走査型電子顕微鏡用試料作成のための第三ブチルアルコール凍結乾燥法

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(1)横浜国立大学理科教育実習施設研究報告(6). :. (1990). 1-9. 走査型電子顕微鏡用試料作成のための第三プチルアルコール凍結乾燥法* 佐藤嘉彦** ･田中利幸*** The. Alcohol -Butyl for BiologlCal. Tert.. Method. Scanning. Yoshihiko. Summary. : INOU丘and. alcohol. freeze-drying Their. microscope.. The. specimens, inferior ments. to. regard. produced. (1). we. dried. take. fixation. by. at pH. (2). dehydration. by. (3). replacement. with. (4). freeze-drying. drying. botanical. method. all botanical. are. new. with. for necessary. phosphate. alcohol. series. from. way. compare. the. dried. speci-. the. specimens. (Tab. 1).. greatly. electron. realized. each. buffer.. OsATAKE. (INOU宜&. alcohol. to become. scanning. tetroxide,. osmium. alcohol.. available. microscopy,. satisfactory. and. 1988). in future. results. the. further. some. although stable. for drying. from. almost. materials.. *横浜国立大学教育学部附属理科教育実習施設研究業績19号 **横浜国立大学教育学部附属理科教育実習施設(Manazuru tion, Faculty. to. no. accomplish-. critical-point. l%. and. 0.1M. tertrbutyl. to. intended. in. procedures:. tert.-butyl. is expected. the. any. electron zoological. to be. hardly. photographs. glutaraldehyde. with. have. drying. seem. have. we. with. exquisite. for. method. there. So,. method. most. 2.5%. pure. But. of scanning. recently. new. tert.-butyl. new. a. specimens. the. specimens.. tert.-butyl. specimens. improvements. the. 7.2-7.4. to. specimens.. the. developed. use. wide. acccording. the following. to. according double. by. TANAKA***. recently. biological. into. dried. dried. could. buffered. The. has. come. the botanical. specimens. And. mens.. method. to. have. (1988). of. Microscope. Toshiyuki. and. for drying. the critical-point. with. botanical. OsATAKE. specimens. Specimens. Electron. SAT6**. method. Freeze-Drylng. of Education,. Yokobama. ***横浜国立大学教育学部生物字数室(Department National University). National. Marine. Laboratory. for Science. Educa･. University) of. Biology,. Faculty. of. Education,. Yokohama.

(2) 2. 佐藤嘉彦･田中利幸. 生物試料を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察するためには,現在のところでは,試料中に含まれる水分をほぼ完全に除去する必要がある｡試料乾燥法には,臨界点乾燥法と凍結乾燥法が開発され利用されている｡特に臨界点乾燥法は,臨界点乾燥装置が数社から販売され広く普及し,試料の収縮が多少認められるものの,比較的良好な結果の得られる乾燥法である｡しかしこの乾燥法には,液化炭酸ガスなどの高圧ガスを使用するために,高圧ガス製造の許可を得なければならないことや,高圧ガス使用中の爆発事故が欧米で報告されている(井上,. 1989)など,研究者の安全に対する細心の注意が要求され. ている.一方,凍結乾燥法では液体窒素を用いる方法が確立されている(KATOH,1978, et al, 1980)｡この凍結乾燥法は試料の微細構造の保存だけでなく,生体内の構. OsATAKE. 成イオンの保持もできるなどの利点があるにも関わらず,液体窒素を使用することが伽となり,また臨界点乾燥法による試料と比べて試料の構造の保存においては大差がないことなどの理由から,この液体窒素を用いる凍結乾燥法は臨界点乾燥法ほどの普及をみていない(井上,1989)｡ところで,高い凝固点(25.5oC)と高い蒸気圧(25mmHg.20oC)をもつ第三プチルアルコール(tertrbutyl alcohol)の性質を利用した凍結乾燥法が近年開発され(井上･長 OsATAI(E,1988),動物試料では,臨界点乾燥法に優るとも劣らない良. 武,1987,INOU宜&. 好な結果が得られている(井上･長武,1987;. INOU丘&. OsATAKE,. 1988;井上･長武,1988;. 井上,1989)｡すでに,エイコ-エンジニアリング社で凍結乾燥装置ID-2も製造されている｡しかし,植物試料へのこの乾燥法の利用はまだ動物試料への普及に比べて少ないように思える｡そこで,第三プチルア)I,コール凍結乾燥法による植物試料と臨界点乾燥法による植物試料の構造的な保存の良否の比較を行い,第三プチルアルコール凍結乾燥法 SEM観察用の試料作成に当たり, の植物試料への適用についての検討を試みた｡また, 光学顕微鏡用の試料の固定に従来からよく用いられてきたFAAなどによる固定が行われている(例,. ZHOU. &. HARA,1988)｡そこで,通常SEM試料の作成に用いられているグ. ルタールアルデヒドと4酸化オスミウムによる二重固定とFAAによる固定での試料の保存状態の比較,さらに試料の脱水をエチルアルコールシリーズによるものと第三プチルアルコールシリーズによるものの比較検討を行った｡本論文では,これらの処理を組み合わせて作成されたSEM観察用試料の比較検討を行い, SEM試料作成の一助に供したい｡. 材料及び方法. 筆者らは,木本性ユキノシタ科植物の系統学的な研究を行っている｡そこで,アジサイ属のタマアジサイ1)とアマチャ2)の成業及びタマアジサイとエゾアジサイ3)の花粉粒を用いて,試料作成法の検討･比較を行った｡葉の試料は1989年10月に成熟した普通葉を採り,カミソリの刃で5mm四方程度の小片に切り,下記のように固定,脱水,乾燥の処理を行った｡花粉は1989年6月に採集し,アセトリシス(acetolysis)を行い,その試料を EtOHシリーズで脱水し,酢酸イソアミルに浸し保存しておいたものを,同年の10月から 1. 2 ) H. involucrata. ) Hydrangea らは,大場(1989)に基づいた学名). serrata. ∀ar.. thunbey:gil,. 3. ) H.. serrata. ∀ar.. megacaゆa.. (これ.

(3) 3. 第三プチルアルコール凍結乾燥法. 11月に下記の臨界点または凍結乾燥の処理を行った｡ Ⅰ.固定法 a.二重固定(グルタールアルデヒドと4酸化オスミウム) 0.1M燐酸緩衝液でpH7.2-7.4に調節した2.5%グルタールアルデヒド(室温, 時間)と1%4酸化オスミウム(室温, b.. 3. 2時間)で試料を二重固定した｡. FAA固定. FAA(ホルマリン10mR,酢酸5mR,. 70%エタノール85mR)に試料を2. 3日間(室. -. 温)浸し,固定した｡ ⅠⅠ.脱水法 a.エタノールシリーズ. 回転浸透器を用いて,. 300/., 50%,. 700/., 800/., 90%,. 液に各15分間浸し,つぎに100%エタノール(15分間,. 950/.の各エタノール水溶. 3回交換)でほぼ完全に脱水. した｡. b.第三プチルアルコールシリーズ第三プチルアルコール(TBA)と1000/.エタノール(EtOH),蒸留水(DW)を, Tab.. 1のように混合した脱水液Ⅰ. -Ⅴに順にそれぞれ約6時間,その後純粋なTBA に約6時間(2時間毎に3回TBAを変える｡)浸し,脱水した｡ 1.. Tab.. Components. of dehydration. solution (111〝). SOLUTION. TBA. DW. I. IO. 40. 50. ⅠⅠ. 20. 50. 30. ⅠⅠⅠ. 35. 50. 15. ⅠV. 55. 40. 5. V. 75. 25. 0. TBA ※. EtOH. :. tert.1butyl. Following. EtoH. alcohol,. the Sol. Ⅴ, there. :. should. DW.'distilled. 1000/. ethanol, be two. or. three. changes. water. teyi/butyl. of pure. alcohol. ※. The hours. materials in. our. were. immersed. in each. dehydration. solution. for. more. investigation.. ⅠⅠⅠ.乾燥法 a.臨界点乾燥法脱水後,酢酸イソアミルに浸し,臨界点乾燥装置(日立HCP-2)で,その使用法に従い,酢酸イソアミルを液化炭酸ガスで置換し,乾燥した｡ b.第三プチルアルコール凍結乾燥法井上･長武(1987)と井上(1989)によって紹介された方法に従って,次のよう. than. 6.

(4) 4. 佐藤嘉彦･田中利幸. に行った｡ 1.脱水の完了した試料中にEtOHなどが残らないように,回転浸透器を用いて,舵粋なTBAに60分(20分毎に3回交換)浸す｡ (今回の検査では,酢酸イソアミル中に保存されている花粉も凍結乾燥に用いたが,酢酸イソアミルのTBAへの置換も同様に行った｡) 2.試料とその試料が浸る程度にTBAを入れた管ビンを冷凍庫に入れる0 数分で凍結する｡). (TBAは. TBAの凍結した管ビンを入れ(蓋は緩 3.真空ポンプにつながったデシケ一夕に, TBAの量によるがほとんどの場合は, く締めて置く),排気する｡ 1時間以内で, TBAは昇華する｡. (TBAは真空ポンプのオイルを劣化させるので,モレキュラー. シープスなどを用いたトラップを考える必要がある｡) 4.. TBAが昇華した後20分ぐらい放置してから,真空を破り,乾燥試料を取り出し,蒸着作業にはいる｡. ※. 真空ポンプによる排気及び真空を破り大気圧に戻す作業は一気に行った｡. ⅠⅤ.観察上記の固定,脱水,乾燥の各処理を組み合わせて作成した試料を,エイコ-エンジ T-100走ニアリング社IB- 5型イオンコ一夕-を用いて,白金で蒸着し,JEOLJSM 査型電子顕微鏡で観察し,比較検討を行った｡なお,葉の表面構造は5kv,花粉は15 kvの加速電圧で,写真撮影を行った｡結. 果. 今回の葉の表面構造の検査では,向軸側の表面よりも背軸側の表面構造に,処理法の違いによると思われる相違が明瞭にみられたので,背軸側表面構造の比較検討の結果を中心に報告する｡ I.固定法. タマアジサイの葉をFAAによって固定し,SEM観察用の試料作成に通常用いられているEtOHシリーズで脱水し,凍結と臨界点の両乾燥法により試料を作成した｡二重固定を行いEtOHシリーズで脱水したのちに,凍結または臨界点乾燥を行った試料(Figs.2A, 2B)と比べると,次のように明瞭な相違が認められた｡. 凍結乾燥法により作成した試料では,葉の背軸側の表皮細胞はことごとく大きな損傷を受けて,観察に耐える状態ではなかった(Fig.1A)｡臨界点乾燥法で作成した試料では,表皮細胞の形は判るが,表面のへこみが激しく(Fig.1B),二重固定法を行った試料 (Figs.2A,. 2B)とは大きく異なった様相になっていた｡. FAAによる固定は,少なくとも葉の表面構造のSEM観察用の試料の作成には不向きのように思われる｡. 2.脱水法と乾燥法. タマアジサイの葉を二重固定法により固定し,. EtOHシリーズによる脱水またはTBA.

(5) 5. 第三プチルアルコール凍結乾燥法. Fig. 1.. Specimens. (abaxial epidermis. treatments. as. follows. A. fixation. by. FAA. →. and. dehydration osmium by. treated. by. of. leaf. in Hyd71angea. damaged. inL)Olucyata)greatly. by. such. ;. dehydration. ). EtOH. tetroxide this procedure. →. series -. by. EtOH. series. is partially. by. EtOⅢ. damaged. TBA. drying.. critical-point. dehydration. -. C. double TBA. -. series as. freeze. seen. at. drying. fixation. freeze. B.. fixation. by. FAA. by glutaraldehyde. drying.. (The. specimen. this figure.). シリーズによる脱水を行った｡通常用いられているEtOHシリーズ脱水の後に,臨界点乾燥を行うと,ほぼ自然の状態と変わらない観察ができた(Fig.2B)｡しかし,この脱水の後に凍結乾燥を行うと,同一試料でも部分的にFAA固定の試料と同じようにかなり構造 TBAシリーズ. 的な損傷を受けている試料もみられた(Fig.1C)｡また今回の調査では,. での脱水後に凍結乾燥を行うと,EtOHシリーズ脱水-臨界点乾燥の処理よりも良好な結果が得られることが多く認められた(Fig.2A)0. ■■ 汲‥ラ:讃:云.二::皇弓鑑三. _. 亙:'. Fig.. 2.. Good. treatments. A. double TBA by. (abaxial epidermis. specimens as. series. 二;.:::LT.. of leaf in LTydrangea. from. inuolucrata) obtained. such. follows;. fixation. freeze drying. EtOH. ■コL≡:玄. →. by glutaraldehyde B. double. fixation. critical-point. and. osmium. tetroxide. by glutaraldehyde. drying.. and. -. dehydration. osmium. by TBA. tetroxide. -. series. dehydration. -.

(6) 6. 佐藤嘉彦･田中利幸. 3.別の種の菓における試料作成. タマアジサイ以外の葉でも同様な結果が得られるか否かを調べるために,アマチャの葉で脱水法と乾燥法の比較を試みた｡二重固定-EtOHシリーズ脱水-臨界点乾燥という処理をしたものが,最も自然の状態に近く,最も安定した良好な結果が得られた(Fig. 3A)｡二重固定-TBAシリーズ脱水-凍結乾燥処理をしたものも同様な結果が得られたが,同一試料中で部分的に表面にへこみが認められるものもみられた(Fig.3B)0. EtOH. シリーズで脱水した後に,凍結乾燥したものは(Fig.3C),タマアジサイでの処理結果と同じであり,良好な結果はあまり期待できない｡以上の結果から,二重固定-EtOHシリーズ脱水-臨界点乾燥という処理(臨界点乾燥法)は殆どいつも良好な結果をもたらすが,二重固定-TBAシリーズ脱水-凍結乾燥という処理法(凍結乾燥法)ち,少なくとも葉の表面構造の保存には,良好なまたは"臨界点乾燥法〝以上によい結果を提供してくれる試料作成法である｡. Fig. 3. such. Specimens treatments. A. double. fixation. by glutaraldehyde. drying.. tion by. series. TBA →. ∀ar.. Smlata. thunbergii) obtained. from. follows,. as. critical-point. tetroxide. of leaf in Hyd71angea. (abaxial epidermis. B, double →. dehydration. TBA by. and. fixation. osmium. tetroxide. by glutaraldehyde. freeze. drying.. EtOⅢ. series. C. double →. TBA. -. and. fixation. freeze. dehydration osmium. by EtOⅢ tetroxide. by glutaraldehyde. →. dehydra-. and. osmium. drying.. 4.花粉の表面構造. 葉以外の構造に関しても,葉と同様な結果が得られるか否かについて,花粉の表面構造の保存状態の検査を行った｡花粉は葉の表皮細胞などとは異なり,スポロボレニン (sporopollenin)からなる非常に安定した硬い外膜(exine)がその表面を覆っていることがよく知られている｡酢酸イソアミル中に保存し,臨界点乾燥法で乾燥させたタマアジサイの花粉を,酢酸イソアミルをTBAに置換し凍結乾燥法により乾燥させたタマアジサイの花粉と比較した｡臨界点乾燥したもの(Figs.4A,. -. sereies. 4B)ち,凍結乾燥したものも.

(7) 7. 第三プチルアルコールi東結乾燥法. Fig. 4.. Pollen. of Hyd71angea. grains. A, B. Pollen. grains. -drying. method.. (arrow. in D).. inuolucrata.. dried by critical-point. Some. grains. are. damaged. C, D. Pollen. drying. method.. during. the drying. due. to the. grains. dried. freeze. by. freeze-drying. method. (Figs.4C, 4D),構造の保存に関しては共に良好な結果であった｡しかし,凍結乾燥をしたものでは,ときたま割れた花粉が混在して観察された(Fig.4D)｡酢酸イソアミル中に保存しておいたエゾアジサイの花粉でも,酢酸イソアミルをTBAに置換し凍結乾燥したときには,クマアジサイと同様に壊れたものがみられた｡考. 察. FAAによる固定は,今回用いた葉の表面構造の保存には適さない｡しかし,この固定 & によって作成した茎頂のSEM観察用の試料では良好な結果を得ている(ZHOU 1988)｡茎頂と今回用v)た葉の組織学的･細胞学的な相違として,茎頂構成細胞には大き. HARA,. な液胞はほとんどないこと,この組織中には細胞間隙はまず存在しないことが挙げられる｡またこの固定を行いパラフィン切片を作り,実の組織を光学顕微鏡で観察したとき. には,ほぼ自然の状態に近い観察ができる(佐藤,. 1989)｡この光学顕微鏡用の試料の作成. には脱水後の減圧や大気圧に戻す作業を行っていない｡. SEM観察用の試料の作成過程で. の乾燥処理中に,今回用いたFAAで固定した試料は大きな損傷を受けたものと思われる｡.

(8) 8. 佐藤嘉彦･田中利幸. 大形の液胞を持つ細胞や多数の大きな細胞間隙を持つ組織のSEM観察用試料の作成には ,FAAを固定液として用いても,よい結果を期待することはできないであろう｡今回の比較検討の結果でも, SAT6 & TANAKA(1989)の結果からも,二重固定-EtOH シリーズ脱水-臨界点乾燥の処理(臨界点乾燥法)によっていつでもかなり良好な結果が得られる｡しかし,タマアジサイの葉では,二重固定-TBAシリーズ脱水-TBA凍結乾燥の処理(凍結乾燥法)をしたとき,さらに良好な写真を撮影することができた｡動物試料の作成では,凍結乾燥を行う前にEtOHシリーズ脱水をすることが,一般的な手順になっているようである(井上,1989)｡しかし,植物試料ではTBAシリーズによる脱水の方がよい結果に結び付くことが多いと思われる｡今回の検査ではTBAシリーズ脱水にかなりの時間をかけたが,これは光学顕微鏡試料の作成の手順に従ったためであり,もっと時間の短縮を図ることは可能であると思われる｡しかし,アマチャでは,この"凍結乾燥法"で作成した試料は"臨界点乾燥法クで作成した試料よりも劣っていたことを明記しておかなければならない｡次に,今回は乾燥法の比較しかできなかったけれども,花粉のように非常に硬い外膜を持つ試料では,表面構造の保存に関しては,. lt凍結乾燥法"もtt臨界点乾燥法"と同じ. ように良好な結果が得られた｡凍結乾燥を試みた試料では若干試料の破壊がみられたが, これはTBAへの置換が不十分であったか,減圧または大気圧に戻す作業を一気に行ったためと考えられる｡以上のような検討の結果から,. SEM観察用試料の作成のために従来から行われてきた. "臨界点乾燥法〃の手順を経て作成された試料は,安定した良好な結果をもたらすが, 二重固定-TBAシリーズ脱水-凍結乾燥の処理(凍結乾燥法)に従って作成された試料は,それ以上の良好な結果をもたらす場合がある｡ただ,この"凍結乾燥法"では,植物試料に関する今回の検査からは,満足できる安定した結果を常時得るまでにはいたらなかった｡しかし,脱水過程の改良･短縮など乾燥作業前の作業並びに串乞燥作業中の減圧や大気圧に戻す作業を徐々に時間をかけて行うなどの改良を行うことによって,従来の"臨界点乾燥法"をしのぐSEM観察用の試料作成法に,. "凍結乾燥法"を進展させるこ. とができるものと期待できる｡そのため,割断試料に関しての臨界点乾燥法との比較研究も,植物試料でできるだけ多く早い時期に成されることが望まれる｡特に,液化炭酸ガスや液体窒素を使わず,臨界点乾燥装置がなくても,試料の作成ができることは,第三プチルアルコール凍結乾燥法の大きな利点である｡本研究には平成元年度の教育研究特別経費｢電子顕微鏡を利用した教材開発のための総合的研究｣. (研究代表者:松田忠男教授)の一部を利用させていただいた｡ここに感謝. の意を表したい｡ ≪付記≫ 凍結乾燥装置ID-. 2凍結乾燥 2を販売しているRMC-Eiko社の好意により2日間ID1 ID装置を使う機会を与えていただいた｡ 2には減圧や大気圧に戻す作業を調節する微調整リークバルブも付いているが,借用期間が短かったために十分比較検討する試料を作成することができなかったのは残念であった｡凍結乾燥の作業は手際よくできるように設計されており,短時間で試料のよい乾燥ができる｡ただ,装置が大形で,この乾燥.

(9) 9. 第三プチルアルコール凍結乾燥法. 法がまだ普及していないこともあって,かなり高価(定価123万円)である｡引用文献. 井上貴央1989. t-butyl. 臨界点乾燥法に代わる新しい生物試料乾燥法:. alcohol凍結乾. 糸田胞 21;351-354. 燥法. 臨界点乾燥法に代わる画期的な試料乾燥法.医生物走査電顕. 井上貴央･長武均1987 16;67-69. 井上貴央･長武均1988トbutyl. ;. alcohol凍結乾燥法の発展.医生物走査電顕17. 47-49 &. OsATAKE,. scanning. electron. INOU丘, T.. Histol. KATOH,. Cytol.. H. 1978. H.. 1988. A. :. microscopy. drying. new. method. Theトbutyl. of. biological. freeze-drying. alcohol. for. specimens. Arch･. method･. 51 ; 53-59 freeze. From-TF. drying. for SEM. method. JI Electron. sample･. Microsc･. 27 ; 329-330. 大場秀章1989. 日本の野性植物. ユキノシタ科4).. (佐竹義輔他編)平. 木本Ⅰ.. 凡社,東京. OSATAKE,. H., ATOH,. of freeze-drying. method. A･, TANAKA,. K･, MITSUSHIMA,. for scanning. K･ &. electron. H･ 1980. TAKAHASHI,. ∫.Electron. microscopy･. A. simple Micrsc･. 29;72-74. 佐藤嘉彦1989. アジサイ(広義)の葉の解剖学的研究.横浜国立大学理科教育実習施. 設研究報告5 sAT6,. Y.. &. ; 15-26 M･. TANAKA, of Hydrangea. surface. Scanning. 1989. macroPhylla.. electron Sci･ Repts･. microscope Yokohama. obsarvaion Natl･, Sec･. of. leaf. II 36 ; 35-. 44 ZHOU,. T.. S. &. Terminal. 4. HARA, and. )変更された学名は,. Bot.. 64. :. N･. axillary. OHBA,. Development. 1988 buds.. Bot.. H. (1989) New. 321-329.で有効出版されている｡. Mag.. names. of shootinHydrangea Tokyo. and notes. 101. of. macroPhylla. I･. ; 281-291. Japanese. woody. plants･. Journ. Jap..

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