ト 分解性 集 凝 反応並 有毒

有 毒 ^{Clo stri d 血m dif 封cile の}凝集反 応 並び に ソ ^ル ビ ト ^{ー ル} 分解 性 ^{に つ い て}

金沢大 学 医学 部 微^生物 学 講座 (主任^: 西 田尚紀 教 授)

川 正 人

( 昭和^{5 5}年^{1 2}月^{1 7}日受 付)

鼠ey ^{w or}ds C lo stridiu m d 折^ile, A ntib iotic^‑a S S O Ciated _ps e ud_{o r rl e m} br ano u s c olitis_,

A_{g g}lutin atio n of C. di5^{icile, P ath o}g^{e n}ici_{t y} of C^. di#^iciL?, So rb itol fe r m e ntatio n ^rof C.

有 毒C lo stri d iu m d ifficile が抗 生 剤 投 与によ る偽 膜 性 大腸炎Ps e udo m e mbr a n o u s c ol itis (P M C), あ る^いは下 痢 症^の主 な原 因 菌^の1 ^つ であ る^こと は^, 今日 広く 認 め ら れ^{て い} るl ト 5 I 7 )

. 抗 生 剤 投 与^によ る本 疾 患が 老 人^に発症し や す^いと述べら れて いる^{7 潮}が, その理由

につ い て は明ら かにさ れ^{て い}ない. 著 者は, 前 報^別で抗 生剤非投 与若年者, 老 人^の糞 便 中か ら C. d if ficile の 分 離を試み^, 本 菌^の分 離 率^に関しては若 年 者と老 人^の間

に差を 認 め な か^っ た が, 糞便1g あ た りの C.d i fficile

菌数が若 年 者^に比^{べ て} 老 人^に多^{い こ}と^, 並びに C^. d i fficile 毒 素^に対す る抗 体が若年 者 血 清 中^には存 在 す る が^, 老 人^の血 清 中には存 在し な^{い こ}と を明ら かに し, こ の こと が老 人に本疾 患が発症し易^{い こ}とに関 与 して いる 可能 性を示 唆し た^. C.d ifficile によ る P M C の発症を Ho st^‑Pa r a site r elatio n sh ip にお^{い て}考え る際.Ho st側^の要 因と しては 上 述の如く抗 体 産 生能が 重 要な因 子^の1 ^つ と考え ら れ る が^, Pa r a site 側^の因子 と しては従 来 述^べ ら れて いる C.d ifficile の毒 素 原 性

の他に, 著 者は

.^{,C.d ifficile の菌 体 表 面抗 原の性 質が} 関与して いないか ど う か を検討す^べく,P M C 及び下 痢 症 患者並 びに健 康 成 人 糞 便 由 来C.d ifficile 頗 株を用

い て凝 集 反 応^によ る群 別を試み た^. ま た,C^.d ifficile の同定にお け る凝 集 反 応^の有用性^{に つい て}も併せ検 討 し た^,

材 料及 び 方 法

Ⅰ^. 使 用 菌 株

以下^に記 し た合計79 株^のC^.d ifficile を用^いた^. A T C C ( A m e r

.^{ic an Ty pe Cultu r e Collection .}

Ro ckville,U ^.S^.A) 由来^. ; A T C C 9689,1 7857,1 7 8 59

の3 株, 健 康 成 人 糞 便 由 来; 50 株,抗 生 剤 服用者で腹 部 症 状^の ない患 者 由来; 13 株, 抗 生 剤投 与に よ る下 痢 症 患 者 糞 便 由 来;8 株,抗 生 剤 投 与^によ る P M C 患 者 糞 便 由 来; 5株^.

ま た, 凝 集 反 応^の 対 照と して以 下 に記 し た C lo stri d ia 4 5菌 種⁶9 株^を用^いた.C.b ife r m e nta n s

と C^. s o rdellii 以外は 1 菌 種につき 1 株 ず^つ用^いた^.

1. 金 沢 大 学 医学 部微 生 物 学 教 室保 存 菌 株 C. a c etobut y^ric u m ,K Z 5 8 6,C^.b ife r mentan S l O 株,C^.but y^ric u m K Z 5 8 9, C^. bot_ulin um t y pe B K Z 5 3 3,t y Pe E K Z 5 8 2,C. cha u v o ei K Z 3 8 2, C^.

n o vyit y p^e A K Z 6 7 l,C^. pe rfringe n s t y p^e A K Z 2 1 1 ,t y pe B K Z 2 6 3,ty pe C K Z 2 6 5 , t y pe D K Z 2 6 7 , t yb^e E K Z 2 7 5, C^. s ep tic u m K Z 9 9 3. C^.

S O rdellii l O 株.

2^. A T C C 菌株

C^.abs o n u m 2 7 5 5 5,C^. a rnin o v ale ric u m 1 3 7 2 5,

C.b otulin u m t y pe A 1 5 7 6 3,C^.ba rke ri 2 5 8 4 9,C^.

C a r nis 2 5 7 7 7, C^. c ada v e ris 2 6 7 8 3, C^.

C O Ch le a riu m 1 7 7 8 7, C. gho ni 2 5 7 5 7, C.

glyc olic u 血 1 4 8 8 0, C^. h istoly tic u m 2 5 7 7 9, C^. indolis 2 5 7 7 1, C. in n o c u u m 1 4 5 0 1, C.

1 im o s um 2 5 7 6 0, C^. 1it_{u s e}bu r e n s e 2 5 7 5 9, C^.

m ale n o min at_{u m} 2 5 7 7 6,C^. m a nge n otii 2 5 7 6 1, C.

C ha r a cte rizatio n of T o xi_ge nic C lo st7idiu m d # ^{cile b}y A _{g g}lutin ation a nd S｡rbit｡1 Fer^̲ m e ntatio n ･ M _{a s at}o M ika w a, D ep^{a r}tm e nt of Ba cte riolog y (^{D ir e cte r : Pr of. S. N i}sh ida)^, Scho ol of M edicin e, K a n a z a w a Univ e r si_{t y},

2 2

o cea nic u m 2 5 6 4 7, C^. o r otic u m 2 5 6 5 0 , C^. pa r ape rfringe ns 2 5 7 5 3, C^. pa r aputri fic u m

2 5 7 8 0,C. pa ste u ria n u m 6 0 1 3, C^.pe r e n n e 2 5 7 8 2,

C^. plag^{a r u m} 2 5 7 6 8, C. pr opio nic u m 2 5 5 2 2, C.

p^seudoteta nic u m 2 5 7 7 9, C^.putrific u m 2 5 7 8 4, C^.

r ubr u m 1 4 9 4 9, C. s a rtagofo r m u rn 2 5 7 7 8, C.

s c atologe n e s 2 5 7 7 5, C^. sphe noi de s 1 9 4 0 3, C.

spo r oge n e s 2 5 7 6 2, C. spo r o sphe n oi de s 2 5 7 8 1,

C^. stickla nd ii 1 2 6 6 2,C^. s ub^te r min ale 2 5 7 7 4, C.

te rtiu m 1 4 5 7 3, C.teta ni 8 0 3 3,C^. tyr obuty^ric u m

2 5 7 5 5^.

Ⅱ^. 抗 原^の作 製

P Y G 培 地 (Pr ot eo s e pepto n e No .2(D ifc o); 3 % (W / V), Ye a st e xtr a ct (D ifc o) ; 0^.5 % (W / V).

G lu c o s e ; 1 % (W / V), NaC l; 0.5 % (W / V), L^‑

CySteine ^･ H C l; 0.05 % (W / V), pH7.2 ) 10 mL に肝 片 加 肝ブ イ^{ヨ ン}で前培 養し た菌 液 0 ^.2 m⊥を植 菌 し,37 ℃, 7 時 間 培 養 後8 0 0 0^rp^m 5 分 間 遠 心 集 菌し,

生理食 塩 水^で洗 漉し た後, 0^.4 % ホ^ルマ リ^ン加 生 理 食 塩 水^に,元の培 養液^の1 0倍^の濃 度にな る よ う再 浮 遊し

た菌 液をホ ルマリ^ン抗 原^{1 0 )と し た. ま た.}培 養 液を 1 00

℃, 6 0 分 間 加 熱 処理後 遠 心 集 菌し, 生理食 塩 水^で洗 撤 し た後.元^の培 養 液^の1 0 倍^の濃 度^にな る よ う生理食 塩 水に再 浮 遊し た菌 液を加 熱抗 原と し た^.

Ⅲ. 抗 菌血清^の作 製

上 記^の抗 原を家 兎^の耳 静 脈^へ3 日間 隔^で7 回 注 射し た^. 注 射 量は,1 回 目 0^.5 mし2,3 回 目1^.0 血 ,4,5 回 目 2^.O m【,6,7 回 目 3^{.O ml と し た.} 最 終 回^の注 射か ら

7 日目に採 血して血 清を得た^.

Ⅳ. 交叉凝 集反応 Hende r s o n

l l )

の方 法^に従^っ た. 2倍 段 階 希 釈し た抗 菌 血 清1 血 と適 当な濃 度^の抗 原1 滴を混合し,56 ℃,

2時 間 静 置 後 判 定し, 明 瞭な凝集を示す最 高 希釈^の逆 数を も^って凝 集 価と し た^.

Ⅴ. 凝 集 葉 吸 収 試 験

使用時 作 製し た濃 厚な抗 原と等 量^の抗 菌 血 清を混 合 し^, 時^々振 渡さ せ な が ら 56 ℃! 2 時 間 反 応さ せ た^. 遠 心(80 0 0rpm ,5分 間) ^によ^って抗 原を除き,上 清 液を 吸 収 血 清と し た. 吸 収 血 清^につ い て吸 収^に供し た抗 原

に対す る凝 集 反 応を行ない.抗 体が残っ て いる場 合は.

全く凝 集し な く な る まで吸 収^を繰り返し た. な お, 5 6

℃t 2時 間 処理によ る抗 菌 血 清^の凝 集 価^{へ の}影 響が な い こと を確 認 する た め, 対 照と して等 量^の生理食 塩 水 を加え た抗 菌 血 清を同様^に加温 処理 し た後, 凝集 価^の 変 動を調^べ た.

Ⅵ^. 細 胞 毒 性試験 前 報^{9 )に}記し た方法^に従^っ た^.

Ⅶ. 糖 分解 試 験

Ste r n e ら^{1 2 )}の方 法^に従^っ た^.

成 績

Ⅰ^. 抗 原 及び抗 菌血清^の検 討

本 実 験^に先だ ち, 強 毒 株A T C C 17859 株^. 無 毒 株 N o. 78 株 ( 健 康 老 人 糞 便 由 来 菌 株) ^{に つい て}加 熱 抗 原^, ホ^ルマ リ^ン抗 原に対す る抗 菌 血 清を作 製し, そ の凝 集 特 異 性^を検 討し た. 上 記^の2種 類^の菌 株^の加 熱 抗 原によ^{っ て}作 製し た抗 菌 血清^の場 合, 加 熱No.78 株 抗 菌 血 清は両株^の加 熱 抗 原に対 して 等し い凝集価 ( 2560) を示 した^{. ホ ルマ} リ^ン抗 原^に対してはいく ら か 低^い値^であ^っ た が, 両 者と も等しい凝 集 価 ( 64 0) を 示し た. 加 熱A T C C 1 78 5 9 株抗 菌血 清^の場 合は, 加 熱,

ホ ル マ リ^ン 両 抗 原に 対 する充 分な抗 体 価が得ら れ な か っ た( 表1) . し か し な が ら, ホ ルマ リン抗 原^によ^っ て作 製し た A T C C 1 7859 株及 び N ^o.7 8 株 抗 菌血 清は,

当 該^{ホ ルマ} リ^ン抗 原に対して そ れ ぞ れ10 2 4 0, 51 2 0 と^いう高^い凝 集 価を示し た ( 表2). し か し, 加 熱し た時, こ の抗 原 性は殆ど失わ れ た^. 強 毒 株A T C C 1 7 8 5 9 株と無 毒株 ^{N o.7 8}株 の こ の 易 熱 性 抗 原 性は そ れ ぞ れに特 異 性を示し, 抗 原 的に異な る と思わ れ た^.

T^ablel. Cr o s s^‑aggl^utin ab ili_{t y t}o a ntis e r ap^{r e}pa r edagain sthe atedc ells ofstr ain s A T C C 1 7 8 5 9

a nd N o.7 8 Antis e r a

pr epa r ed

again st he ated

c ells

Ag glutin atio ntite rto

Fo r m al^‑tr e ated c ells ofstr ain s He ated c ells^* ofstr ain s

A T C C 1 7 8 5 9 N o.7 8 A T C C ¹7 8 5 9 No.7 8

A T C C 1 7 85 9 1 6 0 3 2 0 1 6 0 8 0

N o.7 8 6 4 0 640 2 5 6 0 2 5 6 0

*

: Cellshe atedatl O O^BC fo r6 0 min.

Ⅱ^. 交叉凝 集反^応

上 述^の結 果よ り^{ホ ルマ} リン抗 原^によ^っ て作 製し た抗 菌血 清 及び同抗 原を 用^{い て}凝 集 反 応^によ る群 別を行^っ た^.

最 机 最も強^い毒 性( 1 638 4 C U / 50J上り を示し た A T C C 1 7 8 59 株, 及び無 毒 株No.78 株 抗 菌 血 清を用^い

て披 験 79 株 全 株に対し凝 集 反 応を行った. その結 果t

7 9株 中5 8株 ( 7 4^.4 %) が^いず れ かの抗 菌 血 清^に対し 特 異 的^に凝 集し た^. 次^に, 残り^の 21 株か ら無作 為^に選 ん だ 1 3 株^に対す る抗 菌 血 清を作 製し^て , 披験79 株 全 株につ い て凝 集 反 応を行なった. その結 果, 前 記 21 株

のう ち 7 株が^.13 種 類^の抗 菌血 清^の1 つであ る無 毒 株 T ^‑ 7 0 株 ( 抗 生 剤 投与, 非下痢 患 者 糞便 由来 蘭株) 抗 菌 血清^に対し^て特 異 的^に凝 集し た^. し か し,残りの12 種 類^の抗 菌血 清は自己^の抗 原^に対しても低^い凝 集 価(160

‑ 3 2 0 ) を 示 し た^にす ぎず, 披 験 全 株^に対し ても 低^い凝 集 価し か示さ な か^っ た^.

以上^の結 果か ら, 披験79 株は,強 毒 株A T C C 1 7 8 59 株 抗 菌血 清に対して特 異 的^に高^い凝 集 価 (1 0 2 40 ^‑ 51 2 0) を示す菌 株 群 (Ⅰ群, 39 株) ,無 毒 株^丁一70 株 抗 菌血 清^に対し^て特 異 的に高^い凝 集 価 (1 0 2 40 ‑

2560) を示す南 棟 群 ( Ⅱ群.7株) ,無 毒 株^No.78 株 抗 菌血 清^に対して特 異 的^に高^い凝 集 価 (51 2 D ^‑ 1 28 0) を示 す 菌 株 群 (Ⅲ群,19 株), ま た^これ ら3 種 類の いず れ^の抗 菌 血 清に対しても低い凝集 価 (3 2 0 以下) し か

示さ な^い南 棟 群 (^Ⅳ群^,1 4 株) ^の4 群^に分け ること が でき た( 表 3 ). A T C C 由来 3 株は Ⅰ群^に属し た.

Ⅲ^. 凝 集 素 吸 収 試験

凝 集 反 応^によっ て分け ら れ た 4 ^つの各 群^の菌 株が,

群 特 異 抗 原を有 する か否か を換 討 する た め, 吸 収試 験 を行なった. Ⅰ群^のA T C C 17859 株 抗 菌 血 清は^, 自 己

の抗 原^では完 全に吸 収さ れ, 吸 収 血清は^いずれの南 棟 も全く凝 集し な かっ た. し か し な が ら, Ⅱ群^の T ^‑70 株 抗 原あ るいは Ⅲ群^の No.7 8 株 抗 原 ^で 吸 収し た

A T C C 17859 株抗 菌 血 清^は, Ⅱ , Ⅲ, I V群^の菌株を 全く 凝集し な か^っ た が, Ⅰ群^の菌 株に対しては, 吸 収 前と同様 特異 的凝 集 性 ( 凝 集 価;1 0 2 4 0 ^‑ 51 20 ) を示 し た. これ に反し^, T ^‑ 7 0 株 抗 菌血 清 及び N o.7古株 抗 菌血 清は,Ⅰ群^の A T C C 17859 株, Ⅲ群の T ^‑7 0株あ るいは Ⅲ群^のNo.78 株^{の い}ずれ^の抗 原で も完 全に吸 収さ れ, これ ら吸 収 血 清^に対し^ては^いず れ^の菌株 も全 く凝 集し な かっ た( 表4)^. 以上^の結 果, Ⅰ群に属し た 菌株は, 群 特 異 抗 原を有 すること が判 明し た.

Ⅳ, 凝 集反応 に^{よ る}群 別と毒 素 原 性

Ⅰ群に属し た39 株はtl 株妄除^{い て}全 株が 102 4 ^‑ 8 192C U / 50〟王^の毒 素を産 生 する強 毒 株^で,Ⅱ群^に属し た 7 株 全 株が無 毒 株であ^った( 表5). Ⅲ, Ⅳ群に は 無 毒 株,有 毒 株^{の い}ずれもが属し た が,Ⅲ, Ⅳ群^の33 株^のう ち 1 7 株 (52 %) が有 毒 株で, そ^の1 7珠^の有 毒 株^のう ち 1 4 株 ( 8 2 %) が 5 1 2 C U /50〟エ以 下^の毒 素を

Table2, Cr o s s^‑ag glutinab ili_{t y t}o an tis e r a pr epa r ed again stfo r m ol^･tr e at占d c e11s of str ain s

A T C C 1 7 8 5 9a nd N o.7 8 Antis e r a

pr ep^{a r e}d

ag^{a l n S}t fo r m ol^‑tr e ated

C ells

Ag glutin atio ntite rto

Fo r moトtr e ated c ells of str ain s He atedc e11s^*of strain s

A T C C 1 7 8 5 9 No.78 ′A T C C 1 7 8 59 N o.7 8

A T C C 17 8 5 9 102 4 0 8 0 4 0 40

No･7 8 1 6 0 512 0 3 2 0 32 0

*

:Cellshe ated atl O O^OC fo r6 0 min.

Tab le3･ Gr o uping of C di5kile str ain sby c r o s s^‑aggl^utin atio n

Nu mbe r

Gr o up^{. o}f

Str ain s

Ag glutin atio ntite r ag^{a ln S}tS e r a tO Str ain s of

A T C C 178 5 9 T^‑7 0 No^.78

Ⅰ

Ⅲ m

Ⅳ

3 9 1 0 2 4 0‑^{512 0 < 16 0 <}3 2 0

7 く1 60 1 0 2 40 ^‑2 5 60 <3 2 0

1 9 <32 0 <3 2 0 5 12 0 ^‑1 28 0

1 4 <32 0 < 16 0 <3 2 0