( ) 役割 考察 ) 線維 胞( 肺

73 6 金 沢 大 学 十 全 医 学 会雑 誌 第^{1 0 5}巻 第⁶ 号 ^{7 3 6}‑7 4 4 (1 9 9 6)

ヒ ト線維肉腫 細胞 ( ^{汀 ト1 0 8 0}) ^の肺転 移 形 成 過程に おけ^る

タ イプ^{1 ･} プラ ^ス ミ ノ ^ー ゲ^{ン ･} アク チ ^{ベ ー} タ ^{ー ･} イ ^{ン ヒ ビ タ ー} (^{n M ‑1}) ^の役割^{に つ い て の}考察

金 沢 大 学 医 学 部 医 学 科 整 形 外 科 学 講 座 ( 主任^: 富田勝 郎 教 授)

松 田 英

ヒト線 推 肉 腫細 胞 (H T l O 8 0) ^{か ら}限 界 希釈 法^{に よって}種^{々 のタ イ}プ1 ^･ プ ラスミノ ^ー ゲン^･ ア ク チ^{ベ ー} タ ^{ー ･} イ ^{ン ヒ}ビ タ ^ー (吋p^el_pla s min og^{e n a c}也v ato rinhib it_{o r}

, P A I^‑1) ^{レ ベ ル} を発 現 する ク^{ロ ー ン}を 作 製^{し た. そ れ ら}をヌ ^ー ドマウス の尾 静 脈に 接 種徽 肺^の表 面に形 成さ れ る肺 転 移^コ ロ ニ ^ー の数 を 測 定 する^こと に よ^って各^{クロ ー ン の}肺 転 移 能 を 評 価^し, 同細 胞に おける P AI^‑1 と肺 転 移 能^との関 係^について考 察^{し た.} 線 溶 系^の各因 子^の抗 原^{レベ ル の}測 定は, E LI S A に よっ て行^い, 安 定し た P A ト1 と ウ^ロキ ナ ^ー ゼ タ イ プ ^･ プ ラ^スミ ノ ^ー ゲ^{ン ･} ア ク チ^ベー タ^ー (u r okin a s e^‑t y Pe pla s min oge n a cdv ato r, u^‑P A).^{の発 現 を 呈し た 4}

つのクロ ^ー ンを 実 験に用^いた. 各^{クロー ン の}組織 因子 (^{tis s u efa cto r}, TF) 活 性^は, 細 胞 表 面にプ^ロト^{ロ ン} ビン複 合 体 を 加 え^る

こと に よって活性 化さ れ る プ^ロト^{ロ ン}ビン複 合体 中^の活性 型 第Ⅹ因子^が特 異 的に分 解 する合 成 基 質を 測 定 する こ と に より 評 価 した^. 各^{クロ ー ン の} P 封^‑1 と u^‑P A ^の mR N A ^{レ ベ ル}は, 抗 原レ^{ベ ル}と ^一 致し て^いた. 腫 瘍 細 胞 を^{ヌ ー ドマ ウス の}尾 静 脈^へ接 種 し て 3 週 間 後^に形 成^{さ れ た}肺 転 移^{コ ロニ ー の}数^の測 定に より評 価さ れ た肺 転 移 能は, 各^{クロ ー ン}間に有 意な差が認め ら れ, 高 P 』止1 お よ び T F 活 性 を 発 現 する ク^{ロ ー} ンほ ど高 肺 転 移 能 を 有し て^いた. 高 転 移 型ク^{ロ ー ン}は低 転 移 型^と比^べ, 内 皮 細 胞^への 接 着 能^に関し て は差 異が認^{め ら れ な かった が}, 腫 瘍 細 胞^が肺 内^の血管壁に接 着 後^は, 高 転 移 型ク^{ロ ー} ン の方が接 着 部 位^{に よ}り 長く 停 留 し 続 ける こ と が分か^っ た^. 停 留に引 き続 く, 細 胞 外 基 底 膜^への浸潤 能に関し て は, ク^{ロ ー ン}間に お^いて差がなか った.

接 着 部 位に停 留 する た め に決定 的な要 因である と さ れ る腫 瘍周 囲^の血 栓 形 成^を阻 止 す^る目 的^で, ヘ パリ^ンを 腫 瘍 細胞_{接 種 後}に ヌ ^ー ドマウスに投 与し た と こ ろ, P 瓜 1, T F 共に低レ^{ベ ル}で低 転 移 型^{のクロ ー ンで は}, 薬 剤^の効 果は有 意で はなか ^った が, 高 P AI^‑1 お よ び T F 活 性を発 現 する高転 移型クロ ^ー ンを 接 種し たマ ウ^スで は, 静 往 復, 4 8時 間^の時 点^で肺 内^に停 留 す^る腫 瘍 細 胞 数は著 滅^し, 肺 転 移^{コ ロ ニ ー の}数 も 低下 し た^. P A ト1 活 性 を 抑 制 する^{モ ノ}ク^{ロ ー} ナ^ル抗 体^の投 与に よっ て も^{ヘ パ}リンと同 様 な 効 果が認め ら れ た^. こ の結 果, こ の細 胞 系に おいて腫 瘍 細 胞^の Ⅲ ^一1 お よ び T F 活 性は, そ^の肺 転 移 能^の決 定 的 な 要 因^である こと が明ら か とな り, 両 因子^の抑 制^{に よ}りこ の細 胞 系^の肺 転移 形 成^が抑 制^でき^ること が示さ れ た^.

Eey ^{w o r}ds h u m an 丘br o s a r c o m a(^{H T l O8 0}),1u ng ^{m e}ta sta sis,pla s min og^{e n a c}tiv ato r,tis s u efa cto r,

t y p^el^‑_pla s min og^{e n a c}ti_{v at}o rinhibito r

腫 瘍 細 胞が, 原 発 巣より血行 性に転 移 する際, 個^{々 の}腫 瘍 細 胞の持^つ血 液 凝 固 活 性^{お よ び}線 溶 活 性が そ れ らの遠 隔 転 移 経と 密 接 な 関 連 を 持^{つ こと は}, 諸 家に より 報 告さ れ ている. そ^の多 く^の報 告で ウ^ロキ ナ ^ー ゼ タ イ プ^･ プ ラ^スミノ ^ー ゲン ^･ アク チ^ベ

ー タ ^ー (u r ok ina s e^‑tyPe Pla s min oge n a ctiv ato r, u^‑P A) やu^‑P A 受 容 体 (u^‑P Ar e c ep t^{o r}, u^‑P A R) 等^{に よ}り 惹 起さ れ る高 線 溶 活 性^が,

転 移^{のプロセス に お いて}重 要な要 因である と し て^い る が,

Ts u chiya ら はヒト線 椎 肉 腫 細 胞 田T l O 8 0) を^{ヌ ー ドマ ウス の生}

体 内で継 代 す^{ること に よ}り 低^{お よ び}高転 移 能^を有 す^る細 胞亜系 株 (^{ⅢT lO 8 0‑P 2}, P 4, P 6) を 選 択し, それ らの肺 転 移 能は む し ろ線 溶 活 性を抑 制 する タイプ 1 ^･ プラ^スミノ ^ー ゲ^{ン ･} ア ク チ^ベ

ー タ ^{ー ･} イン ヒビ タ ^ー 他pe l^‑Pla s min oge n a ctiv ato rinhi bito r,

P Al ^‑1) なら び に組 織 因子 田^{s s u e 払cto r}, T F) ^と強^い相 関 関係^を

持^{つ こと を}報 告し た^{l ).} 今 回^の実 験で は, ま ず 複 数 株^{の H T‑} 10 8 0 のク^{ロ ー} ンを作 成し, し か る後P A I^‑1 レベ ルに よ る^スク リ

ー ニ ングを 行^ない, そ れ ら^の P A I^‑1 レ ベ ルお よ び T F ^{レ ベ ル}が 肺 転 移 能と相 関 する か否かを 考 察^{し た.} さ ら に肺 転 移 形 成に お ける P A ト1 と T F ^の役 割を検 討 す^{る と}共^に, 両^{レ ベ ル の}抑 制^に よ り肺 転 移 抑 制が可 能か どうかを検 討^{し た.}

材料^{お よ}び 方 法

Ⅰ^. 腫 瘍 細 胞と培 養 法

本 研 究^{に はヒト}線 維 肉 腫 細 胞 株 ^{H T‑}1 0 8 0 [^{Am e ric a n T}y pe

Cultu r eColle ctio n 仏T C C), Ro ck vi 11, U S A か ら購入】 を 使 用し た. また^{こ の} H^′ト1 0 8 0 細 胞 株^{か ら クロ ー ンを}限 定 希 釈 法 (^マイ クロウ^{ェ ル}法)^{2)に よ}り 作 製し使 用し た^. す なわ ち, 5 個/ml に

平成⁸ 年⁹ 月^{2 0}日受付, 平 成8 年1 1月2 9日受理

A b b^{r e v}iatio n s : B S A, bo vin e s e r u m alb u min; F C S_,fetal c alf s e rtl m ; G A P D H ,

･gl_yc e r aldeh_yde pho sp h^ate deh_ydr og^{e n a s e}; H U V E C, hu m a n u mb ilical v ein e ndoth elial c占11; ^mA b, m O n O Clo nal an tibod_{y ;} N K_, n atu ral kille r;PA Pl^{a s m}in og^{e n a c}tiv ato r;P AI^‑1_{,t y p}el^‑_pla s min og^{e n a c}tiv ato rinh ib ito r;P B S_,ph o sph ateTbu鮎r ed s alin e;P C I_{, P}r Otein C

肺 転 移 形 成 過程に おける n M^‑1^の役割^{につ いて}

希 釈 ^{し た} 細 胞 浮 遊 液 を9 6 ウ ^{ェ ル ･} プ ^{レ ー} ト (Co ste r

,

ca mbri dge, U K) ^{に て 1 ウ ェ ル}あたり5 0_FLl, 3 7 ℃^の恒 温 器 (5 % C O2) ^で静置 培 養し･ 2 週 間 後, 正円 形^{のコ ロ ニ ー} を^一 つ

だけ形 成し た ウ^{ェ ル}を顕微 鏡下 で確 認 後 分 離し た^･ ただしこ の

操 作^{で は,} 得ら れ た細 胞 株が ク^{ロ ー ン}である こ と を直接 確 認^で きな^いた め, ク^{ロ ー ン}である確 率を高め る た め に同じ操 作 を,

分離^{さ れ た クロ ー ンに}対^{し 2} 回 線 り 返^{し た･ クロ ー ンは 10}回 継 代^{さ れ}, そ^の間 m I^‑1 お よ び u^一弘 の抗 原^{レベ ル の}測 定^を繰 り 返し, 安 定^{し た}発 現 を す^ることを 確か め た. 10回^の継 代^の間に,

安定^{し た}抗 原^{レ ベ ル}を示さなか^った細 胞 株に対し て は レ^{ベ ル}が 安定 す^るまで ク^{ロ ー ン の}分離 動 作を繰 り 返し た^･ 最 終 的に 4 ^つ の細 胞株 (1^‑3 B, 1^‑3 C , 2 3^‑4 B^', 2 6^‑6) ^が安定^{し た クロ ー ンで}あ ることを確^{認し, 実験に}使用し た^. 抗 原^{レ ベ ル の}億は 4 回 目^の 継 代か ら1 6回目^の継 代 ま^で,計⁵ 回^{の E LIS A} 汀^{e chn o clo n eIn c･,}

Ⅵe n n a, Au stria) に よ る測 定で得た値^の平均^と標 準偏 差 を^とっ

た^.

これ らの細 胞は 10 % 非 働 化牛 胎 児血清 (^{由tal cal fs e ru m} ,F C S,

HyC lo n e, Utah, U S A) ^{と 1 % ペニ シ リン･ ス トレ}プト^マイシ

ン液 (G i bc o, Ne w Yo rk, U S A) を 含 有 する R P M I 1 6 4 0 培 地 (^Sigm a, St^.Lo uis, U S A) を用^い, 3 7℃^の恒 温 器 (^{5 % C O2}) ^で

培養し た^.

Ⅱ^. 払 お よぴP A I^‑1 抗 原^{レ ベ ル}の測 定

腫 瘍 細 胞^の持つ 組 織プ ラ^スミノ ^ー ゲ ン ^･ ア ク チ^{ベ ー} タ ^ー 田s s u e^‑t y Pe pla s min oge n a ctiv at_{o r}, t^‑P A), u^‑P A お よ び P A l^‑1 ^レ ベ ル の評 価は_, 検 査 培 地 中^の各抗 原レ^{ベ ル}を E LI S A に よ^っ て 測定する こ と に より 行 な^{っ た.} 検 査 培 地^は無血清R P M I 培 地 を 増殖期^の腫 瘍 細 胞存在下 で 2 4時 間 培 養し た後に回収し, 低 速 遠 沈(^{2 0 0 0}g^, 4 ℃, 5 分) ^{に よ り}細 胞 片 等を除 去し たものである^･ 検査培 地は測 定に用^いら れ るま^{で ‑}7 0℃^で保 存^{し た. E L IS A の} 検^{出 限 度は}, t^‑P A お よ び u^‑P A で は 1ng/ml 未 満, P A ト1 で 3ng/ml 未 満であ り, t^‑P A E LI S A で は, 遊 離 型^{お よ び}結 合 型t^‑ P A が測定 され, u^‑P A E LI S A で は, 1本 鎖お よ び 2 本 鎖 結 合型

u‑^{P A が, P A I‑1 E L IS A で は, 活性 型お よ び滞 在 型P A I‑1 と, 結} 合型P A I^‑1 が測 定さ れ る^.

Ⅱ. 1 下溝 性^の測 定

細 胞 表 面^{の T F} 活 性は, S^cho e r e r らの方 法^に改 良^を加 えて行

った³⁾. 簡 潔に記 載 する と, 2 4 ウェ ル ^･ プレ ^ー ト(Co ste r) と に 培養し た腫 瘍 細 胞 を 燐 酸 緩 衝^{生 理}食 塩 水 (pho sphate^‑buffe r ed

s alin e, P B S) (pH 7^.4) に て洗 浄 後, プ^ロト^{ロ ン} ビン複 合 体 (^{CaC 1}2 含 有 第^Ⅲ/^Ⅶ/ ^Ⅸ/^Ⅹ;疑 固 因 子 複 合 体, Sig^{m a}) を 加え,

37 ℃ に て1 5分 培 養し た後に, E D T A 含 有^Tris 綾 衝 液^{に て}反応 を終 了さ せ た. 反応 後, T F と プロ トロ ンビン複 合体^の反 応に よって 生 じ た活 性 型 第Ⅹ因 子 を, そ れ に よ ^って特 異 的^に分 解さ れ る合成 基 質S^‑2 2 22 (^{F n B I Dia}g^{n o s}tic a, Sto ck holm , Sw ede n)

の吸光 度か ら測 定し た^. 2ml の蒸留水^{に よって}溶 解し た 1 ^バイ ア ル の組 織トロ ンポ プ ラ^スナ^ン(S igm a) を1 U/ ^{mlの T F} 活 性^と みなし て標 準 曲線 を 作 成^し, 各腫 壕 細 胞^の T F 活 性を定 量 化し た.

Ⅳ^. m R M の解 析

全R N A は_, フ ェノ ^ー ル ^･ クロ ロホル ム抽 出 法^{に よ}り 抽 出し⁴⁾,

各 ^{mR N A レベ ル}は^{ノ ー}ザン ^･ ブ^ロツティ ング に より 視 覚 化し

7 3 7

た. 簡 潔^に記 載 す^{る と}, 全R N A を6 % ホ^{ル ム} アルデヒド含 有 1^.2 % ア ガ^{ロ ー ス ･} ゲ^ルに て電 気 泳 動 後, 非 荷 電 型^{ナ イロ ン},

デ ^ュ ラ ロ ンU V (^{Str ata}g^{e n e,} I^.aJo11a, U S A), に1 0^×S S C を 媒 介と し て毛 管 転 写さ せ, し か る後, 紫 外 線^{クロ スリンカ ー}

(^{Str ata}ge n e) を 用^いて R N A プ^ロッ トをナ イ^{ロ ン}に固 定^{し た･}

ヒト P AI^‑1, ヒトu^‑P A, ヒトu^‑P A 受容 体 b^{‑P Ar e c e}p t^{o r}, u^‑P A R),

ラッ ト G A P D H 鹿1yc e ral dehyde p ho sph^ate deh_ydr oge n a s e) ^の

cD N A は, ウィ^ー ン大 学生 理医 学研 究 所B^.R^.B inde r 教 授より 倶 与^{さ れ た}も^のを 使 用^{し た. これ らのcD N A を ランダムプ ラ イ}

マ ^ー D N A ラ^ベリ^ング キッ ト 仏m e r sha m , Bu ck ingh ^{a m shir e,}

U K) を 用^{いて3 2p‑d C T P}(^{Du Po nt}, Bo sto n, U S A) ^で標 識 し, プ ロ ^ー プ を作 成し た^. R N A を 固 定し た ナ イ^{ロ ン}を5 7 ℃ で 1 時 間, プレハ イ プ リ ダイゼイショ ンし た後, 各 ^{cD N A プロ ー}

ブを 含 有^{し たハ}イ プ リ ダ イ ゼ イ シ^{ョ ン}緩 衝 液^{に て}, 5 7℃で

一 晩ハ イ プ リ ダ イ ゼイショ ンを 行ない_, その 後ナ イ^{ロ ン}を 5 % S D S ,0^.2 ×S S C に よっ て 5 7℃で 1 0分 間 洗 浄し, 乾 燥 後,

ⅩA R ^{フ イ ル ム} に露 出し た^{5 ).} 現 像^{し たフ イ ル ム を}密 度 計 (^{H ir s chm a n n , E be r slodt, G e r ma ny}) ^{に てス キャ ンし, ラ}

ッ ト G A P D H ^{メ ッ}セ ^ー ジ を対 照と し て, m R N A レ ベ ル の定 量 化 を 行^なった.

Ⅴ^. Ⅲ ^̲1 お よびu^･ m 抗 体 を 用^いた免疫 組 織 染 色 腫 瘍蘭 胞^の発 現 する P A I^‑1 お よ び u^‑P A を 視 覚 化 す^{る た め に}

ア ピ ジンビ オ ナ ン ペ ルオ キ シ ダ ^ー ゼ複 合 体 (^{a vid in‑b iotin‑}

c o mple xim m u n ope r o xida s e, A B C) 法を用^いて免 疫 組 織 染 色を 行^{っ た6 ).} 各^{クロ ー ン の細 胞 浮 遊 液を カバー ･ スリップ 上 にメ}

タ^{ノ ー ル ･} ア セト^ン (^1:1) 混 合 液^{に よ}り 固定 後 ( ^{‑2 0 ℃}, 2 分), P B S に より 洗 浄し, 1 % 牛 胎 児血清^{ア ル}ブ ミ^ン(bo vin e s e ru m albu min, B S A) 含 有^{P B S} を^スラ イ ド上 に加 え3 7 ℃ で 3 0 分 培 養し た. そ^の後, 抗^ヒト P A ト1 ^マウスI_gG あ^るいは抗^ヒト

u^‑P A マウスI_gG C^{re chn o clo n eIn c}) を 加 え^{. 3 7}℃で 1 時 間培 養し た^. 対 照 実 験と し て, 非 特 異 的に結 合 す^る抗^{ヒト プロ テ インC} イ ^ン ヒ ビ タ ^ー (pr otein C inh ib ito r, P C I) ^マ ウ^ス IgG Cre chn o clo n eIn c) を. ^{P A I‑1 お よ び u‑P A} 抗 体^の代わ り に便 用し た. 予め 汀T l O 80 が P C I を 分 泌^{し ない こと は, P C I モ ノクロ ー} ナ^ル抗 体 を 利 用し た E LI S A に より 確^{か め た.} 抗 体と反応さ せ た後, 前回と同 様に洗 浄し, 抗^{マ ウスI}gG ビ オ ナン化^{ロ バI}gG

( ^{Am e r sha m}) ^を加 え, 37 ℃ に て培 養 する^. 1時 間 後, 再 度 洗 浄

し, ス ト レブ タ ピ ジ^ンー^{ビ オ ナ ン}化 過 酸 化 酵 素 複 合 体

(^{Am e r sha m}) ^を加 え3 7 ℃ で 1 時 間培 養し た後, 結 合し た過 酸 化

酵 素^の存 在^は, 0.0 5 % 3 , 3 ^‑ジアミ^{ノ ベ ン}ズアミ ジ^{ン ･ テ}ト ラ

ハイ ドロクロラ イ ド(S igm a) と0^.0 1 %過 酸 化 水 素 水 含 有^{0.0 5 M} Tris 綬 衝 液^の混 合液 を 加 え^{ること に よ}り, 視 覚 化し た^.

Ⅵ^. 肺 転 移コ ロ ^{ニ ー} 形 成 能^の測 定

各^{クロ ー ン の}肺 転 移 能^の評 価は, W e xle r の方 法に従っ た^7). 3 ^×1 0⁵個^の腫 瘍 細 胞を 含有 す^{る 0.2mlの}細 胞 浮遊 液 を^{ヌ ー ドマ} ウ^ス(^{B A L B}/c n u/n u, 5 ^〜 6週 齢, 以降^で使 用さ れ る^マウス

も 同じ) ^の尾 静 脈 内^に接種^し, 3週 間後に剖 検し肺を摘 出し て,

気 管 内に黒インク(^パイ^ロ ッ ト, 東 京) 1 5ml, 蒸留水^{8 5ml}, ア ン モ ニア水 (^{S i}gmA) ²涌^{か ら な る}染 色 液 を 約2 血1 ゆ^っく り 注入

後, Fekete 固定液 (^{7 0 % アルコ ー ル1 0 0ml, 3 7 % ホルム アルデ}

ヒ ド液 (^Sigm a) ^10ml, 酢 酸 (^Sig^{m a}) ^5ml) ^{に よっ て}固定し, 実

inhib ito r;T F,tis s u efa cto r; t^‑P A,也s s u e^‑typ^ePl^{a s}mi n og^{e n a c}tiv ato r;^u‑P A_, u r Okin a s & typ^e pla s min og^{e n a c}tiv ato r;^u‑P A R･

u^‑P A r e c ep t^{o r}