し て 泳 動 さ せ た 場 合 の 、 セ フ ァ ロ チ ン の 定 性 お よ び 定 量 のR S D値(96:relativestandard  F ig. 1 ‑ 8は 、 粉 末 の セ フ ァ ロ チ ン 製 剤 10 μ gを 、 注 射 用 蒸 留 水 に 溶 解 し

た 直 後 (Fig.1 ‑ 8のA)、 溶 解 後8日 間 を 室 温 で 保 存 し た も の (Fig.1 ‑8  のB)、溶解後120日 を 経 た も の(Fig. ^{1 ‑ 8のC)}、 お よ び 、 こ れ ら 三 つ の 試 料 を 混 合 し た も の(Fig.1 ‑8のA+B+C)の4枚 の 等 速 電 気 泳 動 図 を 並 べ た も の

deviation)をTable 1 ‑3に示した。

分 解 物 ( 試 料C)を 含 む 場 合 も 、 含 ま な い 場 合 と 問 機 に 定 性 、 定 量 共 に R S

D値 596以 下 の 良 好 な 結 果 が 得 ら れ 、 分 解 物 な ど が 混 在 し て い て も 、 前 処 理 を す る こ と な く 分 離 定 量 が で き る こ と を 示 し て い る 。

2 2   2 3