博士（医学）曽我良輔 学位論文題名

     博士（医学）曽我良輔 学位論文題名

IL

一

6

とホルボルエステルによるマウス未分化造血前駆細胞の コロニー形成とそのシグナル伝達

学 位 論 文 内 容 の 要旨

〔目的〕

  

造血幹 細胞に 作用す るサイト カインの中でインターロイキン―

6

（IL−6）、顆粒球コ口ニー刺激因子（

G

―

CSF)

、IL−

11

、IL―12、

Leukemia inhibitory factor¥ Stem cell factor

は

Go

其

H

にあ る 未 分化造 血前駆 細胞に 働き、細 胞周期へと移行させる共通の作用 を有する。一方、

IL

−

3

と顆粒球―マク口ファージコロニー刺激因 子

(GM

ー

CSF)

には上記のような作用はないが、細胞周期ヘ移行した 前 駆 細 胞の 活発な 増殖を 支持する 能カを 有する 。最近 、

IL

−

6

と

protein kinase C(PKC)

の活性イヒ剤の一一っである12−0―tetraーdec

anoyl

―phorbolー13―acetate (TPA)との併用により顆粒球一マク口 ファージコロニー形成細胞の増殖が刺激されることが報告された。

も しこの 組み合 わせが 未分化造 血前駆細胞の増殖を刺激するとす れ ば、ま だ十分 には解 明されて いないサイトカインによる未分化 造 血前駆 細胞の 増殖に おけるシ グナル伝達機構の解明の一助にな る ことが 想定さ れる。 そこで、 私は

IL

―

6

とTPAとが未分化造血前 駆 細胞の 増殖を 支持で きるか否 か、その増殖のシグナル伝達はど のようなものであるかにっいて検討した。

〔対象および研究方法〕

1

．

TPA

と

IL

―

6

によ る未分化 造血前 駆細胞 のコ里 三ニ形 成：無 菌 環境 下 に飼育 した

BDF

ユ雄性 マウス を

10

な いし

15

週齢で 用いた 。 未分化造血前駆細胞の濃縮のため、 150 mg/ kgの5−FUを尾静脈よ り注入し、

48

時間後に大腿骨を採取して、骨髄細胞浮遊液を得た。

この 細 胞を種 々のサ イトカ インと ともに

2

週間培 養し、 倒立顕 微 鏡下に

50

個以 上の細胞 から成 る細胞集塊をコ口ニーとしてコ口二 ー型に従って算定した。

2

．

Delayed addition:IL

−

6

と

TPA

との 併 用 によ るコ口 ニー形 成 におい ぞ司冫

6

と

TPA

は 同時に 存在しなければならないか否かを、

delayed addition

に よって 検討し た。培 養開始 時に

IL

―

6

、あ る し、 は

TPA

を 添 加 して お き 、 培養

2‑4‑8

日 目 に

TPA

．また は

IL

―

6

を添加した。

〔結果〕

1

．

TPA

と

IL

−

6

に よ る 未 分 化 造 血 前 駆 細 胞 の コ 里 三 ニ 形 成 ：

TPA

および

IL

−

6

軍爾はーコ石―三ー形成爾

1

―，まとんど認められなかった。

IL

−

6

と

TPA

と を 併 用 す る と

14

日 目 に は

11

個 の コ ロ ニ ーが 形成 さ れ た 。 コ 口 ニ ー 形成 を 経時 的に 観 察す ると

IL

→

3

によ るコ 口 ニー 形成 に 比 較 し て 形 成 さ れ る コ ロ ニ ー 数 は 少 な か っ た が、 経時 的 増加 傾 向 は ほ ぼ 平 行 し た 。

IL

―

6

と

TPA

と に よ り 形 成 さ れる コ 口ニ ーは 、

GM

コ ロ ニ ー 、

GEMIK

コ 口 ニ ー 、

Blast

コ 口 ニ ー で あ っ た 。

2

．

Delayed addition:

培 養 開 始 時 に

IL

―

6

を 添 加 し て お く と コ ロ ニ ー 数 百 彊 彌 眄 孫 た れ 、

TPA

の 添 加 が お く れ る ほ ど コ 口 二 ー 数 は 滅 少 す る 傾 向 に あ っ た 。 一 方 、

TPA

を 培 養 開 始 時 に 添 加 し て お き

IL

ー

6

を お く れて 添加 し た場 合に は コ口 ニー は ほと んど 形 成さ れな かった。

3

．

PKC cD down regulationcD

三 里 三 ニ 形 成 に お よ ぼ す 影 響 ：

TPA

溶 液 と 同 一濃 度の

DMSO

を用 い たコ ント 石 こー ルで は 、骨 髄細 胞 の

105

個 あ た り

6

個 の コ 口 ニ ー が 形 成 さ れ た の に 対 し 、

TPA

と

48

時 間 培 養 し た も の で は コ 口 ニ ー は 全 く 形 成 さ れ な か っ た 。

4

． 蛋 白 質 リ ン 酸 化 酵 素 阻 害 剤 の コ 旦 三 ー 形 成 に お よ ぼ す 影 響 ：

  

カ ル フ ォ ス チ ン

C

は

100nlK

（

PKC

に 対 す る

IC50

の

2

倍 の 濃 度 ） 以 上 の 濃 度 で

IL‑3

お よ び

IL

―

6

十

TPA

に よ る コ 口 ニ ー 形成 を完 全 に 抑 制 し た 。 ゲ ニ ス テ イ ン は

1

彫

g/ ml

（

EGF

レ セ プ タ ー の

IC50

に 当 た る ） 以 上 の 濃 度 で

IL

−

6

十

TPA

に よ る コ 口 ニ ー形 成 を完 全に 抑 制 し た 。 ハ ー ビマ イ シン

Al00

―200ng/mlの濃 度で

IL

ー

3

によ るコ 口 ニ ー 形 成 は 完 全 に 抑 制 さ れ 、

IL

−

6

十

TPA

に よ る コ口 ニ ー形 成は

75

   

と

C

在。

．・ よヽ

A

成 単加 て

： す

H

存 た 響 百

C

ン 形

・

6

邨 添 し 響て が

A

し影 剤ン シ

   

ー

n n

を姶 影 百 成 仰 養 す 害 チ ィ ニ は ヽ

M

開 す

i

形 の 培 ぼ 阻 ス マ

   

ロ い で

T

を

。 ぼ−

n

ー

M

と よ― 素オ ビ

   

コ るこ に養 た よ 而 ニ

『

A

お 麗 フ ー

   

る あ そ 目 培 し お

l

れロ

1 0

仲 にー 化ル ハ

   

ょ

M

。 日に 加 に−

n

コ 釟十 成

―酸 カと に

T

る

2

も添 成

― 昭 る め 邨 形 覇 て ン せ は あ 養 と に 形

l

‑

よ た

n

ー 可 し イ わ ゼ で 培 と も ーー 恥に るヽ 三 質と テ合 ー明 ヽ邨 と 三 め と す 後 ロ

― 白 剤 ス み ナ 不 し

n

と ロ

・ の

A

討 浄 コ 冨 害ニ

   

・ は姶 に 剤 コ

c

仰検 洗の

―が 阻ゲ 蝋― 舛か 開次 害 の腿 とを て剤 爾

C

て樹 シ否 を。 阻

n

爾 邨か し害 而

K

し壷 ロか 養た は

．薹

I

触

n

否 養阻 ー

P

と旧 チる 培し た

‑

接 で か 培 素 ニ を 剤 亠 と れ に 察 ま

l

‑

的 こ の 間 酵 百 か 害 丱 聡 さ も 観 ヽ

l

性 そ も 時 化

― コ 否阻

。

n P

化 と を独 一磯 矼焔 棚酸 添か ゼた

r ‑ 0

： 性と 成単

       

ぞン

T

る ーし 甜響 雇剤 形を 堂と い介 胞リ ー にれ ナ討

d

影 司害 ー

M

の 爾 て を 細 質

A

さ キ検 門 す ーつ 阻 ニ

T C

ー 細 れ 化 髄 白 印 制ン て

h

ぼ− よ は口 に

M

西 さ性 骨蛋 ー十 抑シ い恥 よ百 たコ 目

．

A

告 活 に

． 邨 て 口用

． お

―み ま て日

3

仲 矧の 下

4

n

っ チを

5

に 面独 し

2

％抑制された。

5

．

Delayed addition

と 阻 害 剤 の 組 み 合 わ せ に よ る コ 口 ニ ー 形 成 におよぼず影霤IIL一醒固酉―で百5―丁面―の−・コDニ．ーが形成された が、こーれ,  t三―カルフエスチン

C

またはハービマイシンAを併用する と そ れ ぞ れ の 添 加

lOOnM

以 上 、

200ng/ml

以 上 で コ 口 ニ ー 形 成 が 抑 制 さ れ た 。

IL

―

6

と と も に 培 養 を 開 始 し て 、

2

日 目 に

TPA

を 単 独 ま た は 阻 害 剤 と と も に 添 加 す る と 、

TPA

に よ る コ 口 ニ ー 形 成 の 増 強 効果は阻害剤によって打ち消された。

〔 考按 〕

  IL

−6と

TPA

とに よ るコ 口ニ ー 形成 はIL−

3

の それ には わ ずか にお よ ば な い も の の 、

GM

コ 口 ニ ー の み で なく 、

GEMM

コ ロ ニー と芽 球 コ ロ ニ ー を も 含 む こ と か ら

GM

コ ロ ニ ー 形成 細 胞よ りも 未 分化 な前 駆 細 胞 由 来 の も の で あ る こ と が 示 唆 さ れ た。

IL

―

6

とTPAと の併 用 に よ る 最 大 の コ ロ ニ ー 形 成 に は 両 者 が 培 養開 始 時か ら存 在 する こと が 必 要 で 、

TPA

の 添 加 が お く れ る に っ れコ ロニ ー は減 少し 、

IL

―

6

が 培 養 開 始 時 か ら

2

日 間 存 在 し な い と 、

TPA

を 後 か ら 添 加 し て も コ 口 ニ ー は ほ と ん ど 形 成 さ れ な い こ と から 、 未分 化造 血 前駆 細胞 の コ 口 ニ ー 形 成 に は

IL

―

6

の 必 須 な こ とが 示唆 さ れた 。

TPA

と 細 胞 と の長 時間 接 ゑ虫 によ る

PKC

のdown regulationによ って

IL

―

6

十TP

A

の コ 口 ニ 一 形 成 作 用 が 打 ち 消 さ れ た 事 か ら

IL

−

6

と

TPA

の 併 用 作 用 は

PKC

を 介 し て い る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。

PKC

阻 害 剤 で あ る カ ル フ エ ス チ ン

C

あ る い は 、 チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 で あ る ゲ ニ ス テ イ ン 、 ハ ー ビ マ イ シ ン

A

に よ り

IL

―6+TPAのコ ロニ ー 形成 作用 が 抑 制 さ れ た こ と か ら

IL

―

6

十

TPA

の シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に は

PKC

、 お よ び チ 口 シ ン キ ナ ー ゼ の 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

    A

よ 阻上 ルぁ

        D r     T

に

C

以 ナで

   

と用 賦。 グ要

、

    6

併 的た シ必

   

卜

   

ヽ 異れ のが

   

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A

性

   

及な よ抑 仰活

   

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．

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O

ー 形チ

   

細た ニ成 のナ ーヽ

   

駆し ロ形

C

キ ニ化

   

前 討コ ー癶 ン ロ性

。

   

血検 はニ はシ コ活 た

   

造て で口 成ロ のの れ

   

化い 独コ 形チ こ

C

さ

   

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H

唆

〕未 には 的ニ い らヽ 示 論ス 用者 乗口 るか はが

   

ウ 作 両 相 コ あ 果 に と 結マ の． て． 剤 結達 こ

〔 と ー つ

2

害 の 伝 る

学 位 論文 審 査 の 要旨

主査′教授 副査   教授 副査   教授      学位論

川上 小野江 上出 文題名

IL

−6とホルボルエステルによるマウス未分化造血前駆細胞の コロニー形成とそのシグナル伝達

III

．結果

シ グ ナ ル 伝 述 機 柵 は 、

(IL

―

6)

と

ス テ ル の

TPA

と が 、 の シ グ ナ ル 伝 述 は ど の

15

遡 齢 の 細 胞 浮 遊 以 上 の 細 し ておき、

  

：

TPA

と ー 形成が、

イ ン、

独 ま た は

−

6

と と も し た 。 さ

、

IL

ー

6

と

和則 光 義和 利

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……   

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  1) 11

−

6

と

TPA

は

qi

独 で は 乗的にコロニー形J戊を支持した

  2)

コ ロ ニ ー 形 成 は

GM

コ 口 を も 含 む こ と か ら

GM

コ ロ ニ ー ることが示唆されたヵ

  3)

コ ロ ニ ー 形 成 は 、

PKC

あるいはチ口シンキナーゼ｜叭轡

W.考察及び縦；糾

コ ロ ニ ー 形 成 を 支 持 で き

。

ニ ー の み で ナ ょ く 、 GEM 形成網川包よりも氷/．/｝化な

ないが、併 用によって杣 Mコロニー と芽球コ口ニ

nH鰍 網 ‖Jl包 ｜li来 の も の で あ び特輿『r、Jl KC llll'*i′r卉II、

以上 の 結 采か ら 、こ の コ ロニ ー 形 成に お ける

IL

ー6とTPAと のシ グ ナ ル伝 述 に

ー 89 ‑

      C さン m 成チ

／ 形ス 恥 くオ びー 仝フ よは がル おン ー    カ も ィ ニ   

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