博 士 （ 医 学 ） 高 橋 将 成

博 士 （ 医 学 ） 高 橋 将 成

学 位 論 文 題 名

Studies on the Role of Natural KillerTCells on Cardiac Hypertrophy     and Failure in Mice due to Chronic Pressure Overload in Mice    イ （ 夢 篤 写 笋 夢 f ≠ 李 三 ジ 孟 睾 歩 聖 荼 齏 諺岩 謹 菰 轟 芋 嘉 易 銑）

     学位論文内容の要旨

【背 景と 日 的】 心肥 大は 心不全の代表的な 予後予測因子である，圧負荷 に対して初期には 代償 性に 求 心性 心肥 大が 生じ，心室壁への ストレスを正常化させ，左室 のポンプ機能を維 持し よう と する ．し かし ，過剰な圧負荷が 持続すると代償機構は破綻し ，心筋の拡張およ び収 縮機 能 が障 害さ れ， 病的心肥大と心リ モデリングが起こる．炎症は 心リモデリングの 重 要 な 分 子 生物 学的 因子 の ーっ であ り， イ ンタ ーロ イキ ン6 (IL‑6)や腫 瘍性 壊死 因 子a (TNF‑a)は， 心肥 大や 心 不全 の進 展に 重 要な 役割 を担っている．一方， 慢性炎症は病的心 肥大 から 心 不全 へと 移行 する過程で保護的 に働くことも報告されており ，心臓における炎 症 が 心 不 全 に お い て 両 方 向 性 の 役 割 を 果 た し て い る 事 を 示 唆 し て い る ．     Invariant natural killerT(iNKT)細 胞 は ，NKマ ー カ ー で あ るNKl.1と 可 変 性 の 無 いT細 胞 受 容 体 （ マ ウ ス で はVa14Ja18)を 発 現 す るT細 胞 で あ り，CDldで 提示 され た 糖脂 質抗 原 を認 識す る． 代表的リガンドで あるa‑galactosylceramide (aGC)はiNKT細胞を 活性 化さ せ ，大 量のT‑helper typel(THI），TH2サイトカインおよびケ モカインを産生し て獲 得免 疫 反応 を形 成す るこ と からiNKT細胞 は自 然 免疫 と獲 得免 疫 の架 け橋として機能 し， 組織 炎 症を 統制 して いると考えられて いる．様々な動物モデルにお いて，iNKT細胞は 保護的な役割が 報告されており，その作用は ，TH2サイトカインの産生に 依存していた．し たがって，iNKTは心肥 大や心不全の進展においても 保護的に作凧することが期待されるが，

心 肥 大 ， 心 不 全 進 展 に お け るiNKT細 胞 の 役 割 を 検 討 し た 報 告 は 皆 無 で あ る ．     本 研 究 で は ， 圧 負 荷 に よ り 生 じ た 心肥 大， 心不 全 にお けるiNKT細 胞の 病態 生理 学 的な役割について検討した，

【 対 象 と 方 法 】 雄 の 野 生 型C57BL/6Jマ ウス(WT)およ びJa18遺伝 子を ノ ック アウ トさ せ たJal 8‑'‑マウ ス(KO)を 使用した．マウス 圧負荷心不全モデル作成の代 表的な手術である 大 動 脈 縮 窄 手 術(TAC)及 びSham手 術 をマ ウ スに 施行 した ．実 験 は， 以下 の4セク ショ ン に 分 け て 行 っ た ． ＠WTを 用 い てTAC後 のiNKT細 胞 受 容 体 のVa14Ja18遺 伝子 の定 量的 リ ア ル タ イ ムPCRによ る経 時的 変化 を 観察 した ．◎ 圧負 荷 心不 全モ デル に おけ るiNKT細 胞 欠 損 の 影 響 を 検 討 し ，WT+Sham，KO+Sham，WT+TAC，KO+TACの4群で 解 析し た， まず ， 5週 後の 検討 を行 い， 生 存率と組織重量，心 エコー，血行動態変化を観 察した．次に，2週 後の検討を行い，組織 重量，・心エコー，血行動態変化，組織学的解析，リアルタイムPCR， フロ ーサ イ トメ トリ ー， 免疫ブロット法， 免疫組織染色での評価を行っ た．◎圧負荷心不 全モ デル に おけ るiNKT細 胞活 性 化の 影響 を検 討し ，aGC（1回0.1 pgg）も しくはPBSを，

術後第1，4，8，11，14病日に腹腔内投与の上Sham十PBS，Sham十aGC，TAC十PBS，TAC十舶Cの4 群で5週 後の 生存 率と 組 織重 量， 心エ コ ー， 血行 動態変化を解析した， ＠圧負荷心不全モ デルにおけるIL‐10受 容体抗体（IL‐lORAb）投与の効果を検討し，lL‐10RAb（100川シマウ ス／回）もしくはPBSを術後第1，4，7，10，13病日に腹腔内投与の上，TAC十IL‐10RAb，1AC十PBS の2群 で2週 後 の 生 存 率 と 組 織 重 量 ， 心 エ コ ー ， 血 行 動 態 変 化 を 観 察 し た ，

【 結 果 】 マ ウス 正常 心筋 の 定量 リア ルタ イ ムPCR及び フ ロー サイ トメ ト リー でiNKT細 胞 の 存 在 を 証 明し ，W｀C手 術2週後 の 心筋 でiNKT細 胞の 発 現が 増加 して い るこ とを 定量 的 リア ルタ イ ムPCR及び フ ロー サイ トメ ト リー で確 認した．iNKT細胞を欠 損させることによ り ，WT十1ACと 比 較 し て ，KO十TACで はWT十TACと比 較し て5週後 の生 存 率は 低下 した ，

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ま た ， 心 重 量 ， 左 室 重 量 ， 及 び 肺 重 量 は 増 加 し， 左 室 内 径 が 増加 し ， 左 室 収縮 率 が 低 下 し，

左 室 拡 張 末 期 圧 は 上 昇 し た ，2週 後 で は ，KO+TACはWT+TACと 比 較 し て ， 心 重 量 ， 左 室 重 量 ， 肺 重 量 は 増 加 し ， 左 室 内 腔 が 拡 大 し ， 左室 内 径 短 縮 率 が低 下 し た ， 心筋 細 胞 断 面 積，

問 質 線 維 化 率 はKO+TACでWT+TACに 比 較 し て 増 大 し ，MMP‑2，pro‑MMP2活 性 化 の 増 大 を 伴 っ て い た ． 定 量 的 リ ア ル タ イ ムPCRに お い てWT+TACで は ，IL‑IOの 遺 伝 子 発 現 が 増 加 し た が ，KOマ ウ ス で は ， 減 少 し た ， 免 疫 ブ ロ ッ ト 法 で は ，KOマ ウ ス で ，ERKl/2の り ン 酸 化fま WTマ ウ ス と 比 較 し て 有 意 に 増 加 し ，KO+TACで は 更 に 増 加 し た ．TAC手 術 後 に ， iNKT細 胞 を 活 性 化 さ せ る と ， 生 存 率 に 有 意 差 が 無 か っ た が ，TAC十PBSに 比 較 し て1AC十aGC で は ， 心 重 量 ， 左 室 重 量 ， 肺 重 量 の 増 加 ， 左 室 内 腔 の 拡 大 ， 左 室 拡 張 末 期 圧 の 上 昇 な らび に 左 室 内 腔 短縮 率 の 低 下 は 有意 に 抑 制 さ れた ．1、AC十IL‐10RAbとTAC十PBSの 間 で ，生 存率 ， 組 織 重 量 ， 心エ コ ー な ら び に血 行 動 態 に 有意 差 が 無 か った ．

  【 考 察 】 本 研 究 で は ， マ ウ ス 心 筋 に お け るiNKT細 胞 の 存 在 が 明 ら か に さ れ た ．1AC手 術 後 の 心 筋 でiNKT細 胞 が 増 加 す る こ と が 示 さ れ た ． ま た ，iNKT細 胞 を 欠 損 さ せ る と ，TAC 手 術 後 の 死 亡 率 ， 左 室 リ モ デ リ ン グ ， お よ び 左 室 収 縮 能 が 悪 化 し ， 組 織 レ ベ ル で も 心 筋細 胞 肥 大 と 心 筋 問 質 線 維 化 が 増 大 し た ． さ ら に ，KOで はIL−10遺 伝 子 発 現 が 減 少 し ，ERKタ ン パ ク の り ン 酸 化 が 増 加 し た ． 一 方 ， 舳CでiNKT細 胞 を 活 性 化 さ せ る と ，TAC手 術 後 の 心 重 量 ， 肺 重量 の 増 加 お よ び左 室 収 縮 末 期圧 の 上 昇 が 抑制 さ れ た ．

    iNKT細 胞 は ， 自 己 免 疫 性 疾 患 や 炎 症 性 疾 患 な ど に お い て 保 護 的 な 役 割 を 果 た し て い る ． 一 方 で ，iNKT細 胞 は ， 動 脈 硬 化 の 血 管 壁 の 炎 症 や 耐 糖 能 異 常 で の 脂 肪 組 織 の 炎 症 を 活 性 化 さ せ る こ と か らiNKT細 胞 は 様 々 な 疾 患 の 組 織 炎 症 で ， 保 護 的 お よ び 攻 撃 的 の 両 方 向 性 の 役 割 を 担 っ て い る と 考 え ら れ る ，iNKT細 胞 の 保 護 的 な 役 割 はTHlか らTH2サ イ 卜 カ イ ン 産 生 優 位 ヘ シ フ ト さ せ る こ と や ，lL‐10等 の 抗 炎 症サ イ ト カ イ ンを 優 位 に 産 生さ せ る こ と に よ っ て 説 明 さ れ る ， 本 研 究 で は ，1AC手 術 後 のiNKT細 胞 数 の 変 化 に 伴 っ て ，IL‐10の 遺 伝 子 発 現 がWT十TAで で 増 加 し ，KO十TACで 低 下 し た ，TAC手 術 後 にIL・10RAbを 投 与 し IL‐10の 作 用 を 中 和 さ せ た が ，TAC十PBSとTAC十lL‐lORAbの 間 に 死 亡 率 お よ び 心 エ コ ー ． 血 行 動 態 ， お よ ぴ 組 織 重 量 デ ー タ に 有 意 差 は な か っ た ．1NF‐aは 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン と し て 作 用 し ， 心 毒 性 と 左 室 機 能 障 害 を 導 く 一 方 で ， 心 不 全 の 進 展 に 保 護 的 な 役 割 を す る 報告 も あ る ． 実 際 ，TNF受 容 体 抗 体 やTNF抗 体 を 心 不 全 患 者 に 投 与 し た 臨 床 研 究 で は ， 有 効 性 は 確 認 さ れ な か っ た ． 一 方 で は ，IL‐10と1NF―nの 比 が 心 機 能低 下 と 関 連 する 報 告 が あ り，

本 研 究 で 遺 伝 子 発 現 量 か ら 求 め たIL‐10′TNF‐a比 は ，KO十TACでWT十1ACに 比 較 し て 有 意 に 低 下 し て い た ． こ れ ら の 知 見 は ， 心 不 全 進 展 に 慢 性 炎 症 が 関 わ る 機 序 は ， 単 一 の サ イト カ イ ン で な く ， サ イ ト カ イ ン ネ ッ ト ワ ー ク の 調節 に 焦 点 を 当 てる べ き で あ るこ と を 示 唆 し，

iNKT細 胞 は ， 自 然 免 疫 反 応 と 獲 得 免 疫 反 応 を 繋 ぐ 架 け 橋 と し て 作 用 し て 圧 負 荷 心 不 全 に お け る サ イ ト カ イ ン ネ ッ 卜 ワ ー ク の 上 流 の 調 節 因 子 と し て 働 い て い る 可 能 性 が あ る ．     分 裂 促 進 因 子 活 性 化 タ ン パ ク 質 キ ナ ー ゼ （MAPK） シ グ ナ ル カ ス ケ ー ド は ， 主 に ERK経 路 ，p38経 路 ，JNK経 路 の3種 類 の カ ス ケ ー ド が 存 在 す る ， 特 に ，MEKl‐ERKl/2経 路 の 活 性 化 に よ っ て 心 肥 大 が 引 き 起 こ さ れ ， こ の 経 路 の 抑 制 に よ っ て 問 質 の 線 維 化 と 心機 能 障 害 が 抑 制 さ れ る ． 本 研 究 で は ，KOの 心 筋 で は ，WTと 比 較 し てERKl/2の り ン 酸 化 が 有 意 に 増 加 し ，KO十1ACに お い て さ ら に 増 加 し た ． こ れ ら は ，ERK経 路 がKOに お け るTAC 後 の 心 筋 細 胞 肥 大 と 問 質 の 線 維 化 の 増 悪 の 調 節 因 子 の ー つ で あ る 可 能 性 を 示 唆 し て い る．

【 結 論 】iNKT細 胞 はTAC手 術 の 圧 負 荷 心 不 全 進 展 に 対 し て 保 護 的 な 役 割 を 果 し ， 心 不 全 に お け る 炎 症 の 機 序 に お い てiNKT細 胞 が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と を 明 ら か に し た ． 従 っ て ， 圧 負 荷 心 不 全 に お い てiNKT細 胞 を 活 性 化 さ せ る 治 療 法 が 期 待 さ れ る ． 今 後 の 研 究 課 題 と し て 心 不 全 に お け るiNKT細 胞 の よ り 詳 細 な 病 態 生 理 学 的 機 序 や 生 物 学 的 特 徴 を 解 明 し て い く 必要 が あ る ，

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

Studies on the Role of Natural KillerTCells on Cardiac Hypertrophy     and Failure in Mice due to Chronic Pressure Overload in Mice      （ 慢 性 圧 負 荷 に よ る マ ウ ス の 心 肥 大 お よ び 心 不 全 に お け る      イ ン バ リ アン ト ナ チ ュラ ルキ ラー T 細胞の 役割 に関す る研 究）

     圧負荷心不全 において、慢性炎症は左室リモデリングに関与する重要な分子生物学的 因子のーっである 。インバリアントナチュラルキラーT (iNKT) 細胞は活性 化によって大 量のサイトカイン やケモカインを産生し、組織炎症を統制していると考えられている。こ れまでに、圧負荷 による心不全の進展におけるiNKT 細胞の役割を検討した 報告はない。

申請者は、圧負荷 モデルマウスを用いて、iNKT 細胞の遺伝子欠損あるいは薬物的な活性化 によって左室リモ デリングや心不全進展へ及ぼす影響を検討した。実験動物は雄性12 〜15 週 齢 の C57fB6 マ ウ ス (WT) 及 ぴ iNKT 細 胞 受 容 体 を ノ ッ ク ア ウ ト し た Ja18 ノッ クア ウ ト マウ ス(KO) を 用い 、マ ウス に大 動 脈縮 窄術 (TAC) を 行っ た。 フ ロー サイトメトリー 法およびりアルタ イムPCR 法によって、′I ヽAC 後の心筋においてiNKT 細胞が浸潤、増加し たことを明らかに した。WT マウスと比較して、KO マウスにおいて′I ヽAC 後の心筋リモデ リングおよび心不 全が増悪し、組織学的な心筋細胞肥大と心筋問質線維化の増大を伴い、

MMP ・2 及びproMMP ‐2 活性が増加した。また、IL ．10 ，TNF ‐a ，IL ‐10 冏NF ．a 比が低下し た 。さ らに 、KO マウスでは ERKl/2 のりン酸化が増強しTAC により更に増大した。一方、

′ rAC 後 のマ クロ ファージやりンパ球などの炎症細胞の 浸潤にWT とKO マウスの間に差が なかった。次に、 iNKT 細胞を特異的に活性化させるa ガラクトシルセラミドを投与したと ころ、TAC 後の心リモデリングと心不全を改善 させた。以上より、圧負荷心不全において iNKT 細胞は保護的 な役割を果たしていることが明らかとなった。今回の研 究はiNKT 細胞 が圧負荷心不全に おける新たな治療標的になる事を示唆する重要な研究と 考えられた。

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哲 之

治 晋

裕 正

藤 井

村 田

丸 筒

西 石

授 授

授 授

教 教

教 教

査 査

査 査

主 副

副 副

  以 上 の 研 究 内 容 に つ い て 、 主 査 お よ び 副 査 の 教 授 と 以 下 の 質 疑 応 答 及 び 評 価 が あ っ た 。 1）iNKT細 胞 が 圧 負 荷 モ デ ル で ど の よ う な サ イ ト カ イ ン を 放 出 し 、 そ の 下 流 で ど の よ う な 免 疫 細 胞 の 動 態 を 示 す の か に つ い て の 質 問 に 対 し て 、 申 請 者 は 、iNKT細 胞 の 産 生 す る 代 表 的 な サ イ ト カ イ ン で あ るIL‑4やIFN‑Yに つ い て はTACと の 関 連 性 の 報 告 は 少 な く 、TNF‑a やIL‑10の 相 互 作 用 が 重 要 で あ る と 考 え て い る こ と 、TACに お い て は 通 常 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 リ ン パ 球 の 浸 潤 が 報 告 さ れ て い る が 、iNKT細 胞 を 欠 損 さ せ る 事 に よ る 差 異 が な か っ た こ と か ら サ イ ト カ イ ン 産 生 と 直 接 的 炎 症 細 胞 浸 潤 と は 別 の 機 序 で あ る と 考 え て い る と 回 答 し た 。 2） 線 維 化 や ア ポ ト ー シ ス に お け る 分 子 機 序 及 ぴ 調 節 因 子 に つ い て さ ら に 詳 細 な メ カ ニ ズ ム に つ い て 検 討 を 要 し 、 特 にPro‑ MMP2の 遺 伝 子 発 現 レ ベ ル で の 解 析 や 分 解 酵 素 、 さ ら に TGF‑pな ど に つ い て 追 加 検 討 の 必 要 性 が 指 摘 さ れ た 。3） 心 筋 に お け るiNKT細 胞 数 が 極 め て 少 量 で あ っ て も 強 カ な 働 き を 担 う メ カ ニ ズ ム に お け る 見 解 に つ い て の 質 問 に 対 し て は 、 iNKT細 胞 の 莫 大 な サ イ ト カ イ ン 産 生 能 に 依 存 す る と 考 え て い る と 回 答 し た 。4）TNF‑a、 IL‑10な ど の サ イ ト カ イ ン に つ い て 遺 伝 子 発 現 だ け で な く 、 タ ン パ ク レ ベ ル や サ イ ト カ イ ン 量 の 測 定 な ど 更 な る 詳 細 な 追 加 検 討 の 必 要 性 が 指 摘 さ れ た 。5）aガ ラ ト シ ル セ ラ ミ ド(aGC) に よ るiNKT細 胞 を 活 性 化 さ せ て も ′I、ACに よ る 死 亡 率 に 改 善 が 見 ら れ な か っ た 理 由 に つ い て の 質 問 に 対 し て 、 申 請 者 は 、iNKT細 胞 がnGCに よ り 活 性 化 さ れ た 場 合 に 生 じ るanergy が 関 わ っ て い る と い う 見 解 の 旨 を 回 答 し た 。6）TACモ デ ル に お い て 急 激 に 圧 負 荷 が 生 じ る 急 性 侵 襲 期 と 持 続 し た 圧 負 荷 が か か る 慢 性 期 に お け るiNKT細 胞 の 動 態 に 差 異 が あ る か と い う 質 問 に 対 し て 、 申 請 者 は 、 ′IヽACに お け る サ イ ト カ イ ン や 細 胞 内 シ グ ナ ル の 挙 動 は 時 間 経 過 で 大 き く 異 な る た め 、 急 性 侵 襲 期 と 慢 性 期 に お い てiNKT細 胞 が 時 間 経 過 で 異 な っ た 役 割 を 果 た す 可 能 性 が 期 待 さ れ る 点 を 回 答 し た 。6） 今 後iNKT細 胞 の 圧 負 荷 心 不 全 に お け る メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る 上 で の 研 究 展 開 に つ い て ど の よ う な プ ラ ン が あ る か と い う 質 問 に 対 し て 、 申 請 者 は 、 単 一 な サ イ ト カ イ ン で 心 不 全 の 制 御 が 困 難 で あ る 事 は 過 去 に 証 明 さ れ て お り 、iNKT細 胞 の 複 雑 な サ イ ト カ イ ン 制 御 に 注 目 し 、 本 研 究 で 違 い が あ っ たTNF‐a と IL‐ lOの 心 筋 に お け る ク ロ ス ト ー ク の 研 究 を 計 画 し て い る と 回 答 し た 。   こ の 論 文 は 、 圧 負 荷 モ デ ル に お け るiNKT細 胞 の 役 割 を 初 め て 解 明 し た 点 で 高 く 評 価 さ れ 、 今 後 のiNKT細 胞 の 生 物 学 的 研 究 の 進 歩 に よ り 新 た な 心 不 全 病 態 解 明 の 鍵 と し て 期 待 さ れ る 。

  審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 、 申 請 者 が 医 学 博 士 の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

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