意義 渠 ネ 集 対す 板 凝 反応 ト 小

金 沢大 学 十 全 医学 会 雑誌 第

9 9

巻 第

1

号

1 7 3

⁻

1 8 5

く

1 9

師

_{1 7 3}

ヒト血小板^の凝集反 応 ^に対 する 血渠フ ィ ブ ^ロ ネ_{タ チ}ン の意 義

金 沢

大 学 医 学 部内 科学 第

^三

講座

く

主

任

^二倍

田

保教

授1

熊 克 郎

く

平 成² 年¹

月

2 4

日

受 付

1

ヒ

ト

血 小 板

が

凝 集

す る

に際

し て は

フ ィ

ブ リ

^ノ

ゲ

ンt

fib r i n o

g

e n

，

F b

_g

n

l

を は じ め

い

く

^つ

か の

接 着 性 蛋 白

が

関与

す る

こ

と が

知

ら れ

て い

る が

，

そ の

詳 細に

つ

い

て は

不 明

で

あ

る

． 今 回

血

中^に

比

較 的 豊富^に存在

す る

接 着 性 蛋 白^であ

る

血 衆フ ィ

ブ ^ロ ネ ク チ

^ンくp

l a s m a

^．

fi b r o n e c

t

i n

，

P

^．

F N

l

の 血

小 板凝 集に お

け る

意 義

を

検 討

す る

目 的

で

7 ヒ

ト

洗 浄 血小 板

の ア デ

ノ シ ン

5

^し

^エ リ

^ン酸 く

^a d e n o s i n e 5

^，−

di

p

h o s

p

h a

t

e

，

A D P

順 集^に対

す る

血 祭フ ィ

プ ^ロ ネ ク チ

ン

の

影 響

に ^つ

^い

て

検 討

し た

⁻ あ

ら か じ め A D P

凝 集

が

生

じ る

こ

と を

確 認

し た

条 件 くフ ィ

プ リ

ノ

ゲ

^ン

1

4

3

y gl

^m l

，

A D P l O

_p

M

，

で

血 祭フ ィ

ブ ロ ネ ク テ

ン

を 0

⁻

6 0 0

p gl

m l

の範 囲^で添カ

ロす る と

， 血 簗_{フ ィ}

プ ロ ネ ク テ

ン の用

量

依 存 性に 二次凝 集

の

発 現

は

遅 延

し

，

6

町 ^g佃

1 の

添加に

よ り そ の

^二 次凝 集

は

完 全に抑 制

さ れ た

^．

ま た

血 祭フ ィ

ブ ロ ネ ク テ

^ン濃 度

を7

獅 gノ

m l と

^一定^に

し て

フ ィ

プ リ

ノ

ゲ

ン

濃度

を1 4 3

⁻

9 2 0

月 gノ

^m l の

範 囲

で

変 化

さ せ た と

こ

ろ

， 血 媛_{フ ィ}

プ ^ロ ネ ク チ

^ン

は

低 濃度

^の

フ ィ

ブ リ ノ ゲ

ン

存 在 下

で

の

A D P

凝 集^に対

し

^て

よ り

強^い抑 制 効 果

を 示 し た

^一 血 梁フ ィ

ブ ロ ネ ク テ

^ン

と

フ ィ

ブ リ

^ノ

ゲ

^ン

の

濃 度

を

^一 定

と し て A D P

濃 度

を6

⁻

7

p

M

⁻

2 5

p

M と

変 化

さ せ た

場 合

は

， 血 祭フ ィ

ブ ^ロ ネ ク チ

^ン

は

低 洩 度

の A D P

刺 激^に

よ る 血

小 板 凝 集^に対

し て よ り

強^い抑 制効 果

を 示 し た

■ 血 寮フ ィ

ブ ロ ネ ク チ

ン の凝集 抑 制

が

放 出 反応

と ど

の

よ

う

な

関 係^にあ

る

か に

つ

い

て も

検 討

し た が

， 二次 凝 集

が

抑 制

さ れ た

条件で

は

放 出

反

応

も

明

ら か

に抑 制

さ れ て

い

た

^．

し か し

， いず

れ の

実 験に お い て

も

， 血 襲フ ィ

プ ^ロ ネ タ チ

^ン

は

^一次凝 集^に

ほ と ん ど

影 響

を 及 ぼ さ な か っ た

^． 以

上 の

実 験 結 果

お よ び 血

祭フ ィ

プ ロ ネ ク テ

^ン

と

フ ィ

ブ リ

ノ

ゲ

ン の親 和 性

が

高^い条 件

に お

い

て も

凝 集 抑 制^に変 化

が な か

っ

た

こ

と

_， 今

回

の実験 条 件

で は

両 者

の

親 和 性

は

非 常^に低

い

こ

と よ り

， 血 祭フ ィ

ブ ^ロ ネ ク テ

ン

は A D P

に

よ っ て 正

常^に刺 激

さ れ た

血 小 板

と

フ ィ

ブ リ

ノ

ゲ

ン

と の

結 合

を

阻 害

す る

こ

と

に

よ り

凝 集

を

抑 制

し て

^い

る

こ

と が 示

唆

さ れ た

^． 今

回 の

実験で 二次凝 集

が

完 全に抑制

さ れ た

時

の 血

梁フ ィ

ブ ロ ネ ク チ

ン

お よ び

フ ィ

ブ リ

^ノ

ゲ

ン の濃 度

を そ れ ぞ れ 血

祭 中

の そ れ と 比

較

す る と

，

血

紫

フ ィ

プ ロ ネ タ テ

ン

は

約

2

倍， フ ィ

ブ リ

ノ

ゲ

ン

は

約

2 0

分の

1 で

あ

り

， 特 殊

な

病 態

ま た は

局所 的

な

環境

を

想 定

す る

以 外に こ

の

濃 度

は

生

理

的

で は な

^い．

し か し

， 今

回 の

実 験 結 果

よ り

血 費フ ィ

プ ^ロ ネ ク テ

ン

は

低 濃 度

の A D P

刺 激^に

て

惹 起

さ れ た

凝 集 反 応に対

し て よ り

強^い抑制 効 果

を 示 し て お り

，

ま た

生 体 内^{に お い}

て 血

小 板

が

刺 激

と し て

受

け る A D P

濃度

は

今

回

の実 験 条 件^に

く ら ^べ て

著

し く

低^{い こ}

と よ り

， 血 祭フ ィ

ブ ロ ネ ク チ

^ン

は

低 濃度^の

A D P

に

よ り

刺 激

さ れ た

血 小 板

を

凝 集

ま

で い

た ら し め

ず， 凝 集

が

過 度^に進 展

す る

こ

と を

防

ぐ

調節 因

^{子 と し}

^{て の}生

理

作

用 を も

つ可能 性

が 示

唆

さ れ た

．

K e

y

^{w o}

^r

ds A D P⁻indu c ed

_p

la

t

ele

t

a

g g

^{r e}

t

a

t

io n

， Fib

r

in o

g

^{e n，} P la s m a

fibr o n e c

t

in ， Rele a s e r e a c

t

io n of

_p

la

t

ele

t

s， W a shed hu m a n

p

la

t

ele

t

A b br e via

t

io n s ニ

8

⁻A C A

，

e

⁻a min o⁻n⁻C a

p

^{r O}ic a cid

_ニ

A D P ， ade n o sin e

5

^，pd i

_p

ho s

p

ha

t

e

妄

A T P ，

ad_{e n o s}in e

5

^，−

t

ri

_p

ho s

p

ha

t

e

ニ

B S A ， bo vin e s e r u m albu min

三

Bz

， be n z a mid in e h

_y

dr o chlo ride

三

E D T A ， e

t

h

_y

le n ed ia min e

t

e

t

r a a c e

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ic a cid

_i

F N ， fib_{r o n e c}

_t

in

i

F b

_g

n_， fibrin o

g

^{e n}

i

G P ，

g

l

_y

c o

p

^{r o}

t

ein

ニ

L⁻L，lu cife rin^．1u cife r a s e

ニ

M E， m e r C a

p t

^{O e}

t

ha n ol

_ニ

P ⁻F N_，

_p

l_{a s m a} fibr o n e c

t

in

ニ

1 7 4

血 小 板

は 止

血機 構^{に お い}

て

重 要

な

役 割

を

果

た す が

，

そ の

主

な

機 能

は

血 小 板

ど う し が

接 着

す る

凝 集

と

，

血 小

板

が

他^の細 胞

又 は

基 質

と

接 着

す る

粘 着^に

あ る

^． 血 中及 び 血 小 板 中^に

は

^い

わ ゆ る

接 着 性 蛋白

が

存 在

し

，

血

小 板

の

機 能 発 現^に重 要

な

役割

を

果

た し て

^い

る

^{1 −．}

す な わ ち

血

小

板

は そ れ

単 独^で

は

他^の血 小 板 及

^び

細 胞^に特 異 的^に 接 着

す る

^こ

と は

出来 ず

了

接 着 性 蛋 白

の

介 在

が あ

^って初

め て

凝 集及

び

粘 着

が

可 能^に

な る

の

で あ る

^． 接 着性 蛋白 及

び そ の

受 容体^に関

す る

研 究

は

近 年 急速

な

進 歩

が

見

ら れ

^{つ つ}

あ る

． 接 着 性 蛋 白^{に つ い}

^{て は}

^，

^{1 9 8}

⁴年 ^に

R u o s l a h

t

i ら が

フ ィ

プ ロ ネ ク チ

^ンt

fi b r o n e c

t

i n

，

F N

l^の 細 胞 結合 部 位

が R G D

げ^ルギ^{ニ ン ー}

グ リ

シ ン ^ー

ア

^ス パ

ラ

ギン酸1

の わ

ず

か 3

つ

の ア ミ

ノ酸

か ら な る

小

さ な

配 列

で あ る

事

を 示 し た

^2I．

そ の

後

の

フ ィ

プ リ

^ノ

ゲ

ン

t

fib r i n o

g

^{e n}

，

F b

g

n

l^錮，

V O n W ill ^e b r a n d

因

子

く

^{v o n} W ill e b ^{r a n} d f a c

t

o r

，

V W F

1^{5 ，}，

ト ^ロ

^ン

ボ

ス

ポ

ン

ジ

^ン く^t

^{h r o m b o s} p ^{o n} d i n

，

T S P

1^6一，

な ど

^い

く

^{つ か}

の

蛋 白に

も

同

様

の

配列

が

あ

る

こ

と が わ か ^っ て き た

^刀

が

，

そ の

^い ず

れ も が

血 小 板

の

凝 集 及

び

粘 着^に 深

く か か わ ^っ て

い

る

⁸

^ト

^{1 8}

¹

^{． 一} 方受 容 体^に関

し て は

，

そ

の ^ヘ

テ ^ロ

ダ

イ ^マ

^ー

な

構 造

と ア ミ ノ

酸 配 列

の

相 同性

に よ り

， 血 小 板 膜 表 面 上に存 在

す る

粘 着 性 蛋 白 受 容 体

の

^{一 つ}

で あ る

糖 蛋 白 く

G l

y

c o

p

^{r o}

t

e i n

，

G P

I

I Ib

l

III a は

， 線 維 芽 細 胞

上 に

存 在 す

る

フ ィ

プ ^ロ ネ ク テ

^ン受 容 体

な ど と

共^に

イ

ン

チ

グ

リ

^ン ス ^ー パ ^ー フ ァ

ミ リ

^ー

と

呼 ば

れ

^{1 mの}，

血

祭^{フ ィ}

プ ^ロ ネ ク テ

ンくp

l a s m a fib r o n e c

t

i n

，

P

⁻

F N

l^{1 9 ，2}

⁰

， フ ィ

ブ リ ノ

ゲ

ン²¹

^川

，

Y W F

^{訃 m}

な ど が

結 合

し

，

や は り

血 小 板^の凝 集 及

び

粘 着^に深

く か か わ ^っ て

い

る

^{朴 粥．}

た だ し

血 小 板

の

場 合，

G P II

V

l工 I a は

活 性 化

さ れ る

^こ

と

^に

よ ^っ て

初

め て

接 着 性 蛋 白

と

結 合

す る

こ

と が

出 来

る

^{糾1 −一} 生 体 内

で

血 管 壁

が

破 綻

し た

場 合，

そ の

修 復 機 転^に

お

^い

て

最

も

重 要

な

役割

を

果

た す も の

の ^一つ に

止 血

血 栓

^の

形 成

が あ る

^一

止

血 血 栓

^は

血 小 板 凝 集 魂

を

中 心

と し て

形 成

さ れ る が

，

そ

の血 小 板 凝 集 魂

は

活 性 化

さ れ た

血 小 板 膜

上

の

G P n b

川

1 a

に フ ィ

プ リ

ノ

ゲ

^ン

が

結 合

し

^， 血小 板 間

を

架 橋

す る

^こ

と に よ ^っ て

形 成

さ れ て る と

考

え ら れ て

^い

る

^{42 ト 瑚．} 血 車 中

の

フ ィ

プ リ

ノゲ^ン

を

除

く た め

^に血 小 板

を

綾 衝 液^で洗 浄

し

， 最 終 的に緩 衝 液

で

再 浮 遊

さ せ た

洗 浄

血

d^一校

を ア デ

^{ノ シ ン}

5

^，−

^ニ リ

ン酸 く

a d e n o s i n e 5

^，−

d i

p

h o s

p

h a

t

e

，

A D P

l

で

刺 激

し た

場 合， フ ィ

ブ リ

ノ

ゲ

ン

を

再 添 加

し な

^い

と

血 小板

は

凝集

^せ

ず，

そ の

最 大 凝 集 率

は

添 加

し た

フ ィ

プ リ

ノ

ゲ

^ン量に相 関

す る

^{恥 仰．}

ト ^ロ

^ン

P l

t

，

p

la

t

ele

t ニ

P M S F，

p

he n

y

lm e

t

h

_y

l

ビ

ン刺 激^の場 合

は

フ ィ

ブ リ

^ノ

ゲ

^ン

を

再添 加

す る

必要

は な

^い

が

， お

そ ら く 血

小 板 中^に存 在

す る

フ ィ

プ リ

ノ

ゲ

^ン

が

凝 集^に関 与

し て

^い

る も

^の

と

考

え ら れ て

^お

り

^{4 8 ト 抑}

フ ィ

プ リ

ノ

ゲ

^ン

は

血 小 板 凝 集 魂 形 成^に

と っ て

必 須

の

因

子 と

考

え ら れ る

^． フ ィ

ブ リ

ノ

ゲ

ン

と

同様^に

血

梁 中^に存 在

し

，

ま た

同

じ

接 着 性 蛋 白

の

^一 つ であ

る ^v W F は

，

A D P

^お

よ

び

ト ^ロ

^ン

ビ

ン刺 激 時に活 性 化 血 小 板 上

の G P 工 工

V

l王 I a へ

の結 合

を

フ ィ

プ リ

^ノ

ゲ

ン

と

競 合

す る

こ

と や

^{2 引 殉}， 無フ ィ

プ リ

^ノ

ゲ

^ン血 症 患 者^の血 小 板 凝 集 魂

形 成

に

重 要

な

役 割

を

果

た す

^こ

と

^訂I

が

報 告

さ れ て お り

^， 種^{々 の}刺 激 物質

で

活 性 化

さ れ た

血 小板 膜 表面^に対

す る

反 応 性

は

， 親 和 性の違^い

は

あ

る も の

の⁶¹

ウ

ィ

ブ リ

^ノ

ゲ

ン

と ほ ぼ

同 ^一

で あ る

^．

と

こ

ろ が

， 同 様に血 祭 申^に存 在

す る

接 着 性 蛋 白

の

^一 つ

で

あ

る

血 祭フ ィ

プ ^ロ ネ ク チ

^{ン に} 関

し て は

，

そ の

血小 板凝 集に

お け る

意 義

や

活 性 化

血

小 板^に対

す る

結合 性

は

依 然

と し て

明

ら

か

で な

^い． 血 祭

フ ィ

ブ ^ロ ネ ク チ

^ン

は

洗 浄 血 小 板^の

ト ^ロ

ン

ビ

ン凝 集

を

抑 制

す る と

報 告

さ れ て

^い

る

^{5 2−}

が

，

一方

で は 血

奨フ ィ

ブ ^ロ ネ タ テ

ン に対

す る

単

ク ^ロ

^{ー ン}抗 体

が

洗 浄

血

小 板^の

ト ^ロ

ン

ビ

ン凝 集

を

抑 制

す る と す る

報 告

が あ る

^瑚．

ま た

，

ト

ロ

ン

ビ

ン に

よ

^っ

て

刺 激

さ れ た

血 小 板

に は

結 合

す る が A D P

刺激

さ れ た

血 小 板に

は

結 合

し な

^い

と す る

報 告

が

あ

り

^弘，， 同

じ

接 着 性

蛋

白

で あ る

フ ィ

プ リ

^ノ

ゲ

^ン

や

v w F と は

清性 化 血 小 板

^に

対

す る

結合 性

が

違

う

^こ

と が

想 定

さ れ て

^い

る が そ の

詳 細

は

不 明であ

る

^．

そ

^こ

で

今

回 の

実験

で は

， 血 小板 凝集^に

お け る

血 襲フ ィ

プ ^ロ ネ ク テ

ン

の

意 義

を

検 討

す る

目 的

で

， 洗 浄

血 小

板

の A D P

凝 集 能 及

び

放 出 反 応^に対

す る

血 祭フ ィ

プ ロ ネ ク チ

^{ン の}影 響

に関

し て

検 討

し た

0

材 料

お よ び

方 法

I

^． 材 料

ゲ ラ チ

^{ン セ フ ァ}

^ロ

^{ー ス}

ゲ

^ル く

G e l a

t

i n s e

p

h a r o s e

4

別，

ア

^ル ギ

^ニ

^{ン セ フ} ァ

ロ

^ー ス

ゲ

ル く

A r

gi

^{n i n e}

s e

p

h a r o s e 4 B

l 及

び

^{セ フ} ァ

^ロ

^ー ス

ゲ

^ル く

S e

p

h a r o s e

4 B

l

は P h a r m a c i a L K B B i o

t

e c h n o l o

g y く

U

_{p p}

s a l a

，

S w e d e n

l

よ り

購

入 し た

^．

カ ラ

ム

は

，

E c o n o

⁻

C O l u m n

く

B I O

⁻

R A D

，

R i c h m o n d

，

U

^．

S

^．

A

1⁻

を

使

用 し た

^{． フェ}

^ニ

^ル

メ タ

^{ン ス ル}

ホ

^ニル フ ル

オ リ ド

くp

h e n

y

l m e

t

h

y

l s u lf o n

y⁻

1fl u o r id e

，

P M S F

l，

ウ

^シ血 清

ア

^ル

ブ ミ

^ン く

^{b o v i n e}

s e r u m a lb u m i n

，

B S A

l^，

ア ピ ラ

^ー

ゼ

，

ア デ

ノ シ ン

5

^，一

三 リ

ン酸 く

^a d e n o s i n e 5

^，一t

r i

_p

h o s

p

h a

t

e

，

A T P

l，

ア デ

ノ シ

s ulfo n

y

lflu o ride

i

P R P ，

p

la

t

ele

t

rich

_p

la s m a

ニ

S D S，

s od iu m d ode c

y

l s ulfa

t

e

i

T B S，

t

ris⁻buffe r ed s alin e

三

T ris，2⁻a min o⁻

2

⁻h

_y

dr o x

y

^{m e}

t

h

_y

⁻1，3⁻

_p

^{r O}

p

^， a n ediol

_ニ

V W F， V O n W i11ebr a nd fa c

t

o r

血

小 板

凝

集に お

け る

血 柴_{フ ィ}

ブ ^ロ ネ ク チ

^ン

の

意 義

ン

5

^，エ

リ

^ン酸 く

^{a d e n o s i n e 5}

^，−

^di

p

h o s

p

h a

t

e

，

A D P

l， ル シ フ ェ

リ

ン ル シ フ ェ

ラ

^ー

ゼ は S i

g

^{m a}

く

S

t．

L o u i s

，

U

^．

S

^．

A

J^．

よ り

，

ベ

ン

ズ ア ミ ジ

ン塩 酸 塩 く

b e n z a m id i n e

h

y

d r o c hl o r id e

，

B z

J

は A ld r i c h c h e m i c a l c o m

p

^{a n}

y

く

M il w a u k e e

，

U

^．

S

^．

A

J^．

よ り

，

6

⁻

ア ミ

ノ^ー

N

^．カ

ブ ^ロ

ン酸 く

e

⁻

a m i n o

^．

n

⁻

C a

p

r O i c a c i d

，

6

^．

A C A

ン，

ア ク リ

ル

ア ミ ド

，

N

，

N

^，．

メ チ

^{レ ン}

ビ

ス

ア ク リ

^ル

ア ミ ド

，

ド デ

シ ル硫 酸

ナ ト リ ウ

^ム，

N

，

N

，

N

^，

N

^，−

テ

ト

ラ メ チ

^ル

^エ チ

^{レ ン}

ジ ア ミ

^ン， 過 硫 酸

^ア

^{ン モニ}

^ウ

^ム ，

2

⁻

メ

ル

カ プ ト エ タ

^{ノ ー} ルく

2

⁻

m e r C a

p t

O e

t

h a n o l

，

2 M E

J，

L

⁻

ア

ルギ^ニン，

エ チ

レ ン

ジ ア ミ

^ン

四

酢 酸 く

e

t

h

y

l e n e d i a m i n e

t

e

t

r a a c e

t

i c a c id

，

E D T A

l

は

和 光 純 薬

工

業 株 式 会 社 く大 阪I

よ り

購

入 し た

^{． ヘ パ}

リ

^ン く

s o d i u m h e

p

a r i n

l

は N O V O

⁻

N O

⁻

R D IS K a

l

s

く

B a

g

s v a e r d

，

D e m m e r k

l

よ り

^，

3

^．

8

％赤 沈

用 テ ト ラ

^ー

ト は

， 国 際 試 薬 株式 会 社 倖申戸1

よ り

購

入 し た

． フ ィ

プ リ

ノゲン

は K a bi V i

t

r u m

く

S

t

o c k h o l m

，

S w e d e n

J

よ り G r a d e L の も

の

を

購

入 し

，

ク ^エ

ン酸

を

含

ん

で い

る た め 1 5 0 m M N a C l

1

2 0 m M 2

⁻

a m i n o

⁻

2

⁻

h

⁻ y

d r o x

y

^{m e}

t

h

_y

l

⁻

1

，

3

⁻_p

r O

p

^{a n e} d i o l

く

^{T r i s}

ン^ー

H C l

p

H 7

^．

4

く

T r i s

⁻

b u ff e r e d s a li n e

，

T B S

I ^に

て

透析 後 使 用

^{し た}

^．

^そ の

他 試 薬

は

，

す

^べ

て

生 化学 実 験 用

又 は

分 析

用 を

使

用 し た

^．

工 工

．

血

紫フ ィ

プ ^ロ ネ ク テ

ン の精 製

血 祭フ ィ

プ ^ロ ネ ク ナ

^ン

は

，

S i x m a ら の

方 法^{珂 に}準

じ

，

一部 改 変

を

加

え て

行

っ た

．

す な わ ち

， 有 効 期 限

の き れ た

新 鮮 凍 結 血 襲

を

溶 解

し

，

E D T A 5 0 m M

，

P M S F O

^．

2 m M

，

B z 5 m M

，

e

⁻

A C A 5 m M

，く^いず

れ も

終 濃 度 い^こ

^{な る よ う}

^に添 加

し

， 遠

心

機 く

^{M o d e l R S}

⁻

^{1 8} T o m

y

s e ik o

，

T o k

y

o

l ^に

て 7 0 0 0 r

p

m 1 5

分 く

4

^O

C

l 遠 心

し た

^，

上

清

を

集

め

， 脱月旨綿^に

^て

脱 脂

し た

後^に脱 気

を お

こ

な

っ

た

．

S e

p

h a r o s e 4 B 及 び G e l a

t

i n e s e

p

h a r o s e

4 B は

あ

ら か じ め 5 0 m M T r i s

⁻

H C l

くp

H 7

．

4

J

1 50 m M N a C l

，

5 m M E D T A

，

0

．

2 m M P M S F

，

5 m M B z

，

5 m M e

⁻

A C A

，く緩 衝 液

A

I ^で室 温 下^に平 衡 化

し て

^お

き

， 脱 気 後の検 体

を S e

p

h a r o s e

4

B を プ レ カ ラ

ム

と し

て

G e l a

t

i n e s e

p

h a r o s e

4

B

に添 加

し た

^． 添加 後，

プ レ

カ ラ

ム

を

の

ぞ き

，

G e l a

t

i n s e

p

h a r o s e 4 B を

充 分量^の緩 衝液

A

で洗 浄

し た

^．

さ ら

^に充 分

量

の

5 0 m M T r i s

⁻

H Cl

くp

H 7

^．

4

J，

1 M N a C l

に て洗 浄

し

， 最 終 的に

5 0 m M

T r i s

^．

H C l

くp

H 7

．41，

1 M L

⁻

ア

ル

ギ

^{ニ ン に}

て

溶 出

し た

^． 吸光 度 計^に

て

吸 光 度^の高^{い フ}

ラ ク

ショ ン

を

集

め

， 大

量

の

5 0 m M T r i s

⁻

H C l

くp

H 7

．

4

I ^に対

し て

4 ^O

C

に

て

数

回

透 析

し た

^． 透 析 後 あ

ら か じ め 5 0 m M T r i s

^．

H C l

くp

H 7

^．

4

I

に

て

平衡 化

し た A ^r

g

i n i n e s e

p

h a r o s e 4 B に

添 加

し

， 充 分量

_{の 5 0 m M T r i s}

−

H C l

くp

H 7

．

4

1 ^で洗 浄

し た

の

ち 5 0 m M T r i s

⁻

H C l

くp

H 7

^．

4

ン

1 5 0 m M N a C l

く

^{T B S}

l ^に

て

溶

1 7 5

出

し た

^． 精 製

し た 血

襲フ ィ

ブ ^ロ ネ ク ナ

ン の濃 度

は 2 8 0 n m

の吸 光 度に

お

^い

て

1

m

gl

m l

^ニ

1

．

2 8 と し て

計 算

し

， 適 当

量

に分 注

し

て−

8 げC

^に

て

凍結 保 存

し た

^．

II王

^． ヒ

ト

洗 浄

血 小

板^の調製 法

ヒ

ト

洗 浄

血 小

板

の

調 製

は

，

M u s

t

a r d の

変 法^{5 61 5 乃 に}

よ っ て

お こ

な っ た

^．

す な わ ち

， 血 小板 機 能^に影 響

す る と お も わ れ る

薬 剤

を

少

な く と も 2

週 間 以

上

飲

ん で

い

な

い健 常者

の

肘 静 脈

よ り

，

あ ら か じ め3

^．

8

％の赤 沈

用 ク

エ

ン酸

ナ ト リ ウ

ム

を 2 ^m l 入 れ た

注 射簡で

2 0 m l

に

な る よ う

に採 血

し

，

8 00 r

p

m で

1

5 分

間遠

心 し て

多

血

小 板

血

祭 くp

l a

t

e l e

t

r i c h

p

l a s m a

，

P R P

l

を

得

た

^．

そ の P R P

の P

H を

¹

M ク ^エ

^ン酸に

て6

．

5

に

し

，

そ

の後

2 4 0 0 r

p

^m で

1

5

分 間遠 心

し て 上

清

を

捨

て

血 小板

の

^ペ

^レ

ッ

ト を

得

た

^．

そ

の ペ

レ ッ ト

洗 浄

用

緩 衝 液 く

^{1 4 0 m M N a C l}

，

1

．

2 8 m M K Cl

，

0

．

4 2 m M N a H

2

P O

．^．

2 H D

，

1 1

．

9 ^m M N a H C O

，_，

1．

O ^m M M

g

C l

^．

6 H

2

0

，

0

^．

2 m M C a CI

z^．

2 H

D ，

0

^．

0 2 m M N a

f

I

6⁻

H

5

0

7

．

2 H

D ，

5

．

6 m M

g

l u c o s e

，

1

％

B S A

い^こ終 演 度

2 5 U

l

m l と な る よ う

に^ヘパ

リ

ン，

1 U

l

^m l と な る よ う に ア ピ ラ

^ー セ

を

加

え た も の に

再 浮 遊

さ せ

，

3 7

⁰

C

で

3 0

分間 膵 置

し

，

2 20 0 r

p

^m で1 0

分 間 遠 心

し た

^．

上

清

を

捨

て

， 洗 浄

用

緩 衝 液^に終 演 度

1 U

ノ

^m l と な る よ う

^に

ア ピ ラ

^ー セ の

み を

加

え た も

の に

て

再 浮 遊

し

，

3 7

⁰

C で 3 0

分 膵 置

し

， 同様

に

遠 心

し た

^． 遠心 後 上 清

を

捨

て

， 最 終 的^に 洗 浄

用

緩 衝 液

よ り C ^a C 1

2^．

2 H

D

を

の

ぞ

^い

た も の に

て再 浮 遊

さ せ て 血

小 板 浮 遊 液

と し

， 実 験に使

用 し た

^．

I V

^．

血 小

板

凝

集 能^の検 討

法

血 小 板 凝 集 能

^は

， 血 小 板 凝 集 計 t

^{H e m a}

^t

^{r a c e r} I V

，

N B S

，

T o k

y

o

l

を も ち

^い

て

， 透光 度

の

変 化^に

よ り

測 定

し た

^．血 小 板 浮 遊 液

15

伸

1 を3 アC で

膵 置

し

，

2

分 後^に 擾 拝

を

開始

し た

^．

3

分後に血 祭フ ィ

ブ ^ロ ネ ク チ

ン溶 液

ま た は

対 照^の

T B S を 2 5

ノ^J

l

添 加^．

4

分 後に フ ィ

ブ リ

ノゲン溶 液

2 5

_声

1

添 加

し

，

5

分 後^に

A D P

溶 液

を 2 5

月

1

添 加

し て

血 小 板 凝集

を

惹 起

さ

せ

た

^．

そ

の後^の観 察

は

最低

7

分 間 行っ

た

．

V

．

血 小

板 放 出

反

応^の検 討

法

血 小 板 放 出

反

応

は

， ル シ フェ

リ

^{ン ル シ フ ェ}

ラ

^ー

ゼ

法

に

よ

っ

て

検 討

し た

^脚．

す な わ ち

，

A T P

に

よ り

螢 光

を

発

す る

酵 素^で

あ る

^{ル シ フ ェ}

リ

^{ン ル シ フ ェ}

ラ

^ー

ゼ を

添 加

し

，

そ の

螢 光^の強

さ

に

よ

っ

て 血

小板

の

漉 染 顆粒^か

ら

放 出

さ れ た A T P

の量

を

算 定

す る

方 法

で あ る

^． 定 量

は

，

発 光

が

最 大に達

し た の ち

に既 知 濃 度の

A T P を

添 加

し

，

そ

^の発 光^の増加 分

を

内部 標 準

と し て

行

わ れ る

^． こ

れ ま で

^一 般^に， こ の方法

は P R P

に対

し て

行

わ れ

^て

^い

る

方 法

で

あ

り

，

は じ め

か

ら

^{ル シ フェ}

リ

^{ン ル シ フ ェ}

ラ

^ー

ゼ を

添加

し て お き

，

そ の

後^に凝 集 惹起 物 質

を

添加

し て

そ の

螢光^の変 化

を

凝 集 能

^と

共^に経 時 的^に検 討

す る

く図