オキシトシン受容体遺伝子ノックアウトマウス作成
による受容体機能の解明
著者
西森 克彦
オキシトシン受容体遺伝子ノックアウトマウス
作成による受容脚
一一 一･､● ′ ヽ .L J qhL r 課題番号 09660070 ヽ ､■■■ヽ - .-■ し.ふ-メ i;'･:; '' ｢十 ′ ■ 111ー▼T1 1■¶■t-- ･ I-:一 一l ■ヽ . .-■ 1平成9秒平成1 0棚金:基盤研究(C脚酷幸
- --JL-I J 一一一1 ･ヾ一丸 もJ-I J<-.I, ･中一一-)ノ I研究代表者‡西森克彦
･B →･ ㌔. I;･=:二1-I-:- ∴警を_.
(東1脚
はしがき
-ノックアウトテクノロジーによる新しい遺伝子研究の展開一
遺伝子組み替え技術と発生工学の進歩により､外来の遺伝子を導入した動物肱を仮親
の輸卵管･子宮に戻し､そのまま発生を続けさせて遺伝子導入動物として取得する事が
可能となったふ一方未分化の幹細胞として全能性を維持しながら培養ができるマウス
Embryonic Stem Cell (ES Cell)細胞株の樹立と､動物細胞のゲノム上に於いてDNAの 相同組み替え(homologous re｡ombinotion)が起きることの発見､及び組み替えを起こ した細胞の効率的な濃縮法を含む応用技術の確立が､このトランスジェニックアニマル 作成技術と結びついて､いわゆるジーンクーゲテイング技術のめざましい展開を現臭の ものとした｡遺伝子ノックアウト動物作成実験は､特定の遺伝子を標的として人為的に その機能を破壊せしめ遺伝変異個体を作成できる技術であり､その遺伝子のin vivo (個体)における機能を直接明らかに出来るものである｡この技術の有効性故､近年に いたっては極めて多くの遺伝子のin vivoに於ける機能の一端がこの遺伝子ノックアウ ト手法によって明らかにされた｡またこの技術を含めた発生学の進展は動物個体の発生 と分化に伴う細胞系鱒を明らかにし､発生や分化など個体発生の各段階で重要な機能を 果たすことの予想された遺伝子や､細胞の増殖､発癌に関わる遺伝子とその産物である 蛋白質の機能解析が､遺伝子の変異した動物個体を直接用いることえで行えるようになっ た｡ 筆者はもともと､噂乳動物の生殖腺の分化発達と生殖細胞の分化､及び生殖機能の維 持等に関わる遺伝子の機能に興味を持って研究を進めて来たが､生殖に関わる遺伝子の ように動物個体の生存には必ずしも必須ではないにも関わらず､種の存続という生物の 本質的な機能に連なる遺伝子の解析にはジーンクーゲテイング法は極めて有効な必須の 技術と言える｡ 研究代表者は1 994-1 996年にかけてアメリカテキサス州ヒューストン市の Bdylor College of Medi｡ineのMdrtin M.仙tzuk博士のグループにおいて･生殖に
関わる遺伝子のジーンノックアウト研究に携わることが出来た｡ Mdrtin M. Motzuk博 士のグループはこの技術により､今までに主に噂乳動物の発生と分化､特にその生殖線 の分化や生殖サイクルの維持､生殖行動等に関係したTGトβ スーパーフアミリイーの メンバーを中心とする数多くのの成長因子遺伝子､ホルモン遺伝子及びそのレセプター 遺伝子の機能を明らかにしてきた｡ 筆者は博士の研究室において乳汁分泌と生殖行動､及び出産時の分娩開始に機能して いると考えられてきた下垂体性ホルモンのオキシトシン(oxytoCin)､遺伝子のgene kn｡Ck｡utプロジェクトを中心に幾つかの生殖関連遺伝子のgene knoCkoutプロジェクト に参加し､興味深い結果を得ることが出来た｡ 研究代表者は帰国後もMdrtin M. Motzuk博士の研究室で得たジーンクーゲテイング の技術を活用してマウスを材料とした本格的なmoleCulor genetiCs研究に携わること を決意した｡本成果報告書の本文<背景と研究計画>ではオキシトシン遺伝子のgene kn｡Ck｡ut実験で得られた興味深い研究結果について簡単に触れることとした｡この結果､ 対象としたオキシトシン遺伝子の機能は予想されていたものよtJも轟かに限定的である
との結果が得られた｡我々はオキシトシン遺伝子ノックアウトマウスから得られた表現 型が予想されていたよLJも轟かに少ない事実を観察し､オキシトシンの受容体である oTR遺伝子に付いても遺伝子ノックアウトマウスを作成してオキシトシン遺伝子と受容 体の的係についてよtJ辞細な研究を行いたいと思うに至tJ ､本研究の科研費への中幕を 行った｡研究期間に2年日に於いては初期の研究計画の大幅な見直しが宿われより複雑 ではあるが､発生の各ステージに沿って､さらに各体組織､器官ごとにより詳細な遺伝 子機能の解析が行える.･Conditionql knoCkout一一の手法によL)本計画を再編したが､その 経緯についても本文を参照されたい｡ 研究組織
研究代表者:西森克彦(勅脚
研究控貴 職 9年定 職1 0年度 計 研究発表 口頭発表 290千円 900千円 380千円 (1)学会蛙等Julia A. ELvin, Changning Yam, Pei Wang, KatsuMko Nishimori･ Michael Byme･ and Martin M･
Matzuk, Mo一ecular characterization of (the fo"k:le defects in) the growth differentiation factor
9-deficient ovaryl. MoI EndocrinoI (in press) ･ (1 999)
0.Nawa,A., NILShimori,K., Lin.P･, Yoshiyuki Maki,Y･, Moue,M･, Sawada･H･･ Toh･Y･･
Fum托aka,K., Shigehiko Mizutan和and Garth･LNicoIson,G･L･, submitted to Carw3er Rest
Turner metastasis-aSSociated human MTAl gene:始sequence ana∼sis and association w仙
￠anoer cell proliferation. (1 999)
Nomura,0., Nishimon,K., Nakabayashi,0･, Yasue,H･ & Mizuno,S･ IDetermination by modified
RT-PCR of transcript amounts from genes invo一ved in sex-steroid synthesis in chicken
organs including brain": J Steroid Biochem MoI BioL 67: 143-148 (1 998)
wakabayashi,N" Suzuki,A･, Hoshino,H･, Nishimoi,K. and Mizuno･S･ `The CDNA clonlng and
transient expression of a chicken gene encoding a follicle-stimulating hormone receptor':
Gene 197: 121-127 (1997)
Nomura,0., Nakabayashi,0･, Nishimod,K･ & Mizuno,S･ ￠The CDNA ctonLng and transient
(1)口頭発表 馬上賢輔､那浪明宏､水野玉樹､山本雅之､西森克彦､ r転移関連遺伝子MTAlの稔能解明｣ ､ 平成10年12月18日 西森克彦､ Martin.M.Matzuk rマウスオキシトシン遺伝子､およびGDF-9遺伝子の破頓によ る丙遺伝子機能の解析J日本比較内分泌学会大会､平成1 0年7月3 1日 西森克彦､馬上鷲輔､那波明宏､吉川史隆､山本雅之､水野重軌 r新規転移関連遺伝子MTAlとその機能｣ ､日本農芸化学会1 9 9 8年度大会､平成1 0年 4月1日
西森克彦､中島賢-､馬上賢輔､水野重臥那波明宏､ Jinwen m咽､ David F･Albertini､
T.Rajendra Kumar､ Naifang Lu ､ Martin M.Matzuk rGrowth Differentiation Factor-9は卵
巣における初期卵胞形成に必要である｣平成9年1 2月1 8日
西森克彦, Young,LJ.2, Guo,a"Wang,Z., Insel,T･R･, andMatzuk,M･M. rオキシトシンはミ
ルク射出にのみ必要であり､出産や生殖行動にとって必須ではない｣第7 0回日本生化学会 大会､平成9年9月24日
研究実績の概要:オキシトシン受容体遺伝子ノックアウトマウス作成による受容
体機能の解明 1. <背景と研究計画> -オキシトシンとオキシトシン:OT遺伝子欠損マウス作成一 晴乳動物の生殖に必須のホルモンとして理解されてきた脳下垂体性ホルモンのオキシ トシンは､僅か97ミノ軽の活性ペプチドからなるホルモンである｡オキシトシンの合 成とその活性が確認されたのは50年近く前の手である(1)｡近年マウスオキシトシンの 遺伝子はHara,Y.らによって単軌報告され(2)た｡即ち､ 125アミノ酸からなる前駆 体のneurophysinより9 7ミノ酸･ Cys-Tyr-He-Gln-Asn-Cys-Pro-LOU-Glyのオキシトシ ン活性ペプチドホルモンが切断され､血中に分泌され･ホルモン作用を示す｡オキシト シンの合成場所は､脳オキシトシンでは主に脳内視床下部のparaventdcular nudeus (PVN ;視床下部圭傍核)とsupraoptic nucleus(SON ;視交叉上核)であLJ･これら脳 オキシトシンは合成分泌された後､下垂体に移動し後葉より血中に分泌される｡ オキシトシンの機能としては主として噂乳動物の生殖に関わるものが知られ､噂乳動 物の出産の際の子宮平滑筋の収縮､乳汁分泌のための乳腺平滑筋の収縮に必須の機能を 持つものと理解されてきた｡保育活動時の授乳では､子どもの口唇による乳頭への刺激 に反応して脳下垂体よLJ血中に分泌されOTR (oxytocin receptor)の発現している組織である乳腺の平滑族に作用し､ミルク射出を誘導すること(3)が､また同じくOXT-Rを 発現している子宮平滑筋(endometnum)に作用し出産の際の子宮の収縮に作用している と考えられていた(3)｡またオキシトシンはこれ以外にも様々な生殖関連組轍の･例え ば雄精巣での発現(4)や､雌卵巣の黄体で生殖周期に同期して発現すること(5)･また朱 美外腫葉(trophectodem)に由来する胎児組臥例えば胎盤(6)や羊膜(7)等でも発現 することが知られており､精巣分化を含め､輔乳動物の雌雄両方において･生殖腺の分 化や発達､制御に関する作用､多くの生殖行動､保育行動における中枢神経系への作用 と役割が報告されてきた｡事実オキシトシン受容体: OXT-Rは子宮や乳腺の平滑筋だ
けでなく､脳内のLS(Iateral septum), Bl (basolateral amygdala), _AcP ( antedor cortbal
amygdala)と言った領域で発現しており､しかもその分布は動物種ごとに異なっている ことが知られている｡またテストステロンなどのステロイドホルモンによっても発現が 変動することも知られている(8)｡ 我々は先に､このオキシトシンの輔乳動物の生殖における機能を遺伝子欠損ミュータ ントによって明らかにするため､オキシトシン遺伝子欠損マウスを作成した(9)が･得 られたオキシトシン遺伝子欠矢のマウス雄heterozygote, homozygote共に外観や内臓･ 行動等全く異常は無く､生殖能力､行動等に関しても正常であった｡またオキシトシン 遺伝子欠損マウスの雌heterozygote, homozygote共に正常な出産を含む･正常な雌と しての生殖行動と能力を示したが､雌homozygoteから出産したすべての子マウスは出 産後24時間以内に全て死亡し､その原田はhomozygote母親マウスのmik射出不全の ためと結論された｡そしてこの研究は､これまでのオキシトシンの生殖機能に関する多
くの報告にも関わらず､オキシトシンがマウス雌個体のミルク射出にのみ必要不可欠な 役割を担っていることを示した｡ -プロスタグランジンF 2受容体遺伝子欠損マウスとオキシトシン受容体一 一万我々のオキシトシン遺伝子破壊マウス作成の括黒とは異なる報告が･プロスタグラ ンジンF 2受容体遺伝子欠損マウスを作成したグループから報告されている(10)｡彼ら の観察では､プロスタグランジンF 2受容体遺伝子欠損マウスでは･黄体からのプロゲ ステロンの分泌が出産間隙になっても低下せず･オキシトシン受容体遺伝子の発現とオ キシトシン受容体蛋白の両者に対して括抗散に働くプロゲステロンのために･オキシト シン受容体の発現が子宮平滑筋で誘導されず･結果として出産の遅延と流産が起きてし まうと報告している｡彼らの実験では､出産直前に卵巣を切除した場合･この子宮平滑 筋でのOTR発現が誘導され､正常な出産に至ることからもOTRが出産誘起に必須で あることを強く示唆するものであった｡このように､オキシトシン･及びプロスタグラ ンジンF 2受容体両遺伝子に対する遺伝子破壊マウス作成技術の応用による結果は･ oTⅣOTの関係に於いて､リガンドと受容体の果たす機能が異なる可能性が在るという･ 矛盾に満ちた艶明をもたらすこととなった｡ 2. <研究経過> -オキシトシン受容体遺伝子ノックアウトマウス作成一 ･平成9年度 先述したように､ホルモンであるオキシトシンとその受容体OTR(OTR)の矛盾した 機能の関係に観明を与え､併せてOTRの生体における機能を明らかにすることを目的 として我々はOTR遺伝子のKO-マウス作成プロジェクトを平成9年より開始した｡ 平成9年にはDNAデータベースにマウスのオキシトシン受容体遺伝子の塩基配列が 発表されたので､この配列を用いてプライマーを作成しPCRにて･マウス脳由来 cDNAよりマウスオキシトシン受容体cDNAを取得し､これを元に129SvEv系統のマ ウス由来ゲノミックライブラリよりオキシトシン受容体遺伝子のゲノミックDNAのス クリ 一三ンクを行い､得られた遺伝子配列を用いてhprt遺伝子をマーカーとした pGKhp〟MCAltkベクターに挿入し､クーゲテインベクタープラスミドを作成した｡ま たマウスES細胞(腫性幹細胞)として､ベイラー医科大学のAlan Bradley博士が作成 したABl.1細胞(ES cellLine)とフィーダー細胞のSTO細胞を入手した｡またマウスを 扱うための設備とシステム構築を行った｡ ･平成1 0年度 しかし､平成9年度末大阪大学医学部の木村正博士より新たな情報がもたらされ･ま た木村博士の協力が得られることとなったため､この研究計画を全面的に見直し･平成 10年度よtJ共同研究としてスタ-トすることとした(科研費申請の研究代表者･共同 研究者等には変更なし) ｡木村博士は世界に先駆けてヒトOTR遺伝子をクローニング し(ll)､また近年マウスOTR遺伝子を取得発表している(12)｡木村博士から得られた
情報とは､米国NIHの研究所を始めとする米国の独立した3つのグループでオキシトシ ン受容体遺伝子を破壊したマウスを作成しようとしたところ､何れの研究においても腫 発生の初期での死亡(early embryonic death)が確認されたという内容であった｡これら
の事実は､オキシトシン受容体は単なるリガンドのオキシトシンに対する受容体以外に 何らかの重要な未知の機能を擁していることを強く示唆したものであった｡我々はオキ シトシン受容体遺伝子の機能を腫発生の各ステージごとに解析し､また脳内での機能､ 平滑筋(子宮平滑岳)での機能をそれぞれ独立に解析するため､新しい技術である ucond稚ionaJ knockout(条件遺伝子欠損)lrの技術を導入して解析する実験計画を策定した｡ 即ち木村博士から得たマウスOTR遺伝子の^フ7-ジクローンである九m04(12.5kb
insen)と九m02(16.7kb insert)をもとに､これをcond托ionaJ knockoutを可能とする形で､
ES細胞に導入するためにクーゲテイングベクターをデザインした｡即ち､欠損させる オキシトシン受容体遺伝子の工手ソン2と3の遺伝子領域を大腸菌bacteriophage Pl のloxP配列で挟み込み､またES細胞での薬剤選択に用いる薬剤耐性遺伝子をES細 胞での組み替えを確認後､同.じくbactenophagePlのcre蛋白発現ベクター導入による creの一過性発現により取り除くため､ neo耐性遺伝子をもloxP配列で挟み込んだ構 造を持つ､複雑な構造を持ったクーゲテインベクターコンストラクト(全長18.5Kb)を 設計し作成を終了した(図1､ 2､ 3､ 4) ｡現在さらにこのクーゲテインベクターを
ES細胞であるABl ･1細胞にelectro poration法により導入し､ neomycin(G418)耐性細 胞をスクリーニング中である｡ ･平成1 1年度以降の計画 この"∞ndhnaJ knodQout(条件遺伝子欠損)-■を行うためには標的遺伝子がloxP配列を持 つターゲテイングベクターにより" floxp"配列に変換されたES細胞/マウスとともに､ 組織特異的な遺伝子破壊のためには適切な組織特異性を持ってcm蛋白を発現するマウ スが必要となる｡またstagO特異的な遺伝子破壊のためにはきわめて低いバックグラウ ンド発現とともに､外界からの薬剤等による誘導により全身の各組軌こ於いて高いレベ ルでのαe蛋白の構導がおこるマウスが必要となる｡ 我々は平滑妬特異的なオキシトシン受容体遺伝子の破壊のためにはSmmoth muscle α-adbl PrOmOterによるを用いた平滑妬特異的cre発現マウスの利用を予定している｡
このSmmoth muscle α-a血一 PrOmOterによるcre発現マウスは大阪大学遺伝情報実験 施設の三輪岳志博士がはば開発し終わっており､この発現マウスの提供を受ける予定で ある｡ またstage特異的な遺伝子破壊のためにはembryoの全身で一応に発現することの知 られている全身で一様に発現することの確認されているRosa26発現ユニット(13)に より核内受容体/cre変異蛋白との融合蛋白を発現させ､ステロイド誘導体でcre活性 を誘導すること中也来るシステムを導入したマウスを利用する予定である｡このシステ ムは米国テキサス州Houstonのベイラー医科大学のC.Brown博士がほぼ開発を終了し ており､博士からこのマウスの提供を受ける予定である｡
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図1
Restriction Maps of OTR Gene and OTR･KO Vector
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