〈原著〉生体吸収性ナノファイバーPGAを応用した自家移植モデル（犬）における耳介形状軟骨の再生誘導

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(1)近畿大医誌（MedJKi nkiUni v）第38巻１，２号. 19∼2 7 2 01 3. 1 9. 生体吸収性ナノファイバー PGAを応用した自家移植モデル（犬）における耳介形状軟骨の再生誘導伊谷善仁近畿大学医学部形成外科学教室. 抄. 録. これまでの耳介形状軟骨の再生誘導の研究では，耳介特有の複雑な３次元形状を長期維持することは極めて困難であった．そこで本研究では，ナノテクノロジー技術を導入してポリグリコール酸（PGA）不織布の繊維径が播種細胞効率に及ぼす影響について検討を行った．さらに耳介形状を長期維持する目的で，細径 PGA にポリプロピレンメッシュを組み合わせて力学的強度を補強した複合型スカフォールド（平坦型および耳介型）を作製し，大動物（イヌ）自家移植モデルにおいて軟骨再生誘導能および長期形状維持について検討した．その結果，細径 PGA の繊維径が0 . 8 ∼7 m の場合，細胞播種効率が最も高いことが判明した．平坦型スカフォールドを用いた実験より，細径 PGA 不織布の繊維径が0.8 ∼3 m の場合，良好な力学特性を有する軟骨が再生誘導された．また，耳介型スカフォールドを用いた実験より，平. 繊維径が0 . 8 ∼3 m の細径 PGA 不織布を用いることにより，耳介軟骨の軟骨. 再生は促進され，長期の３次元形状維持も良好となることが判明した．ナノテクノロジー技術を導入して作製した細径 PGA 不織布は，耳介形成手術における新しいオプションとして，将来重要な役割を果たすことが示唆された． Ke ywor ds:PGA，ナノファイバー，耳介軟骨，再生誘導，自家移植. 緒. との親和性（接着性）が高く，軟骨再生誘導におけ. 言. る足場材料として長年の試用実績が知られている．. Ti s s uee ngi ne er i ngは，生解性ポリマーに細胞および成長因子を組み合わせて，臨床的に用可能な移植組織を再生誘導する技術であり，1 988 年. しかし一般に用されている PGA 不織布（ネオベール좲 ，平繊維径20 m）は，播種細胞サイズに比較して PGA 繊維径が大きく繊維間隔が広いため，. ．今日ま Vacant iらによって基本概念が提唱された웋 で，さまざまな組織の再生誘導が試みられてきた．. 播種細胞が PGA 繊維に接着することなく漏出し，. その中でも３次元. 形状を有する軟骨の再生誘導は，極めて困難で挑戦. て指摘されてきた웋 ．この問題を解決するため，本研 원 究では， PGA を本来の細胞外基質に近い微細構造を. 的な. もつナノファイバーに加工・形成する技術を開発し，. 組織の再生誘導，特にヒト外耳. 野の一つであり，未だに臨床応用可能な基盤. 細胞播種効率が極めて低いことが大きな問題点とし. 技術は確立されていない워 ．これまでの耳介形状軟骨の t i s s uee ngi ne er i ngの. 導入した．組織再生用の足場材料では，適応組織に. 基礎研究においては，PLGA，PGA，PCL，コラーゲン，ハイドロゲル（al ，pl ，f ） gi nat e ur oni c s i br i ngel. されるが，この点に関する報告は認められない．そ. などの生体内. 解吸収性の合成もしくは天然高. 子. より最適な材料形状や繊維径が存在することが予測こで種々の繊維径を持つ細径 PGA 不織布を作製し，i n vi t r oにおいて繊維径が細胞播種効率に及ぼ. を形状加工し，これらを播種細胞である軟骨細胞の. す影響について比較検討した．. 足場材料として試用した数多くの研究がなされてき. 一方，PGA は生体内における加水解が早い特性があり，そのために足場材料として力学的強度の不. た웍 ． 욹웋 웏 生体内. 解吸収性の合成高. 子において，PGA （ポリグリコール酸）は生体適合性に優れ，軟骨細胞大阪府大阪狭山市大野東3 77 2 （〒5 8 98 5 11 ) 受付平成2 4 年８月2 3 日，受理平成2 4 年1 0月1 1日. 足が課題であった．そこで，体内への埋入が可能で，すでに外科領域のヘルニア根治術や頭頚部領域の気.

(2) 2 0. 管再. 伊. 谷. に臨床応用され，その有効性と安全性が担保. 善. 仁. 京）で細胞数を算定した．. されているポリプロピレンを細径 PGA 不織布に組. 細径 PGA 不織布の作製. み合わせて力学的強度を補強した웋 ．このポリプロ 웑 ピレン補強による複合型スカフォールドを大動物. ナノファイバーの代表的な３つの製造方法とし. （イヌ）自家移植モデルに導入して臨床試用が可能な. て，静電紡糸法（エレクトロスピニング法），複合溶. 大きさと３次元形状を有する耳介形状軟骨の再生誘. 融紡糸法，メルトブロー法などが知られている．こ. 導を試み，i nvi voにおいて細径 PGA 不織布が軟骨再生能および長期形状維持に及ぼす影響について検. れらのナノファイバー製造法の中で，本研究ではメ. 討した．. た．溶融した PGA を，幅方向 1m 当り1 , 00 0 個前後材料および方法. 近畿大学の動物実験委員会にて実験計画の承認を得たのち，本研究を遂行した．実験動物ビーグル犬（3 0匹，６∼８週齢，雌，浜口動物，兵庫）を用いた．飼育環境は，個別ゲージ（室温2 3℃，湿度5 0％，1 2 時間明暗サイクル）で行った．飼育繁殖固形飼料 CD55 α（日本クレア株式会社，東京）を１日１回約3 0 0g与え，飲料用水は制限なく与えた．耳介軟骨細胞の採取全身麻酔では，1 2 時間以上の絶食後，キシラジン. ルトブロー法を用いて細径 PGA 不織布を作製しのノズルから高温・高速の空気流を作る押出機を用いて糸状に吹き出した．繊維状に伸された PGA をコンベアー上で集積し，その間に繊維同士の絡み合い及び融着を生じさせて，平繊維径が0. 5 m， 0.8 m，3 m，および 7 m のポリグリコロイドからなる細径 PGA 不織布を作成した．一方，平繊維径が2 0 m の従来径 PGA 不織布は，紡糸された筒編み布をニードルパンチ法により不織布化する方法を用いて作成した（図１）．それぞれの群（0 . 5 m， 0. 8 m，3 m，7 m，および2 0 m の５群）において，用した PGA 量は0 . 1g/2 5cm워 ，厚さは約3 00 m であった．細径 PGA 不織布における体積密度（0 . 10 ∼0. 1 4g/ ）および空率（90. 5 ∼9 3. 4 ％） c m웍 は，ほぼ一定の値を示した．一方，従来径 PGA 不織. 株式会社，東京）の殿部筋肉注射にて導入を行った．. 4. 4 ％）布の体積密度（0 . 2 3g/ ）および空率（8 cm웍 は，細径 PGA 不織布に比較して高値であった（表. 次に，ペントバルビタール（ソムノペンチル좲 ，0 . 4. １）．. （セラクタール좲 ，0 .1 5ml / kg，バイエルメディカル. / ml kg，共立製薬株式会社，東京）にて静脈麻酔で行った．投与は，半量投与から開始し，睫毛反射が消失するまで増量して十. な麻酔深度を確保した．そ. ポリプロピレンと不織布の複合化ポリプロピレンからなるシート状メッシュ（プロ. の後，耳介を切断し，耳介から皮膚，皮下組織，筋肉，軟骨膜を除去して耳介軟骨を採取した．採取軟骨は，2×2mm の大きさに細切し，Kl ags br unの方 . 3％コラゲネース（c 法웋 웒に従い，0 ol l age nas et ype ，Wor ）にて酵素処理 I I t hi ngt on，Lake wood，NJ （3 7℃，16 時間）を行った．ステンレスふるい（por e 00 m，アズワン株式会社，大阪）を用いてろ s i z e1 過した後，10％仔牛胎児血清（Fe t alBovi neSe r um，，MO）を含む FFBS，Si gmaAl dr i ch，St .Loui s （Ham sF1 2培養液 1 2，Gi bco，Gr andI s l and，NY）を用いて酵素反応を停止させた．Ca울울 ，Mg울 울不含リン酸緩衝液（Dul be c cos phos phat e buf f er ed s l and，NY）を用いて洗浄 s al i ne，Gi bco，Gr andI と遠心（４℃，2, 0 0 0r 0 ）を３回ずつ繰り返 pm，1 した．単離した軟骨細胞数の測定には，色素排除法を用いた．0 . 4％トリパンブルー液（Gi bc o，Gr and I s l and，NY）を用いて細胞を染色し，倒立顕微鏡（ModelTMS，Ni kon，東京）を用いて，手動式血球計測装置（ノイバウェル血球計算盤，エルマ，東. 図쏯 細径および従来径 PGA 不織布の走査電顕像表쏯. PGA 不織布の物理学的性状. Di ame t e r ( m) Vol ume de ns i t y ( ) g/ c m웍 Por os i t y ( ％). 0 . 5. 0 .8. 3. 7. 2 0. 0 . 1 3 0 . 1 0 0 . 1 4 0 . 1 1 0. 2 3. 9 1 . 2 9 3 . 4 90 . 5 9 2. 3 84 . 4.

(3) ナノファイバー PGA を用いた耳介形状軟骨の再生誘導. 21. リンメッシュ좲，繊維径1 2 7±5 m，厚さ0 . 5 1mm± 0 . 05mm，2cm×2cm，ジョンソン・エンド・ジョ. 10 0g （t を Ca울울 ，Mg울울 r af e r mi n，科研製薬，東京）不含リン酸緩衝液6 0l （Dul be c cos phos phat e -. ンソン株式会社，東京）を準備した．. に溶解し，ゼラチン微粒子 ds al i ne，Gi bco） buf f e r e 10mgを加えて静置（４℃，2 4 時間）した．. 細径（0 . 5 m，0 . 8 m，3 m，7 m）もしくは従来径（20 m）PGA 不織布を２枚のシート状メッシュに挟んで複合化した．5 -0 合成糸（プロリーン，ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社，東京）を用いて縫合固定し平坦型スカフォールドを作製した．. 実験쏯（i nvi t r o) イヌ耳介軟骨細胞浮遊液をピペットにて細径（0 .5 .8 m，3 m，7 m）もしくは従来径（2 0 m，0 ）不織布の上面から滴下し，細胞播種した． m PGA. 同様の方法を用いて複合化したスカフォールド. 軟骨細胞の最終播種濃度は1 0 0 ×1 0원個/ mlに調節. を，さらにヒト耳介形状に採形し，耳介型スカフォ. した．次に，不織布内部への播種細胞の接着効率を. ールド（長さ＝35mm，幅＝2 0mm，厚さ＝6mm）. 高めるため，フィブリン（ボルヒール좲，化学及血清. を作製した．特に耳介型スカフォールドの凸部（耳. 療法研究所，熊本）を散布した웋 ．フィブリンの散布 원. 輪および対耳輪）は，耳介の輪郭形状を維持するた. には，スプレーキット（ボルヒールスプレーキット，. めに複合化したスカフォールドを二重折りとして力. 化学及血清療法研究所，熊本）を用い，送気圧を0 . 75. 学的強度を高めた．耳介の凸部と陥凹部（ベースフレーム）を，5 0 合成糸（プロリーン，ジョンソン・. / 0 kgf c m워に調整し，細胞播種の直後に不織布から3 cm 離して散布した．フィブリン散布をしない群を. エンド・ジョンソン株式会社，東京）にて縫合した．. コントロールとした．細径および従来径 PGA 不織. 作製した平坦型および耳介型スカフォールドは，. 布における不織布内部の細胞播種効率を調べるた. エチレンオキサイドにてガス滅菌を施した．塩基性線維芽細胞増殖因子（b-FGF) 徐放化システムの作成. め，フィブリン散布後，さらに５. 後に不織布を2 . 5％グルタールアルデヒドで固定した．標本を２. 割して走査電顕および光顕（トルイ. ジンブルー染色）標本を作製して播種細胞の密度お. 徐放化システム웍では，塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の担体としてゼラチン微粒子を用した．1 0％ゼラチン水溶液0 . 2ml （等電点５，牛骨ゼラ. よび. チン，新田ゼラチン株式会社，大阪）をオリーブオ. を計測した（図２）．. ℃，１時間）しイル 5ml （40℃）に加え，静置（40 た．撹拌後４℃で冷蔵して粒子化し，さらにゼラチン周囲に付着したオリーブオイルをアセトン1 . 5ml にて洗浄した．得られた懸濁液を遠心. 離（４℃，. 5 , 00 0r （４℃ pm，５間）し，再度アセトンにて洗浄. 間静置し，その. 布を検討した．播種細胞密度の検討では，細. 径および従来径 PGA 不織布に設定した任意の3 0 領域における単位面積当たり（1 0웎 m워 ）の平. 細胞数. 実験쏰（i nvi vo) 平坦型および耳介型スカフォールドを用いて，細径（0 .5 m，0 . 8 m，3 m，7 m）および従来径（2 0 m）PGA 不織布が軟骨再生誘導および長期形. にて３回洗浄）した．冷蔵庫内（４℃）で１週間乾. 状維持に及ぼす影響について比較検討した（図３）．. 燥させて沈殿物であるゼラチン粒子を得た．次にゼ. いずれの群も，実験１と同様に，イヌ耳介軟骨細胞. ラチン粒子の架橋を行うため，ゼラチン粒子 1mg. の最終播種濃度は1 00 ×1 0 원個/ mlに調節した．次に，塩基性線維芽細胞増殖因子（b-FGF）徐を含浸. に対し，0.1％. pol yoxyet hyl ene sorbi t an ，25 ％ gl monool e at eを 1ml ut ar al dehydeを 5 l加え，撹拌（４℃にて2 4時間）した．溶液を遠心離（5 ,0 0 0r pm，５. 間）し，沈査のゼラチン粒子に. ne溶液を加え，常温にて１時間撹拌した．その gl yc i 後，蒸留水を加えて遠心離（5 ,0 0 0r pm，５間）を３回行い洗浄した．得られたゼラチン粒子に超純水を加え，70 m，3 0 m の順番でふるいに通した．直径30 ∼7 0 m のゼラチン粒子を回収し液体窒素で凍結させた．凍結真空乾燥したゼラチン微粒子（直径約10 m）は，エチレンオキサイドガスを用いて滅菌した．ゼラチンに b-FGFを含浸させるため，b-FGF. 図쏰 実験プロトコール（i nvi t r o).

(4) 2 2. 伊. 谷. 善. 仁. た再生軟骨の曲げ強度を測り，その平. ±標準誤差. を求めた．計測したデータは，One f ac t orANOVA を行った後，多重比較検定を行い，統計学的有意差を検討した．成. 績. 実験１：繊維径が細胞播種効率に及ぼす影響細径 PGA 不織布の中で，0 . 5 m 群では播種細胞が不織布表面に積み重なり，不織布内部には浸透していなかった．一方，従来径 PGA 不織布である2 0 図쏱. 実験プロトコール（i nvi vo). m 群では，播種細胞が繊維束周辺に散在性に布し，いったん不織布内部に浸透した播種細胞の多く. させたゼラチン微粒子を投与して，細胞・スカフォ. は不織布に接着することなく不織布より漏れ出し. ールド複合体に徐放化システムを組み合わせた．そ. た．これらの結果より，0. 5 m 群および20 m 群では，播種細胞は不織布の外部に布し，不織布内部. の後，細胞播種効率を高めるためにフィブリン散布を行った웋 ． 웑 耳介軟骨採取時と同様に，全身麻酔を行ない，耳. における細胞密度は有意に低いことが判明した（図. 介軟骨細胞を採取した個体と同一の個体に上記の処理を行った細胞・スカフォールド複合体を自家移植. 一方，0. 8 m 群，3 m 群，および 7 m 群では，播種細胞が不織布内部において比較的一に布. した．ポビドンヨード（イソジン좲，明治製薬株式会. し，有意に高い細胞密度が観察された．不織布内部. 社，東京）で消毒を行った．1 0 万倍希釈エピネフリン添加塩酸リドカイン（エピレナミン含有キシロカ. の細胞密度が最も低い群は0. 5 m 群であった．播種細胞密度および布より細胞播種効率を検討した. イン１％ E좲，アストラゼネカ株式会社，大阪）にて. 結果，細径 PGA 不織布の細胞播種効率は平. 局所麻酔の後に頭頂から側頭部に切開を加え，筋膜. 径が0 .8 ∼7 m の場合に高いことが判明した（図５）．. 間（浅および深側頭筋膜間）に細胞・スカフォールドを自家移植した．閉. は，5 0 合成糸（シグマ，東. 京）にて行った．移植後５および2 0 週目に標本を採取し，肉眼的，組織学的および力学的検討を行った．組織学的検討：採取した標本は1 0 ％ホルマリン固定した．エタノール系列により脱水してパラフィンブロックを作製し，ミクロトーム（ LEI CA SM2 0 00 R）にて厚さ 3 m で薄切した．染色は，HE 染色（一般性状）および Saf r ani nO染色（プロテオ. ４）．. 繊維. フィブリン散布が細径および従来径 PGA 不織布の細胞播種効率に与える影響について検討した．その結果，2 0 m 群においては，フィブリン散布により PGA 不織布内部の細胞密度が高まるが，細径 PGA 群におけるフィブリン散布の有効性は確認されなかった（図６）．実験２-１：平坦型スカフォールドにおいて細径 PGA 不織布が軟骨再生能および形状維持に及ぼす. グリカン産生能）を行った．力学的検討：再生軟骨の特徴である弾力性を客観評価するため平坦型スカフォールドを用いた再生軟骨の曲げ強度を測定した．Royらの方法웋 웓に従い，オートグラフ（AGI S，島津製作所，京都）のグリップ距離を 1cm に調整した．その後，標本（2 0 . 02mm/ mm×5mm）を台座に固定し，垂直板を0 s e cの速度で下降させて最大試験力を計測した．あらかじめ計測した標本の厚さから，曲げ強度を算出した（曲げ強度＝最大試験力/ 標本の厚さ）．標本の取り付けから試験が終了するまでの期間は，標本に生理食塩水を噴霧し，乾燥を防止した．統計処理播種細胞密度および平坦型スカフォールドを用い. 図쏲 PGA 不織布における播種細胞の布上段組織所見下段走査電顕像 0 . 5 m 群では，細胞が不織布の表面に留まり，内部に浸透していない．一方，2 0 m群では，細胞漏出を生じ，細胞播種濃度が低い．.

(5) ナノファイバー PGA を用いた耳介形状軟骨の再生誘導. 図쏳. 23. 細胞播種濃度図쏵 移植後５週目の平坦型スカフォールド上段肉眼所見中段組織所見（Saf r ani nO染色）下段組織所見の拡大像. 図쏴 フィブリン散布が細胞播種濃度に及ぼす影響図쏶. 影響移植後５週目における肉眼および組織所見：平坦. 移植後2 0 週目の平坦型スカフォールド上段肉眼所見下段組織所見（Saf r ani nO染色）. 型スカフォールドを用いた軟骨再生では，細径および従来径 PGA 不織布のすべての群において，移植. いて. 前の平坦形状は良好に維持され，白色で光沢を呈し. た．一方，従来型 PGA 不織布のプロテオグリカン産. た．特に0 . 8 m 群では，表面の白濁がより強く，厚く変化し，優れた弾力性が観察された（図７）．組織. 生は不. 学検討では，摘出した再生軟骨の標本に，Saf r ani n . 8 m 群，3 m 群， O染色を施した．その結果，0. フォールドを用いた再生軟骨における曲げ強度の力. および 7 m 群において Saf r ani n O染色陽性領域はスカフォールドの中央部から辺縁部に認められ. 響を調べた．その結果，移植後５週目に摘出した再. た．一方，0 . 5 m 群における陽性領域は，スカフォールドの上面に限局していた．特に0 .8 m 群では，. 一で良好なプロテオグリカン産生が認められ一で不良であった（図８）．. 力学的検討：オートグラフを用いて，平坦型スカ学試験を行い，細径および従来径 PGA 不織布の影生軟骨の標本では，0 . 8 m 群の曲げ強度は高値を示し，一方，0 .5 m 群では著しい低値を示した．さらに移植後2 0 週目に摘出した再生軟骨の標本では，. より厚く変化し，平坦型スカフォールドの上面およ. . 8 m 群および 3 m 群の曲げ強度は 8N 以上の 0 高値を示し，他の細径および従来径 PGA 不織布と. び下面はともにプロテオグリカンにて被覆されてい. 比較して有意に高い力学的特性が認められた（図. た（図７）．. ９）．これらの結果から，平坦型スカフォールドにお. プロテオグリカン産生量が著明に増加し，複合体は. 移植後2 0週目における肉眼および組織所見：移植. いて良好な力学特性を有する軟骨を再生誘導するた. 後５週目の肉眼所見と同様にすべての群において移. めの至適な PGA 不織布の平. 植前のスカフォールド形状とサイズは維持されてい. 8 m 群が最も m であることが示唆された．また，0. 高い力学強度を示し，組織学的評価の結果と一致し. た．組織学的検討より，細径 PGA 群の標本断面にお. 繊維径は，0. 8∼3.

(6) 2 4. 伊. た．. 谷. 善. 仁. 肉眼所見：耳介型スカフォールドを用いた軟骨再. 実験２-２：耳介型スカフォールドにおいて細径. 生の移植後５週目（図1 0 ）および20 週目（図11 ）に. PGA 不織布が軟骨再生能および長期形状維持に及ぼす影響. 標本摘出を行った．移植後５週目においては，細径および従来径 PGA 不織布の群において，肉眼的な差異は観察されなかった．一方，移植後2 0 週目では， 8 ∼3 m の範囲にあ PGA 不織布の平繊維径が0. る場合，耳介形状を有する軟骨の再生誘導が促進された．特に0 . 8 ∼3 m 群では，３次元ヒト耳介型スカフォールドの表面に白色色調や光沢が観察され，ヒト耳介特有の輪郭形状がより明瞭に表現された（図11 ）．組織学検討：移植後５週目の耳介型スカフォールドでは，すべての細径および従来径 PGA 不織布の群において，耳介の陥凹部（ベースフレーム）部に Saf r ani nO染色陽性領域を認めたが，凸部（耳輪および対耳輪）における陽性反応は不十であった．. 図쏷 平坦型スカフォールドを用いた再生軟骨の曲げ強度Ａ移植後５週目Ｂ移植後20週目 0. 8 m 群が最も高い力学強度を示し，組織学的評価の結果と一致した．. 移植後2 0週目において，0 . 8∼3 m 群では，耳介型スカフォールドの凸部と陥凹部を含めたすべての領域に軟骨形成が観察された．一方，0. 5 m 群および 20 m 群では，耳介型スカフォールドの表面に軟骨形成が観察されたが，スカフォールド内部は結合組織の増生が観察された．この結果，PGA 不織布に軟骨細胞を播種した場合，不織布の平. 繊維径が. 0. 8 ∼3 m において耳介軟骨の軟骨再生が促進され，３次元形状維持も良好となることが判明した（図）． 11 察ヒト耳介は，第一および第二鰓弓の小丘の癒合によって形成される．発生過程において癒合不全となった場合，複雑な耳介形状の異常と組織欠損が生じ，図쏙 쏢 移植後５週目の耳介型スカフォールド上段肉眼所見下段組織所見（Saf r ani nO染色）. その病態に基づき様々な耳介の先天性形態異常が報告されている워 ．これらの先天性形態異常の中で，小 월 耳症は耳介の大部の組織欠損を主徴とし，治療では自家肋軟骨を加工して耳介形状を模したフレームワークを移植する耳介形成術が定着している．近年，術式の進歩に伴い，比較的良好な形状再現が得られるところまで到達したが，広範な肋軟骨採取部位（第６∼第９肋軟骨），採取した肋軟骨の加工・採形に長時間かかる非効率的な手術操作，術直後の著しい部の疼痛，長期結果における移植肋軟骨の形状変化や再吸収，胸郭の陥凹変形および瘢痕など，多くの諸問題が残存し，それらは未解決のまま残されている．この問題を解決するため，耳介型多孔質ポリエチレンを移植する方法が提唱されたが，人工物であ. 図쏙 쏙 移植後20 週目の耳介型スカフォールド上段肉眼所見下段組織所見（Saf r ani nO染色）. るため生体親和性が低い欠点があり，術後感染や異物反応が大きな障害となっている워 ． 웋 耳介形成術における再生医療の応用の利点は，ド.

(7) ナノファイバー PGA を用いた耳介形状軟骨の再生誘導. 25. ナー採取部の犠牲を最小限にできることであるが，. 放出するため，局所の pH 上昇によって炎症が惹起. その手術結果が長期にわたり安定していることが重. され，過度の炎症は再生遅. 要となる．これまで，耳介軟骨の再生誘導では，主. すことが報告されている웍 ．一方，ナノファイバー 웑 웦 웍 웒 化された PGA では空率（単位体積あたりに繊維. に⑴播種細胞の選択웋 ，⑵軟 워 웦 웋 웍 웦 워 워 욹 워 웎と至適濃度워 웏 욹 워 웒 骨細胞増殖や細胞外基質産生を誘導するサイトカイン워 ，⑶細胞が増殖する足場材料（スキャホール 웓 욹웍 워 ド)웍 ，⑷耳介形状を維持する力学的強度웋 욹 웋 웏 웓 웦 웍 웍 욹 웍 웏の４要素に関する基盤技術を至適に組み合わせて再生. や組織破壊を引き起こ. が占める割合）が9 0 ％以上であり，PGA 重量は少ない．また，極細化により足場材料の生体吸収時間は短縮され，局所的炎症が生じにくいことが予測され. 誘導を試みた研究が数多く報告されてきた．一方，. る．今後の研究において，軟骨再生能と細径 PGA 不織布に由来する炎症反応について検討を予定してい. 再生誘導技術をヒトへ臨床応用するためには，免疫. る．. を有する大動物（自家移植モデル）において，臨床. 軟骨再生の領域では，これまでにエレクトロスピ. 的に必要なサイズと耳介特有の形状をもつ軟骨再生. ニング法を用いて作製した PCLナノファイバー. 誘導法の確立が急務であるが，その実験成績は未だ. （直径7 00nm）を用いた i n vi t r oの研究웍 웓やヒト小. に不良である웋 ．そこで本研究では，ナノテクノロ 월 웦 웋 웋 ジーを応用した足場材料の開発に焦点をって研究. 耳症軟骨細胞を PCLナノファイバーに播種した i n. を進め，大動物（イヌ）を用いた自家移植モデルに. vi voの報告웎 월がなされている．前者の報告では，子牛軟骨細胞をナノファイバーに播種した後に血清培. おいてナノファイバー技術を導入した新たな軟骨再. 地下に培養した場合は細胞増殖し，無血清培地下で. 生誘導法を開発し，その有用性について検討した．. は. 細胞周囲には，生体内の恒常性を維持する. 子集. 化誘導が生ずることを遺伝子発現の結果から証. 明した．さらにナノファイバー構造は，軟骨細胞の. 合体が細胞外マトリックスとして存在している．こ. 増殖・. の細胞外マトリックスは，高次の組織を構築する上. イバーの導入により，増殖―. で，重要な役割を担っており，マイクロサイズの骨. 御しうる可能性を示唆した．現在，ナノファイバー. 格とナノサイズの繊維で構成されていることが知ら. を応用した軟骨再生に関する基礎研究が進みつつあ. れている．ナノ∼マイクロサイズの混合繊維からな. る．しかし，大動物を用いた自家移植モデルへの応. るナノファイバーは，細胞外マトリックスに類似し. 用は未だに報告されておらず，その有用性について. たサイズと構造を有するため，生体組織の再生誘導. は未知の部. を促進する足場材料として至適であることが推測さ. 化過程の両方に促進的に作用し，ナノファ化間のスイッチを制. が多い．. これまでの大動物を用いた自家移植モデルでは，. れ，現在，再生医療，薬物徐放システム，医療器具. 足場表層において細胞増殖・. など多岐に渡る領域において次世代の生物工学的バ. された細胞外基質が足場中心部への栄養拡散を阻害. イオマテリアルとして注目されている．一般にナノファイバーは，繊維径が細いほど表面積は飛躍的に. ）こし，広範な中央壊死を引き起こす（e e ct dgee f f とが問題点として指摘されてきた웎 ．足場中央部 웋 웦 웎 워. 大きくなり，これにより細胞接着性が向上する特徴. が壊死した再生軟骨では，いったん足場材料が. が知られている．さらにナノファイバーの繊維間隔. 解・吸収されれば，その３次元形状の長期維持は極. が狭いため，細胞が繊維間でトラップされやすく，. めて困難となる．臨床応用を視野にいれた最終的課. 細胞は綱渡りをするように伸展してナノファイバー. 題は，この問題点を克服した上で，さらに長期的に. 上に接着するため細胞接着性がさらに高まったとす. ３次元形状をどのようなメカニズムで維持するか，. る報告もある웍 ．今回の実験（i 원 nvi t r o）では，従来径 PGA 不織布において最大の課題であった細胞漏. に関する技術開発である．今回の実験（i nvi vo）では，直径の異なる（0 .5 ∼7 m）ナノファイバー PGA からなる極細繊維集合体を新たな細胞供給源として. 出は，いずれの細径 PGA（0 .8 ∼7 m）群においても肉眼的には観察されず，不織布内部の細胞密度と布は良好に保持され，細胞播種効率は著しく向上. 化が進む結果，形成. 用い，これらをポリプロピレンと併用して力学強度を高めた２種類の複合型スカフォールド（平坦型お. した．一方，0. 5 m 群は繊維間隔が狭く，播種細胞は不織布外に集積した．この結果より，PGA 繊維径. よび耳介型）を足場材料として試用した．その結果，. と細胞接着性の間には相関があり，繊維径を調整す. まり，新生軟骨を経時的に足場材料の中央部から周. ることで細胞間隔が変化し， PGA 不織布内部の細胞濃度を制御できる可能性が示唆された．. 辺部に再生誘導することが可能となった．. 一般にポリエステル系の生体内子である PGA は，. 解吸収性合成高. 解の過程でグリコール酸を. 足場材料の中央部における播種細胞濃度は著明に高. 今回の自家移植モデルは中型動物であり，スカフォールドを移植する母床面積に制限があった．このため，移植床の大きさを. 慮し，成人ヒト耳介軟骨.

(8) 2 6. 伊. 谷. の大きさ（長さ＝約6 0mm，幅＝約30mm）に比較して，やや小型サイズ（長さ＝3 5mm，幅＝2 0mm）の耳介型スカフォールドを実験に用した．その結果，再生軟骨の力学強度は移植後2 0 週目において約 8N となった．これまでの報告によると，皮下組織内圧は 6N であり웎 ，獲得された力学強度によって，耳 웍 介型スカフォールド本来の３次元形状は長期間にわたり良好に維持されたと推測された．今後，成人ヒト耳介軟骨の大きさを有する耳介型スカフォールドを用いて同様な力学的強度が得られれば，本技術は３次元形状軟骨の再生誘導を臨床応用する上で有用な基盤技術になると. えられる．謝. 閲を賜わりました磯貝. 典孝教授に深甚な謝意を捧げます．文. 仁 s i ze dands hape daur i c l eus i ngamol d. 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