（プロ）レニン受容体細胞外領域の細胞内貯留と多量体形成

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(1)Title. （プロ）レニン受容体細胞外領域の細胞内貯留と多量体形成( 本文(Fulltext) ). Author(s). 中川, 千春. Report No.(Doctoral Degree). 博士(農学) 甲第617号. Issue Date. 2014-03-13. Type. 博士論文. Version. ETD. URL. http://hdl.handle.net/20.500.12099/49097. ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。.

(2) (プロ)レ二ン受容体細胞外領域の細胞内貯留と多量体形成. 2013 年. 岐阜大学大学院連合農学研究科生物生産科学 (岐阜大学). 中. 川千. 春.

(3) 目次目次 ................................................................................................................................................ i 略語一覧 ....................................................................................................................................... v. 第1章. 序論 ............................................................................................................................... 1. 第1節. (プロ)レニン受容体の同定とレニン‐アンジオテンシン系............................. 1. 第2節. (プロ)レニン受容体／ATP6AP2 ............................................................................ 3. 1. (プロ)レニン受容体の一次構造................................................................................... 3 2. (プロ)レニン受容体の機能........................................................................................... 5 3. (プロ)レニン受容体の分子型....................................................................................... 8 4. (プロ)レニン受容体の細胞内局在 ............................................................................... 8 第3節第2章. 本研究の目的 ........................................................................................................... 9 (プロ)レニン受容体細胞外領域の細胞内貯留 ...................................................... 10. 第1節. 序論 ......................................................................................................................... 10. 第2節. 実験材料と方法 ..................................................................................................... 11. 1. 抗体 .............................................................................................................................. 11 2. 哺乳類細胞発現用ベクターの作製 .......................................................................... 11 3. 細胞培養 ...................................................................................................................... 13 4. 遺伝子導入による組換えタンパク質の一過性発現 .............................................. 14. i.

(4) (1) リン酸カルシウム法 .................................................................................................. 14 (2) ポリエチレンイミン法 .............................................................................................. 14. 5. グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を安定発現する HepG2 細胞の作製 ..................................................................................................................... 15 6. 培養細胞および培養液からの標品の調製 .............................................................. 15 (1) ラット(プロ)レニン受容体全長および細胞外領域を一過性に発現させた COS-7 細胞 ............................................................................................................................ 15 (2) グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現させた COS-7 細胞 ................................................................................................................ 16 (3) グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現させた HepG2 細胞 ................................................................................................................ 16 (4) グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を安定発現させた HepG2 細胞 ............................................................................................................................ 16. 7. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動およびイムノブロットによるタンパク質の検出 ......................................................................................... 17 8. 界面活性剤を用いた二相分配法 .............................................................................. 17 9. 間接蛍光抗体法 .......................................................................................................... 18 第3節. 結果 ......................................................................................................................... 19. 1. COS-7 細胞に導入したラット(プロ)レニン受容体細胞外領域の解析 ................. 19 2. グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合ヒト(プロ)レニン受容体細胞外領域の解析 ......................................................................................................................... 21. ii.

(5) (1) COS-7 細胞に導入したグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の細胞内および培養上清中での発現とその細胞内分布 ......................................... 21 (2) HepG2 細胞に導入したグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の細胞内および培養上清中での発現 ........................................................................ 24 (3) 界面活性剤を用いたグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の二相分配 .................................................................................................................... 26. 第4節第3章. 考察 ......................................................................................................................... 28 (プロ)レ二ン受容体の多量体化における細胞外領域の関与 .............................. 31. 第1節. 序論 ......................................................................................................................... 31. 第2節. 実験材料と方法 ..................................................................................................... 32. 1. 抗体 .............................................................................................................................. 32 2. 哺乳類細胞発現用ベクターの作製 .......................................................................... 32 3. 細胞培養 ...................................................................................................................... 34 4. 遺伝子導入による組換えタンパク質の一過性発現 .............................................. 34 5. ヒト(プロ)レニン受容体を安定発現させたチャイニーズハムスター卵巣細胞株の作製 ......................................................................................................................... 35 6. 培養細胞および培養液からの標品の調製 .............................................................. 35 (1) グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を発現させた COS-7 細胞 ............................................................................................................................................ 35 (2) ヒト(プロ)レニン受容体安定発現チャイニーズハムスター卵巣細胞 .............. 36. 7. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動およびイムノブロットによるタンパク質の検出 ......................................................................................... 36. iii.

(6) 8. グルタチオン S-トランスフェラーゼプルダウンアッセイ ................................. 37 9. ヒスチジンタグタンパク質プルダウンアッセイ .................................................. 37 10. 間接蛍光抗体法 ........................................................................................................ 38 第3節. 結果 ......................................................................................................................... 39. 1. 培養細胞に発現させたグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合ヒト(プロ)レニン受容体欠損変異体の解析 ................................................................................. 39 (1) 導入タンパク質の細胞内および培養上清中での発現とその細胞内分布 ........ 39 (2) 全長型(プロ)レニン受容体との複合体の形成........................................................ 43. 2. チャイニーズハムスター卵巣細胞に安定発現させたヒト(プロ)レニン受容体の解析 ............................................................................................................................. 44 (1) 抗ヒト(プロ)レニン受容体抗体の認識領域の同定................................................ 44 (2) 導入ヒト(プロ)レニン受容体の細胞内および培養上清中における発現 ............ 45 (3) 導入ヒト(プロ)レニン受容体の細胞内分布 ........................................................... 48 (4) 全長型(プロ)レニン受容体と可溶型(プロ)レニン受容体との複合体の形成 ... 48. 第4節第4章. 考察 ......................................................................................................................... 48 総括 ............................................................................................................................. 53. 謝辞 ............................................................................................................................................. 56 参考文献 ..................................................................................................................................... 57. iv.

(7) 略語一覧 Ang II. angiotensin II. BSA. bovine serum albumin. CHO. Chinese hamster ovary. DHFR. dihydrofolate reductase. DMEM. Dulbecco’s modified Eagle medium. DMSO. dimethyl sulfoxide. ECD. extracellular domain. ER. endoplasmic reticulum. ERK 1/2. extracellular signal-regulated kinase 1/2. FBS. fetal bovine serum. GST. glutathione S-transferase. h(P)RR. human (pro)renin receptor. LRP 6. low-density lipoprotein receptor-related protein 6. MAP kinase. mitogen-activated protein kinase. NCBI. National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine. PBS. phosphate buffered saline. PCR. polymerase chain reaction. PEI. polyethyleneimine. (P)RR. (pro)renin receptor. RAS. renin-angiotensin system. SDS-PAGE. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. s(P)RR. soluble (pro)renin receptor. TBS. Tris buffered saline. V-ATPase. vacuolar H+-ATPase. v.

(8) 第1章. 序論. 第1節. (プロ)レニン受容体の同定とレニン‐アンジオテンシン系. (プロ)レニン受容体 [(pro)renin receptor、(P)RR]は、酵素レニン (EC 3.4.23.15)とその不活性な前駆体プロレニンの両者をリガンドとする受容体として、2002 年に報告された 37) 。この受容体は、レニンまたはプロレニンと結合することにより細胞内に情報を伝達する受容体としての機能と、プロレニンの酵素活性を発現させる機能の 2 つをあわせ持つ 37) 。また (P)RR は、その一次構造において既知の膜タンパク質との相同性がなく、現在のところ特定の受容体ファミリーには分類されていない. 37). 。近年の研究の進展により、(P)RR は多様な. 機能を持つことが明らかになりつつある。(P)RR の関連する疾病の診断や治療を目指した利用が検討されている 54) 。 (P)RR は、現在のところレニン‐アンジオテンシン系 (renin-angiotensin system、RAS)の新たな一員であると認識されている (Fig. 1-1)。RAS は、生体内の血圧や水‐電解質バランスの調節を担う重要な機構である 21,51) 。RAS の律速酵素であるレニンは、腎臓から放出され、循環血液中において肝臓で生産された基質アンジオテンシノーゲンの N 末端 10 残基を特異的に切断し、生理的に不活性なペプチドであるアンジオテンシン I を産生する. 21,51). 。アン. ジオテンシン I は、アンジオテンシン変換酵素によってさらに切断され、8 アミノ酸残基からなるアンジオテンシン II (angiotensin II、Ang II)となる 21,51) 。Ang II の作用は、標的細胞の表面に存在する受容体を介した細胞内シグナル伝達によって引き起こされる. 21). 。Ang II. 受容体にはサブタイプが存在し、Ang II はタイプ 1 受容体を介して血管平滑筋の収縮を引き起こすとともに、副腎皮質からのアルドステロン分泌を促す 21) 。アルドステロンは腎臓に作用してナトリウムの再吸収および水分保持に働く 21) 。これらの作用の結果、血圧が上昇する。また Ang II は、細胞の増殖、肥大などの作用を持ち 21) 、心・血管系疾患、糖尿病、腎臓疾患などの病態に関与すると考えられている。アスパルティックプロテアーゼであるレニンは、腎臓傍糸球体細胞で不活性な前駆体プ. 1.

(9) ロレニンとして生合成され、細胞内の分泌顆粒 (レニン顆粒)に蓄えられる 49) 。顆粒内でプロレニンは、活性中心を覆っている 43 アミノ酸残基のプロセグメント部分がプロセシング酵素により切断され、酵素活性を有するレニンへ変換される 49) 。レニンは、生体の厳密な調節機構、すなわち交感神経性の刺激などに応答して傍糸球体細胞から分泌される 21, 49) 。一方、酵素活性のないプロレニンも血漿中に検出されており 31) 、細胞外へと分泌されていると考えられる 49) 。興味深いことに血漿中のプロレニン濃度は、健常者においてレニンの約 5 倍あり、糖尿病患者では、健常者よりもレニンに対するプロレニンの比率がさらに上昇する 31) 。これらの知見から、プロレニンにはレニンの前駆体としてだけではない何らかの役割があるのではないかと考えられてきた。しかし、その病理学的、生理学的な意義は長年未解明のままであった。そうした中、2002 年に Nguyen らによってヒト腎臓のメサンギウム細胞から、レニンとプロレニンの両方をリガンドとする(P)RR の cDNA がクローニングされ 11,43). 37). 、 (P)RR を介したプロレニンやレニンの新しい機能に注目が集まるようになった. 。. Fig. 1-1.. Canonical renin-angiotensin system and the (pro) renin receptor.. ACE, angiotensin-converting enzyme.. 2.

(10) 第2節. (プロ)レニン受容体／ATP6AP2. 1. (プロ)レニン受容体の一次構造 (P)RR は、ヒトで 350 アミノ酸からなり、N 末端側からシグナルペプチド、細胞外領域、膜貫通領域、および短い細胞内領域で構成されている一回膜貫通タンパク質である 37) (Fig. 1-2)。膜貫通領域を含む(P)RR の C 末端部分は、リソソームなどのオルガネラの酸性化に働く液胞型プロトン ATPase (vacuolar H+-ATPase、V-ATPase)のアクセサリータンパク質として 1998 年に報告されていた M8-9 フラグメントと一致している. 30). 。(P)RR の遺伝子名は. ATP6AP2 である。(P)RR は M8-9 フラグメント以外の既知の膜タンパク質とは相同性が認められていない. 37). 。哺乳類であるヒト、マウス、ラット、およびウシの(P)RR は、Cys 残基. や、N 型糖鎖修飾のコンセンサス配列を持たない (Fig. 1-2)。ATP6AP2 は、ヒトでは X 染色体の Xp11.4 上に存在し、9 個のエクソンで構成される 12) 。(P)RR は、哺乳類をはじめとした脊椎動物だけでなく、RAS を持たないショウジョウバエ (Drosophila melanogaster)6) やセンチュウ (Caenorhabditis elegans)といった無脊椎動物においても確認されている (Fig. 1-3)。膜貫通領域と細胞内領域を含む C 末端部位のアミノ酸配列は、細胞外領域よりも脊椎動物と無脊椎動物間での相同性が高く、進化的に広く保存されている 6,13) (Fig. 1-3)。一方、レニンやプロレニンと結合する部位である N 末端側の細胞外領域は、脊椎動物間のアミノ酸配列の相同性は高いが、脊椎動物と無脊椎動物間では相同性が低い 6,13) (Fig. 1-3)。. 3.

(11) Signal peptide 1 MAVFVVLLAMAVLVVFLSF MAVLVVLLSS MAVLVVLLFF. LVAGVLGNEF LVADVFGNEF LVSSALANEF LVAGALGNEF. SILKSPGSVV SILRSPGSVV SILRSPGSVV SILRSPGSVV. FRNGNWPIPG FRNGNWPIPG FRNGNWPIPG FRNGNWPIPG. ERIPDVAALS ERIPDVAALS DRIPDVAALS DRIPDVAALS. MGFSVKEDLS MGFSVKEDLS MGFSVKEDLS MGFSVKEDLS. WPGLAVGNLF WPGLAVGNLF WPGLAVGNLF WPGLAVGNLF. 80 HRPRATVMVM HRPRATVMVM HRPRATIMVT HRPRATIMVM. Human Bovine Rat Mouse. 81 VKGVNKLALP VKGVDKLALP VKGVDKLALP VKGVDKLALP. PGSVISYPLE PGSVISYPLE TGSVISYPLE AGSVISYPLE. NAVPFSLDSV NAVPFSLDSV NAVPFSLDSV NAVPFSLDSV. ANSIHSLFSE ANSIHSLFSE ANSIHSLFSE ANSIHSLFSE. ETPVVLQLAP ETPVVLQLAP ETPVVLQLAP ETPVVLQLAP. SEERVYMVGK SEERVYMVGK SEERVYMVGK SEERVYMVGK. ANSVFEDLSV ANSVFEDLSV ANSVFEDLSV ANSVFEDLSV. 160 TLRQLRNRLF TLRQLRNRLF TLRQLRNRLF TLRQLRKRLF. Human Bovine Rat Mouse. 161 QENSVLSSLP QENSVLTSLP QENSVLNSLP QENSLLNSHP. LNSLSRNNEV LNSLSRNNEV LNSLSRNNEV LNSLSRNNEV. DLLFLSELQV DLLFLSELQV DLLFLSELQV DLLFLSELQV. LHDISSLLSR LRDISSLLSR LHDISSLLSR LHDISSLLSR. HKHLAKDHSP HKHLAKDHSP HKHLAKDHSP HKHLAKDHSP. DLYSLELAGL DLYSLELAGL DLYSLELAGL DLYSLELAGL. DEIGKRYGED DEIGKHYGED DELGKRYGED DELGKRYGED. 240 SEQFRDASKI SEQFRDASKI SEQFRDASRI SEQFRDASKI. Human Bovine Rat Mouse. 241 LVDALQKFAD LIDALQKFAD LVDALQKFAD LVDALQKFAD. DMYSLYGGNA DMYNLYGGNA DMYSLYGGNA DMYSLYGGNA. VVELVTVKSF VVELVTVRSF VVELVTVKSF VVELVTVKSF. DTSLIRKTRT DTSLVRKTRN DTSLVRKSRT DTSLVRKSRT. ILEAKQAKNP ILETKQVKDP ILETKQ-ENT ILEAKQ-ENT. ASPYNLAYKY STTYNLAYKY QSPYNLAYKY QSPYNLAYKY. NFEYSVVFNM NFEYPVVFNL NLEYSVVFNL NLEYSVVFNL. 320 VLWIMIALAL VLWIMIGLAL VLWIMTGLAL VLWIMIGLAL. Human Bovine Rat Mouse. 321 AVIITSYNIW TLIVTCYNIW AVIITSYNIW AVIITSYNIW. NMDPGYDSII NMDPGYDSII NMDPGYDSII NMDPGYDSII. 351 YRMTNQKIRM D YRMTNQKIRM D YRMTNQKIRM D YRMTNQKIRI D. Human Bovine Rat Mouse. Fig. 1-2.. Furin cleavage site. M8-9 fragment. Transmembrane domain. Primary structures of the (pro)renin receptor orthologs in mammals.. Sequence comparison of human [Homo sapiens, NCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine) accession no. NP_005756], bovine (Bos Taurus, NCBI accession no. NP_001091491), rat (Rattus norvegicus, NCBI accession no. NP_001007092), and mouse (Mus musculus, NCBI accession no. NP_081715) (P)RR. Sequence alignments were produced with the MultAlin. 8) Red, invariant and conserved amino acid; blue, semiconserved amino acid; yellow background, signal peptide and transmembrane domain; green background, bovine M8-9 fragment. 30) Residue numbers are for the bovine sequence.. 4.

(12) Fig. 1-3.. Primary structures of the (pro)renin receptor orthologs in vertebrates and invertebrates.. Sequence comparison of human (Homo sapiens, NCBI accession no. NP_005756), rat (Rattus norvegicus, NCBI accession no. NP_001007092), mouse (Mus musculus, NCBI accession no. NP_081715), clawed frog (Xenopus laevis, NCBI accession no. NP_001080880), zebrafish (Danio rerio, NCBI accession no. AAH59542), fruit fly (Drosophila melanogaster, NCBI accession no. NP_649876) and nematode (Caenorhabditis elegans, NCBI accession no. NP_510360) (P)RR. Sequence alignments were produced with the MultAlin. 8) Red, invariant and conserved amino acid; blue, semiconserved amino acid; yellow background, signal peptide and transmembrane domain.. 2. (プロ)レニン受容体の機能 (P)RR はレニンならびにプロレニンに対する結合能を持ち、Biacore システムを用いた表面プラズモン共鳴解析によって求められたヒト(P)RR に対するヒトレニン、ヒトプロレニン結合の解離定数 KD 値は、それぞれ 4.4±1.8 nmol/L、1.2±0.4 nmol/L である 33) 。レニンならびにプロレニンとの結合によって、(P)RR の 2 つの働きが発揮される (Fig. 1-4)。一つは、プロセグメント部分を切断することなく、アンジオテンシノーゲン切断能を持つ活性型酵. 5.

(13) 素へとプロレニンを構造変化させる働きである 33,37) 。(P)RR がレニンと結合した場合には、その酵素活性を上昇させる 37) 。結果として、アンジオテンシン I 産生が促され 33,37) 、アンジオテンシン I 下流の生理活性物質 Ang II の産生が亢進すると考えられる。もう一つは、 Ang II 非依存的に細胞内シグナル伝達を引き起こす働きである 37) 。レニンまたはプロレニンによる刺激によって、細胞内でマイトジェン活性化プロテインキナーゼ (mitogen-activated protein kinase 、 MAP キナーゼ )である細胞外シグナル制御キナーゼ (extracellular signal-regulated kinase、ERK) 1 (p44) / 2 (p42)のリン酸化が起こり 37,45) 、線維化誘導因子であるトランスフォーミング増殖因子 β1 (transforming growth factor-β1、TGF-β1)、プラスミノーゲン活性化抑制因子 1 (plasminogen activator inhibitor-1、PAI-1)、コラーゲン、フィブロネクチンなどの遺伝子発現が増加する 22,46). 17). 。MAP キナーゼである p38 のリン酸化. や、シクロオキシゲナーゼ 2 (cyclooxygenase 2、COX-2)の活性化が亢進する 22) 。また、. 転写因子である promyelocytic leukemia zinc finger transcription factor (PLZF)が活性化されて、 (P)RR 遺伝子の転写抑制や、ホスファチジルイノシトール 3 キナーゼ (phosphatidylinositol-3 kinase) p85α 遺伝子の転写促進が起こる 48) 。一方、G タンパク質共役型受容体のセカンドメッセンジャーとして知られている細胞内のカルシウムイオン濃度やサイクリック AMP 濃度は、レニン刺激によって変動しない 37) 。. Fig. 1-4.. Role of the (pro)renin receptor.. MAPK, mitogen-activated protein kinase; PLZF, promyelocytic leukemia zinc finger transcription factor; V-ATPase; vacuolar H+-ATPase, LRP 6, low-density lipoprotein receptor-related protein 6. 6.

(14) (P)RR の mRNA は、哺乳類において幅広い組織に存在し、脳、心臓、胎盤、肝臓、膵臓で強く発現している 37) 。全身での遺伝子ノックアウト動物の作製に成功しないことから 6) 、 (P)RR の生理機能に関する研究は、(P)RR へのレニンやプロレニンの結合を阻害するペプチド (ハンドル領域ペプチド、デコイペプチド)53) や、(P)RR のトランスジェニック動物、コンディショナルノックアウトマウスを用いて行われてきた。これまでに、心血管系疾患や糖尿病に起因する腎疾患、網膜症などの臓器障害の進展との関連が報告されている 18,19,20,22,36). 。近年、血圧調節に関わる循環 RAS とは別に、組織において局所的に RAS の構. 成要素が発現し機能している組織 RAS の存在が明らかになっている。RAS における(P)RR の働きは、この組織 RAS との関わりが強いのではないかと考えられている 19) 。一方で、(P)RR 研究の初期から報告されている「細胞表面におけるレニンならびにプロレニンの受容体」とは別の機能が(P)RR には存在するのではないかと予想されている。その理由として以下の 3 点が挙げられる。(1)前述したように、(P)RR は RAS を持たない無脊椎動物にも存在する。(2)レニン、アンジオテンシノーゲン、Ang II タイプ 1 受容体といった RAS 構成因子のノックアウトマウスが誕生するのにもかかわらず、(P)RR のノックアウトマウスは誕生していない 6) 。そして、(3)(P)RR はオルガネラの酸性化に働く V-ATPase 複合体のアクセサリータンパク質として報告されている. 30). 。近年、心筋や腎臓の足細胞 (podocyte)に. おけるコンディショナルノックアウトマウスを用いた研究から、V-ATPase 複合体の集合や 24). 、V-ATPase と連携して細胞内構成物の分解とその再利用に働く細胞内のシステムである. オートファジー (autophagy、自食作用)との関わりといった、細胞内部での機能を示唆する報告が相次いでなされている 24,39,44)。また、胚発生に重要で、癌などの病態にも関係すると言われている Wnt/β-カテニン経路 10)や、平面内細胞極性 (planar cell polarity)に働く Wnt/PCP 経路 5,15)といった、Wnt シグナリングとの関わりが報告されている。このようなレニンやプロレニンとは独立した機能が、次第に明らかになりつつある (Fig. 1-4)。なお、(P)RR 遺伝子が関係するヒトの疾患に関しては、X 染色体連鎖性の精神遅滞およびてんかんの患者で、(P)RR 遺伝子のエクソン 4 がコードする 32 アミノ酸の欠損を引き起こす遺伝子変異 (c.321C>T)が報告されている 42) 。(P)RR の mRNA は脳で高発現しており 37)、. 7.

(15) 脳・神経系において(P)RR が何らかの働きをしていると考えられる。また、(P)RR の遺伝子多型 (polymorphism)が、血圧に影響することが日本におけるコホート研究の結果、明らかになっている 16) 。. 3. (プロ)レニン受容体の分子型 (P)RR には複数の分子型が存在する。膜貫通領域を含む C 末端部分の M8-9 フラグメントは、Nguyen らによる(P)RR 全長の同定以前からその存在が報告されていた 30)。そして、膜貫通領域近傍の N 末端側がプロテアーゼであるフューリン (furin)9) 、または ADAM19. 55). により切断され、細胞外領域断片が分泌されると報告された (Fig. 1-2)。可溶型(P)RR [soluble (P)RR、s(P)RR]と呼ばれるこの分子型は、血中 9,54)や尿中 14,20)に存在している。また、ラットの尿中の s(P)RR14)、ならびにヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)から分泌された s(P)RR2)が、 in vitro の実験系でプロレニンを活性化したことから、s(P)RR は何らかの生理機能を持つ可能性が予想されている。なお、s(P)RR は、糖尿病の合併症や高血圧など(P)RR に関連する疾患のバイオマーカーとなる可能性が報告されている 54)。. 4. (プロ)レニン受容体の細胞内局在 (P)RR の細胞内局在に関しては、心筋. 46). 、血管平滑筋. 45,55). 、糸球体上皮細胞 (glomerular. epithelial cell) 9)、ニューロン 7)、腎臓集合管の A 型間在細胞 (intercalated cells). 1). の内在性. (P)RR を、免疫染色して顕微鏡で観察した報告がある。また、蛍光タンパク質やエピトープタグを付加した(P)RR を遺伝子導入により培養動物細胞に発現させ、免疫染色を行い、顕微鏡で観察した報告がある 7,37,48,50) 。細胞表面の存在を示す報告 1,7,37,46)の一方で、内在性、外来性ともに、主要な局在が細胞内 (核周辺、小胞体、ゴルジ体、小胞)とする報告も多数存在する 9,45,46,48,50,55)。(P)RR は、リガンドで刺激してもエンドサイトーシス (インターナリゼーション)されないと報告されている 37) 。このことから、細胞内に存在する(P)RR は、細胞表面に移行する過程の前段階にあると考えられる。 (P)RR の局在に関しては、研究者間で細胞種や抗体などの実験材料や実験条件の違いがあ. 8.

(16) り、現在のところ定説は得られていない。(P)RR 研究の当初は、細胞外のプロレニンやレニンとの結合の点から細胞表面での機能が注目されてきた。しかし、近年レニンならびにプロレニンとは独立した細胞内での機能が報告されており、(P)RR が主として存在する部位が細胞内であることの妥当性が示されている。. 第3節. 本研究の目的. これまでの(P)RR に関する研究では、まず、RAS の一員としての生化学的な研究と病態生理学的な研究が進められた。現在、血中や尿中にある s(P)RR は、高血圧などの(P)RR が関与する疾病のバイオマーカーとしての利用が考えられている。そして、RAS とは独立した機能についても徐々に明らかにされつつある。しかしながら、研究の歴史が浅い分子である(P)RR は、生体における役割やその存在意義に関して、未だに不明な点が多い。今後、新たな機能が明らかとなる可能性も秘めている。分子レベルで見た(P)RR は、既知のタンパク質との相同性や特徴的なアミノ酸配列が認められず、一次構造からの機能予測が困難なタンパク質である。細胞における(P)RR 分子の生合成、挙動、機能、細胞内シグナル伝達の詳細、そしてタンパク質分子としての諸性質や立体構造など、解明が進んでいない点が数多く存在する。生体での(P)RR の機能を解明し、その知識を応用していくには、個体レベルで現象を追うと共に、現象が生ずる過程や仕組みを理解するための細胞レベルや分子レベルでの研究が必要となる。本研究では、分子細胞生物学の視点から(P)RR の生体での役割の理解につながる知見を得るために、(P)RR タンパク質を動物細胞に発現させ、細胞内での(P)RR 分子の挙動やタンパク質としての特性を調べることを目的とした。特に、レニンならびにプロレニンの結合領域であり、s(P)RR を含有する部位である細胞外／内腔領域に着目して研究を進めた。. 9.

(17) 第2章. (プロ)レニン受容体細胞外領域の細胞内貯留. 第1節. 序論. (P)RR のタンパク質としての諸性質や機能を調べるために、これまで、組換え型(P)RR タンパク質の生産が試みられてきた。本論文の著者が属する研究グループでは、コムギ胚芽を用いた無細胞合成系. 33). 、大腸菌を用いた発現系. 13). によって、ヒト(P)RR 細胞外領域の生. 産および精製を行った。これらのタンパク質生産系は、簡便さ、汎用性、そして大腸菌発現系の場合は経済性の点において優れているが、(P)RR の細胞外領域は凝集傾向にあり、可溶性のタンパク質を得るのが容易ではなかった。そこで代替法として、哺乳類由来の細胞を宿主とした(P)RR タンパク質の大量生産系を利用することにした。哺乳類由来の細胞では、無細胞合成系や大腸菌での発現系では行うことのできない翻訳後修飾が可能となる点からも、意義があると考えた。典型的な哺乳類細胞が作る全タンパク質の半数は細胞膜の特定部位、細胞質以外の区画、あるいは分泌のために細胞表面へと運ばれる 29) 。小胞体に局在する可溶性タンパク質や膜タンパク質だけでなく、細胞から分泌されるタンパク質、ゴルジ体あるいはリソソームの内腔に局在する酵素や酵素以外のタンパク質、それらのオルガネラの膜や細胞膜に局在するタンパク質も、最初に小胞体膜へ送り込まれ、分泌経路をたどって輸送される 29) 。詳しく説明すると、(1)核 DNA から作られた mRNA は細胞質リボソームによって翻訳される 29) 。 (2)分泌経路に入るタンパク質を翻訳するリボソームは、小胞体へのシグナルペプチドによって粗面小胞体へ導かれる 29) 。(3)小胞体上での翻訳が終わったタンパク質は輸送小胞によってゴルジ体に運ばれ、さらに細胞膜やリソソームへと選別輸送される. 29). 。(P)RR は、N. 末端に小胞体へ導くシグナルペプチドを持ち、N 末端側が内腔領域となる I 型の一回膜貫通型タンパク質である 37) 。小胞体で生合成された後、細胞表面に輸送されると考えられる。一回膜貫通型タンパク質の生産においては、その細胞外領域を遺伝子工学的手法で動物培養細胞に導入し、細胞の持つ分泌タンパク質の生合成システムによりタンパク質生産さ. 10.

(18) せ、共雑タンパク質の少ない培地中へ分泌させて回収する手法が繁用されている。Öhman らは、一回膜貫通タンパク質であるセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼの細胞外領域に外来性のシグナルペプチドとそれに連結したグルタチオン S-トランスフェラーゼ (glutathione S-transferase、GST)タグを付加したタンパク質を、遺伝子工学的手法により哺乳類培養細胞 HEK293 に発現させた 38) 。そして、培地中に分泌された可溶型のタンパク質を精製することに成功した 38) 。全長型(P)RR は一回膜貫通タンパク質であるため、Öhman らが行ったように膜貫通領域と細胞質領域とを欠損させると、細胞外／内腔領域が培地中に分泌され、回収した培養上清から目的タンパク質を精製することができると考えられた。そこで、哺乳類細胞を宿主とした(P)RR の細胞外領域の生産および精製系の確立を目的として、(P)RR 細胞外領域遺伝子を導入したところ、発現させた細胞外領域は、予想とは異なり培地中に分泌されず細胞内に貯留した。第 2 章ではこの現象に着目し、(P)RR 細胞外領域の貯留メカニズムに関する知見を得るための解析を行った。. 第2節. 実験材料と方法. 1. 抗体抗 FLAG-M2 抗体は Covance から、抗アクチン (actin)抗体は Sigma-Aldrich から、それぞれ購入した。抗カルネキシン (calnexin)抗体と日本住血吸虫 (Schistosoma japonicum)の GST に対する抗体は Santa Cruz Biotechnology から購入した。抗ウサギ IgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体および抗マウス IgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体は Bio-Rad Laboratories から購入した。Cy2 標識抗ウサギ IgG 抗体は Jackson ImmunoResearch Laboratories から購入した。. 2. 哺乳類細胞発現用ベクターの作製第 2 章で使用した哺乳類発現用ベクターはすべて、プラスミド pcDNA3 (Invitrogen)を使用した。Fig. 2-1 に記載した組換え(P)RR タンパク質をコードする cDNA を、ポリメラーゼ連. 11.

(19) 鎖反応 (polymerase chain reaction、PCR)法を用いて作製し、インサートとして pcDNA3 のマルチクローニングサイトに挿入した。プラスミド挿入後の各インサート部分の DNA 塩基配列が正確であることを、ダイターミネーター法によって確認した。以下に、作製したプラスミド名、挿入した cDNA 塩基配列の設計および、作製方法の概要を列記する。. pcDNA3-FLAG-r(P)RR FL ラット(P)RR の cDNA は、Sprague-Dawley ラットの脳から抽出した全 RNA を材料として調製した cDNA を鋳型にして、PCR 法を用いてクローニングした (DNA Data Bank of Japan, No. AB188298)。ラット(P)RR のシグナルペプチドと推定される残基番号 1 位‐17 位のアミノ酸配列の C 末端側に、FLAG タグ配列 (DYKDDDDK)と、さらにシグナルペプチド配列を除いたラット(P)RR 全長 (18 位‐350 位)を連結させたタンパク質 (FLAG-rFL)をコードする cDNA を、pcDNA3 に挿入した。. pcDNA3-FLAG-r(P)RR ECD-10His ラット(P)RR のシグナルペプチド 1 位‐17 位の C 末端側に、FLAG タグ配列、シグナルペプチド配列を除いたラット(P)RR の細胞外領域 (18 位‐304 位)、スロンビン切断サイト (IVPRGS) 、デカヒスチジンタグ (HHHHHHHHHH) を順番に連結させたタンパク質 (FLAG-rECD)をコードする cDNA を、pcDNA3 に挿入した。. pcDNA3-GST Schistosoma japonicum GST の cDNA は、大腸菌発現用プラスミド pGEX-4T-2 (Clontech)を鋳型として、PCR 法によってクローニングした。GST の N 末端側に、ヒツジアンジオテンシノーゲンのシグナルペプチド配列 (MAPAGLSLGATILCLLAWAGLAAG)35)を付加したタンパク質 (GST)をコードする cDNA を、pcDNA3 に挿入した。. 12.

(20) pcDNA3-GST-KDEL N 末端側にヒツジアンジオテンシノーゲンのシグナルペプチド配列を付加した GST の C 末端側に、小胞体残留シグナル KDEL を含むヒトのカルレティキュリン (calreticulin)の C 末端の配列 (QAKDEL)を付加したタンパク質 (GST-KDEL)をコードする cDNA を、pcDNA3 に挿入した。. pcDNA3-GST-FL ヒト(P)RR の cDNA は、ヒト腎臓 cDNA ライブラリー (Clontech)を鋳型として、PCR 法によってクローニングした。N 末端側にヒツジアンジオテンシノーゲンのシグナルペプチド配列を付加した GST の C 末端側に、ヒト(P)RR のシグナルペプチド配列を除いた全長 (17 位 ‐350 位)を連結させたタンパク質 (GST-FL)をコードする cDNA を、pcDNA3 に挿入した。. pcDNA3-GST-ECD N 末端側にヒツジアンジオテンシノーゲンのシグナルペプチド配列を付加した GST の C 末端側に、ヒト(P)RR のシグナルペプチド配列を除いた細胞外領域 (17 位‐304 位)を連結させたタンパク質 (GST-ECD)をコードする cDNA を、pcDNA3 に挿入した。. 3. 細胞培養細胞は、通常 37℃、5% CO2 条件下で培養した。アフリカミドリザル腎臓由来の培養細胞 COS-7 は、文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けた (細胞番号 RCB0539)。ヒト肝癌由来の培養細胞 HepG2 は、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクより提供を受けた (細胞番号 JCRB 1054)。通常の COS-7 細胞培養用の培地は、それぞれ終濃度で 2.5%または 10% 牛胎児血清 (fetal bovine serum、FBS) (Biosolutions International または PAA Laboratories)、2 mmol/L L-グルタミン (Nacalai tesque または Invitrogen)、100 U/mL ペニシリン (Nacalai tesque または Invitrogen)、100 μg/mL ストレプトマイシン (Nacalai tesque または Invitrogen)を添加. 13.

(21) したダルベッコ変法イーグル培地 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium、DMEM) (Nissui pharmaceutical)を使用した。通常の HepG2 細胞培養用の培地は、それぞれ終濃度で 5% FBS、 2 mmol/L L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した DMEM を使用した。. 4. 遺伝子導入による組換えタンパク質の一過性発現 (1) リン酸カルシウム法 COS-7 細胞を細胞数が 2-4×104/well となるように培養用 6-well プレートへ播種し、2.5% FBS を含む培地中で、37℃、5% CO2 条件下で 24 時間培養した。140 mmol/L 塩化ナトリウムと、 275 mmol/L リン酸水素二ナトリウムを含む 25 mmol/L BES [N, N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid] buffered saline (pH 6.95)に、5 μg のプラスミド DNA と終濃度で 125 mmol/L の塩化カルシウム水溶液を、総容量で 120 μL となるように混合して DNA‐リン酸カルシウム溶液を調製し、室温で 15 分間静置した。6-well プレートで培養した細胞に、DNA‐リン酸カルシウム溶液を滴下・混合後、35℃、3％ CO2 条件下で 24 時間培養した。培地を除去し、リン酸緩衝液 (phosphate buffered saline、PBS) (137 mmol/L 塩化ナトリウム、2.68 mmol/L 塩化カリウム, 8.10 mmol/L、リン酸一水素二ナトリウム、1.47 mmol/L リン酸二水素一カリウム、pH 7.4)で 2 回洗浄した後、無血清培地を添加し、37℃、 5% CO2 条件下で培養した。. (2) ポリエチレンイミン法ポリエチレンイミン法は、Boussif らの方法 4)に準じて行った。COS-7 細胞または HepG2 細胞を培養用 6-well プレートまたは培養用ディッシュ (直径 35 mm)へ播種し、通常の培養用の培地中で 24 時間培養した。2 μg のプラスミド DNA と、6 μg のポリエチレンイミン (polyethyleneimine、PEI) (Polysciences)を 150 mmol/L 塩化ナトリウム水溶液中に、総容量で 0.2 mL となるように混合し (DNA‐PEI 混合液)、室温で 20 分間静置した。細胞の培養液を、 1.3 mL または 1.5 mL の FBS 含有培地または無血清培地へ交換した後、DNA‐PEI 混合液を. 14.

(22) 滴下・混合し、37℃、5% CO2 条件下で 48 時間培養した。. 5. グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を安定発現する HepG2 細胞の作製 HepG2 細胞へ、発現用ベクター pcDNA3-GST-FL 、 pcDNA3-GST-ECD および pcDNA3-GST-KDEL をそれぞれ遺伝子導入した。遺伝子導入は、市販の遺伝子導入用試薬である FuGENE6 Transfection Reagent (Roche Diagnostics)を使用し、操作方法は製品の取り扱い説明書に従った。遺伝子導入後の細胞を単細胞で低密度となるように培養用ディッシュに播種し、通常の培養用培地に終濃度で 0.2‐0.5 mg/mL の G 418 二硫酸塩 (Nacalai tesque)を添加した選択培地で数週間培養した。形成されたコロニーを単離し、導入した遺伝子の発現を、染色体 DNA を鋳型とした PCR 法および、抗 GST 抗体を用いたイムノブロット法で、各クローンについて確認した (非掲載データ)。導入した GST 融合タンパク質を高発現しているクローンを安定発現株として以降の解析で用いた。安定発現株は、終濃度で 0.2‐0.8 mg/mL となるように G-418 を添加した培養用培地 (5% FBS)で培養した。. 6. 培養細胞および培養液からの標品の調製 (1) ラット(プロ)レニン受容体全長および細胞外領域を一過性に発現させた COS-7 細胞発現用ベクターpcDNA3-FLAG-r(P)RR-FL または、pcDNA3-FLAG-r(P)RR ECD-10His をリン酸カルシウム法で導入した COS-7 細胞は、無血清培地へ交換後 2 日間培養した。培養終了後、培養上清を回収し、細胞を PBS で洗浄した。0.1%のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (Tween 20) (Nacalai tesque)を含む PBS を加え、スクレイパーを用いて細胞を 1.5 mL チューブに回収し、ウルトラソニッククリーナー (Velvo clear)で超音波破砕した。この溶液を 14,000×g、4℃、10 分間遠心分離し、上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液のタンパク質濃度は、Bradford 法で測定した。標準タンパク質として牛血清アルブミン (Bovine serum albumin, BSA) フラクション V (Roche Diagnostics)を用いた。回収した培養上清は、以下の通りに濃縮した。培養上清を、微量透析器 (Nippon genetics)を用いて、1 mmol/L リン酸バッファー (pH 7.4)に緩衝液交換した後、凍結乾燥機 (YAMATO)を用いて粉末化した。. 15.

(23) 得られた粉末を元の溶液の 1/30 量の超純水に溶解した。. (2) グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現させた COS-7 細胞培養用 6-well プレートへ、ウェルの底面積の 50%コンフルエントに相当する細胞を播種し、10% FBS を含む培地中で 24 時間培養した。10% FBS を含む培地へ交換し、ポリエチレンイミン法で GST 融合タンパク質をコードするプラスミドを導入した。そのまま 48 時間培養した後、培養液を回収し、死細胞を除去するために 13,200×g で遠心分離して、その上清を培養上清とした。培養プレートの細胞を、氷冷 PBS で 2 回洗浄した後、1%の Triton X-100 (Nacalai tesque)を含む氷冷 PBS を添加して氷上で 10 分以上静置した。Triton X-100 で溶解した細胞を回収し、核などの不溶性の成分を除去するために 13,200×g で遠心分離し、その上清を細胞溶解液とした。. (3) グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現させた HepG2 細胞培養用ディッシュ (直径 35 mm)へディッシュの底面積の 50%コンフルエントに相当する細胞を播種し、5% FBS を含む培地中で 24 時間培養した。5% FBS を含む培地へ交換し、ポリエチレンイミン法で GST 融合タンパク質をコードするプラスミドを導入した。導入後 48 時間培養し、本節 6. (2)に記載した COS-7 細胞の場合と同様に、培養上清と細胞溶解液を調製した。. (4) グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を安定発現させた HepG2 細胞 GST-FL、GST-ECD、GST-KDEL をそれぞれ安定発現した HepG2 細胞、またはコントロールとして用いた遺伝子導入をしていない野生型の HepG2 細胞は、培養用 6-well プレートへ播種した後、ほぼ 100% コンフルエントとなるまで培養した。終濃度で 3%のジメチルスルホキシド (dimethyl sulfoxide, DMSO)を添加した培地 (5% FBS)へ交換し、24 時間培養した。本節 6. (2)に記載した COS-7 細胞の場合と同様に、培養上清と細胞溶解液を調製した。細胞. 16.

(24) 溶解液の総タンパク質濃度を、Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo)を使用して測定した。操作方法は製品の取り扱い説明書に従い、標準タンパク質として、製品付属の BSA を用いた。. 7. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動およびイムノブロットによるタンパク質の検出ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)は、Laemmli の方法に準じて行った 25) 。細胞溶解液または培養上清を、回収量に対して各条件間で等比となるように分取し、還元剤 2-メルカプトエタノール (Nacalai tesque)を含む SDS-PAGE サンプルバッファーと混合し、95℃、5 分間加熱した。この標品を、SDS‐ポリアクリルアミドゲルで泳動し、タンパク質を分離した。ゲル中のタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜 (Millipore)へセミドライ方式で電気的に転写し、以下のようにイムノブロットを行った。転写した膜を 5% スキムミルクを含むトリス [tris(hydroxymethyl)aminomethane]緩衝液 (Tris buffered saline, TBS) (pH 7.6)でブロッキング処理をした後、膜を 0.1%の Tween 20 を含む TBS (TBS-T)で洗浄した。TBS または Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution 1 (TOYOBO) へ、目的のタンパク質を認識する 1 次抗体を添加した溶液とインキュベートした。膜を TBS-T で洗浄後、TBS または Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution 2 (TOYOBO) へ、1 次抗体の宿主の IgG に対する 2 次抗体を添加した溶液とインキュベートした。膜を TBS-T で洗浄後、化学発色法により、抗体の認識するタンパク質のバンドを可視化した。. 8. 界面活性剤を用いた二相分配法 GST 融合タンパク質を安定発現した HepG2 細胞を培養用ディッシュ (直径 100 mm)に播種した。ほぼ 100% コンフルエントになるまで培養し、3% DMSO を含む培地 (5% FBS)に交換後 24 時間培養した。または、COS-7 細胞を培養用ディッシュ (直径 60 mm)に播種し 24 時間培養した。各種 GST 融合タンパク質をコードするプラスミドをポリエチレンイミン法によって 10% FBS 存在下で導入し、そのまま 48 時間培養した。. 17.

(25) 二相分配には CelLytic MEM Protein Extraction Kit (Sigma-Aldrich)を使用した。操作方法は製品の取り扱い説明書に準じた。以下にその手順を簡単に記載する。細胞培養終了後、培養液を除去し氷冷 PBS で 2 回洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテル (Sigma-Aldrich)を添加した氷冷 Lysis and Separation Buffer を加え、氷上で 10 分間静置した。溶解した細胞を 1.5 mL チューブへ回収し、核などの不溶性の成分を除去するために 10,000×g、4℃で 5 分間遠心分離し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液を 30‐32℃ で 5 分間インキュベートし、室温で 3,000×g、3 分間遠心することにより二層に分離させた。水相として上層を回収した。混入した可溶性のタンパク質を取り除くために、下層へ氷冷した Wash Buffer を添加・混合した。氷上で 10 分間インキュベートした後、30‐32℃で 5 分間インキュベートし、室温で 3,000×g、3 分間遠心することにより二層に分離させた。上層を洗浄液として、下層を界面活性剤相として回収した。細胞溶解液、水相、洗浄液、界面活性剤相に含まれるタンパク質を解析するために、回収量に対して同じ比率で分取した各標品について SDS-PAGE を行い、タンパク質を分離した。さらにイムノブロットを行った。イムノブロットには、GST 融合タンパク質を検出するために抗 GST 抗体を、コントロールタンパク質であるアクチンまたはカルネキシンを検出するために、それぞれ抗アクチン抗体または抗カルネキシン抗体を使用した。. 9. 間接蛍光抗体法培養用 6-well プレートにカバーガラスを入れ、0.1% ゼラチン水溶液を添加して室温でインキュベートすることによりカバーガラスにゼラチンコート処理をした。ゼラチン水溶液を除去し、PBS で洗浄した後、ウェルの底面積の 20%に相当する COS-7 細胞を播種して 24 時間培養した。ポリエチレンイミン法で各 GST 融合タンパク質をコードするプラスミドを 10% FBS 存在下で導入し、6 時間後に 10% FBS 含有培地に交換してさらに 42 時間培養した。培養終了後、培養液を除去し氷冷した PBS で洗浄した。終濃度で 3.7%のホルムアルデヒド (Nacalai tesque)を含む PBS を添加し氷上で 30 分静置して固定化処理を行った。0.1%の Tween 20 を含む PBS (PBS-T)に終濃度で 0.1％となるように Triton X-100 を添加した溶液との、10. 18.

(26) 分間のインキュベートを 3 回繰り返し、膜透過処理をした。PBS-T に終濃度で 2%の FBS を添加したブロッキング液中で、室温 30 分間静置した。PBS-T で洗浄後、ブロッキング液で希釈した抗 GST 抗体と 4℃で一晩または室温で数時間インキュベートした。PBS-T で洗浄後、Cy2 標識抗ウサギ IgG 抗体をブロッキング液で希釈した溶液と、室温で 1 時間インキュベートした。PBS-T で洗浄後、カバーガラスごと細胞をスライドガラス上へ移動し polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO antifading (Sigma-Aldrich)で封入した。蛍光顕微鏡 BX51 (Olympus)およびデジタルカメラ DP21 (Olympus)で観察し、画像を取得した。. 第3節. 結果. 1. COS-7 細胞に導入したラット(プロ)レニン受容体細胞外領域の解析シグナルペプチドの直後に FLAG タグを付加したラット(P)RR 全長 FLAG-rFL と細胞外領域 FLAG-rECD をコードする哺乳類細胞用の発現ベクターを作製した (Fig. 2-1 A)。これらのベクターを COS-7 細胞へ遺伝子導入し、FLAG-rFL と FLAG-rECD を一過性に発現させた。細胞内に存在した、または培養上清中に分泌されたタンパク質を SDS-PAGE で分離し、抗 FLAG M1 抗体を用いたイムノブロット法で目的タンパク質を検出した。その結果、FLAG-rFL は、細胞内に検出されたが培養上清中に検出されなかった (Fig. 2-2)。一方、細胞外領域である FLAG-rECD は、膜貫通領域を持たないのにも関わらず、細胞内には検出されたが培養上清中には検出されなかった (Fig. 2-2)。この結果は、細胞外領域が細胞内に貯留したことを示している。. 19.

(27) A. 1 17. FLAG-rFL. 18. SP FLAG 1 17. FLAG-rECD. B. SP. SP. SP. SP. 10His. 304 326 350. TM Cyto. ECD (253) 17. 304. ECD. GST (253). GST. (1). GST. 304. (253) 17. (1). GST-KDEL. 350. TM Cyto. ECD. GST. (1). GST-ECD. 18. SP FLAG. (1). GST-FL. 304. Extracellular domain (ECD). -KDEL (249). GST. Fig. 2-1. Schematic representation of FLAG-tagged and GST-fused (P)RR constructs used in the experiments in chapter 2. (A) The full-length (FL) (P)RR construct (FLAG-rFL), which includes the transmembrane (TM) and cytoplasmic (Cyto) domains, and the (P)RR extracellular domain (ECD) were tagged with an N-terminal FLAG epitope (FLAG). FLAG-rECD also contained a C-terminal decahistidine (His) tag. (B) Each glutathione S-transferase (GST) fusion construct contained a foreign signal peptide (SP) at the N-terminus of GST that targets the protein for secretion. GST-KDEL contained a KDEL C-terminal endoplasmic reticulum (ER) retention sequence. Numbers and those in parentheses indicate amino acid positions in rat or human (P)RR sequences and those in GST with SP, respectively.. 20.

(28) FLAG-rFL FLAG-rECD Vector (kDa) Cell Sup Cell SupCell Sup 1581169766-. 5643FLAG-rFL FLAG-rECD. 35-. 27-. Fig. 2-2.. Retention of the extracellular domain construct of rat (P)RR in transfected COS-7 cells.. COS-7 cells grown in 6-well plates were transfected with either empty vector (vector) or the expression plasmids coding for either FLAG-rFL or -rECD. After 24 h of transfection, the cells were cultured in serum-free medium for 48 h. Culture supernatants (Sup) were harvested and cell lysates (Cell) were prepared. The cell lysates (25%) and culture supernatants (25%) were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting using anti-FLAG M1 antibody.. 2. グルタチオン S-トランスフェラーゼ融合ヒト(プロ)レニン受容体細胞外領域の解析 (1) COS-7 細胞に導入したグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の細胞内および培養上清中での発現とその細胞内分布 (P)RR の細胞外領域である FLAG-rECD は、細胞内に貯留した。分泌タンパク質が細胞内に貯留されるメカニズムとして、2 つの可能性が考えられる。1 つは、細胞膜との直接的または間接的な安定した結合の形成、もう 1 つは、回収装置による回収である 47) 。(P)RR 細胞外領域である FLAG-rECD の一次配列には、既知の細胞内局在シグナルは認められなかった。そこで、(P)RR の細胞外領域が細胞内に貯留するメカニズムについて知見を得るために、界面活性剤を用いた二相分配法 (two-phase separation)を用いて解析した。この手法は、くもり点抽出 (cloud point extraction)とも呼ばれ、膜タンパク質の分離に用いられる 3) 。この手法では細胞膜結合性のタンパク質も同様に分離されるため、細胞膜に直接結合するタンパク質だけでなく、膜タンパク質との複合体として間接的に細胞膜と結合している可溶性の. 21.

(29) タンパク質を調べる方法としても用いられている。本研究では、キャリアタンパク質として、組換えタンパク質精製用のタグとして繁用されている日本住血吸虫由来の GST を用いた。分泌経路のシステムによって生合成されるようにシグナルペプチドを付加した GST をコードする哺乳類発現用ベクターを作製した (Fig. 2-1 B)。加えて、このシグナルペプチドを持つ GST の C 末端に、ヒト(P)RR 全長を融合させた GST-FL、細胞外領域を融合させた GST-ECD、または小胞体残留シグナルである KDEL 配列 32)を付加した GST-KDEL をコードする発現用ベクターをそれぞれ作製した (Fig. 2-1 B)。 GST-KDEL は、回収メカニズムによる細胞内貯留のモデルタンパク質である。これら 4 種類のベクターをそれぞれ COS-7 細胞へ遺伝子導入して一過性に発現させ、細胞内に存在する、または細胞外に分泌された GST 融合タンパク質を SDS-PAGE および抗 GST 抗体を用いたイムノブロット法で検出した。その結果、Fig. 2-3 A に示すように、可溶性タンパク質である GST 単独は、細胞内にはわずかにしか検出されず、多くが培養上清中に検出された。このことは、GST が分泌型タンパク質として効率良く培地中に分泌されており、GST は細胞内に貯留する性質を持たないということを示している。一方、小胞体残留シグナルを付加した GST-KDEL は培地中にわずかに検出されたものの、多くが細胞内に検出された。GST-FL と GST-ECD は細胞内に検出されたが、培養上清中には検出されなかった。 COS-7 細胞において一過性に発現させた GST 融合タンパク質の細胞内での分布を、抗 GST 抗体を用いた間接蛍光抗体法によって解析した。その結果、GST-FL、GST-ECD、および GST-KDEL は、核周辺から細胞表面に向かって広がる細胞内の膜構造様の分布として検出された (Fig. 2-3 B)。GST 単独を導入した細胞では、抗 GST 抗体での染色はほとんど認められなかった (Fig. 2-3 B)。これらの結果は、Fig. 2-2 において FLAG-rECD が細胞内に貯留されるという、ラット(P)RR の細胞外領域で認められた現象が、異なる動物種の(P)RR や異なるタグを付加した場合においても起きることを示している。. 22.

(30) A. Cell lysate. Culture supernatant. (kDa) 116.3-. (kDa). *. 116.366.2-. * GST-FL. 66.2-. * *. GST-ECD. 45-. 45-. 31-. 31-. GST-KDEL GST. GST-KDEL GST. 21.5-. 21.5-. B. GST-FL. GST-ECD. 20 μm. GST-KDEL. Fig. 2-3.. GST. Retention of the extracellular domain construct of human (P)RR in transfected COS-7. cells. (A) COS-7 cells grown in 6-well plates were transfected with either empty vector (vector) or the expression plasmids coding for GST-FL, -ECD, -KDEL, or GST alone. After 48 h of transfection, culture supernatants were harvested and cell lysates were prepared. The cell lysates (4%) and culture supernatants (2%) were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting using anti-GST antibody. Asterisks indicate non-specific protein bands. (B) COS-7 cells grown on a cover glass placed in 6-well plate were transfected as in (A). After 48 h of transfection, the cells were fixed in 3.7% formaldehyde in PBS and permeabilized in PBS containing 0.1% Tween 20 and 0.1% Triton X-100. After blocking in PBS containing 2% FBS and 0.1% Tween 20, the cells were incubated with anti-GST antibody, washed, and then incubated with Cy2-conjugated anti-rabbit IgG antibody. Fluorescence images were obtained using a fluorescence microscope. Scale bars, 20 μm.. 23.

(31) (2) HepG2 細胞に導入したグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の細胞内および培養上清中での発現 COS-7 細胞で認められた GST 融合(P)RR 細胞外領域の細胞内貯留が、他の細胞種と共通する現象であるかを確かめるために、ヒト肝臓腫瘍由来の細胞株である HepG2 細胞を用いて同様の実験を行った。GST-FL、GST-ECD、GST-KDEL、および GST 単独を、HepG2 細胞に遺伝子導入することにより一過性に発現させ、細胞内に存在する、または細胞外に分泌された GST 融合タンパク質を SDS-PAGE および抗 GST 抗体を用いたイムノブロット法で検出した。その結果、Fig. 2-4 A に示すように、GST 単独は細胞内にも検出されたが、多くは培養上清中に検出された。GST-FL、GST-ECD、および GST-KDEL は細胞内に検出されたが、培養上清中には検出されなかった。次に、GST-FL、GST-ECD、および GST-KDEL のそれぞれを安定発現させた HepG2 細胞を構築した。これらの細胞を用いて細胞内に存在する、または細胞外に分泌された GST 融合タンパク質を SDS-PAGE および抗 GST 抗体を用いたイムノブロット法で検出した。Fig. 2-4 B に示すように、GST-FL、GST-ECD、および GST-KDEL はいずれも細胞内に検出されたが、培養上清中には検出されなかった。これらの結果は、(P)RR の細胞外領域が、異なる種類の培養細胞においても細胞内に貯留することを示している。. 24.

(32) A. Cell lysate. Culture supernatant. (kDa). (kDa). 116.3-. 116.3-. 66.2-. *. 45-. *. 66.2-. GST-FL GST-ECD. 31-. 31-. GST-KDEL GST 21.5-. B. Culture supernatant. (kDa) 116.3-. (kDa) 116.3-. 45-. 31-. *. 66.2GST-FL GST-ECD. GST-KDEL. 21.5-. Fig. 2-4.. GST 21.5-. Cell lysate. 66.2-. *. 45-. * 45-. 31-. 21.5-. Retention of the extracellular domain construct of (P)RR in transfected HepG2 cells.. (A) HepG2 cells grown in 35-mm-diameter dishes were transfected with either empty vector (vector) or the expression plasmids coding for GST-FL, -ECD, -KDEL, or GST alone in the medium containing 5% FBS. After 48 h of transfection, the cell lysates (8%) and culture supernatants (2%) were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting using anti-GST antibody. (B) Wild type (WT) HepG2 cells and those stably expressing either GST-FL, -ECD, or -KDEL were cultured in fresh medium containing 5% FBS for 24 h in 6-well plates. The cell lysates (50 µg of total protein) and culture supernatants (2%) were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting using anti-GST antibody.. 25.

(33) (3) 界面活性剤を用いたグルタチオン S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の二相分配 (P)RR 細胞外領域が、細胞内の膜との結合によって細胞内に貯留しているかを調べるために、界面活性剤を用いた二相分配法を、各種 GST 融合タンパク質を発現させた動物細胞を用いて実施した。GST-FL、GST-ECD、および GST-KDEL それぞれを安定発現させた HepG2 細胞の界面活性剤溶解液を調製し、二相分配を行った。回収した細胞溶解液 (total cell lysate)、水相 (aqueous phase)、界面活性剤相 (detergent phase)、および洗浄液 (wash fraction)に含まれるタンパク質を SDS-PAGE により分離し、抗 GST 抗体を用いたイムノブロット法で GST 融合タンパク質を検出した。また、二相分配が適切に行われているかを確認するために、標準タンパク質として細胞質の可溶性タンパク質であるアクチン、小胞体の膜貫通タンパク質であるカルネキシンを、それぞれ認識する抗体を使用したイムノブロット法で検出した。 GST-FL、GST-ECD、および GST-KDEL をそれぞれ発現させた HepG2 細胞のいずれでも、カルネキシンは、膜結合性タンパク質の分離される界面活性剤相に検出されたが (Fig. 2-5 A 中段)、可溶性タンパク質アクチンは、界面活性剤相に検出されなかった (下段)。この結果は、二相分配が適切に行われたことを示している。抗 GST 抗体を用いたイムノブロットにおいて、(P)RR 全長である GST-FL と細胞外領域である GST-ECD は、いずれも界面活性剤相に検出された (上段左、中央)。一方、回収装置による回収メカニズムのモデルタンパク質である GST-KDEL は界面活性剤相に検出されなかった (上段右)。さらに、GST-FL、GST-ECD、GST-KDEL、および GST を一過性に発現させた COS-7 細胞を用いて二相分配を実施した。その結果、HepG2 細胞を用いた場合と同様に、GST-FL と GST-ECD は界面活性剤相に検出されたが、GST-KDEL と GST は界面活性剤相に検出されなかった (Fig. 2-5 B)。これらの結果は、GST 融合(P)RR 細胞外領域である GST-ECD が、細胞膜との相互作用を介して細胞内に貯留されていることを示している。. 26.

(34) A HepG2 GST-ECD. GST-FL anti-GST. (kDa) T 66.2-. A W D. 66.2-. T. GST-KDEL. A W D. T. 31-. anti-calnexin 116.3-. 116.3-. 116.3-. 45-. 45-. 45-. anti-actin. A W D. B COS-7. GST-FL anti-GST. (kDa) T A W D 66.2-. 66.2-. GST-ECD. GST-KDEL. GST. T AW D. T AW D. T AW D. 31-. 31-. *. *. anti-calnexin 116.3-. 116.3-. 116.3-. 116.3-. 45-. 45-. 45-. 45-. anti-actin. Fig. 2-5. Retention of the extracellular domain construct of (P)RR in HepG2 cells or COS-7 cells mediated by stable association. (A) HepG2 cells stably expressing either GST-FL, -ECD, or -KDEL were solubilized in lysis buffer and submitted to phase separation. Equal portions of the cleared total cell lysates (T), aqueous phases (A), wash fractions (W), and detergent phases (D) were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting using indicated antibodies. (B) COS-7 cells were transfected with the expression plasmids coding for either GST-FL, -ECD, -KDEL, or GST alone. After 48 h of transfection, cells were solubilized in lysis buffer and submitted to phase separation. Equal portions of the cleared total cell lysates (T), aqueous phases (A), wash fractions (W), and detergent phases (D) were analyzed by SDS-PAGE followed by immunoblotting using the indicated antibodies. Arrows indicate bands corresponding to GST-fusion proteins. Asterisks indicate non-specific protein bands.. 27.

(35) 第4節. 考察. 本研究では、当初哺乳類細胞での(P)RR 細胞外領域の生産を試みた。しかし、目的のタンパク質を細胞内に発現させることはできたものの、細胞外領域は予想に反して培地中に分泌されなかった。Öhman らは、シグナルペプチドと GST タグを付加した一回膜貫通タンパク質を遺伝子工学的手法により哺乳類培養細胞に発現させ、培地中に分泌された可溶型のタンパク質を精製した. 38). 。本研究において、N 末端側にシグナルペプチドが付加されてい. る GST を持つという点で Öhman らの組換えタンパク質と構造が同じである GST 単独が細胞外に分泌されている点 (Fig. 2-3 A、2-4)、また、蛍光抗体法において GST-FL、GST-ECD、および GST-KDEL が核の周囲に広がった膜構造様の分布を示した点 (Fig. 2-3 B)から、タンパク質の設計通りに分泌経路を経て GST-ECD タンパク質が合成されていると判断される。本研究では、抗体での検出ならびにアフィニティー精製のために、エピトープタグを(P)RR 細胞外領域へ付加した。遺伝子導入による組換えタンパク質の強発現で問題となることのある実験系への人為的な影響を考慮し、異なるタグを付加したコンストラクト、異なる培養細胞株を用いて同様の実験を行った。しかし、本研究の条件において、(P)RR 細胞外領域は培養上清中に検出されなかった (Fig. 2-2、2-3 A、2-4)。GST 単独の高い分泌効率に対して、ECD の付加による GST 融合体の分泌効率が著しく低下したのは明らかである。蛍光免疫染色で検出された膜構造様の分布 (Fig. 2-3 B)は、GST-ECD が小胞体や他の膜構造を持つオルガネラの膜と相互作用することにより細胞内に貯留したことを示している。以上の結果より、(P)RR 細胞外領域が細胞内に留まる現象は、細胞外領域のタンパク質としての特性、あるいは他のタンパク質との相互作用によって起きるのではないかと考えた。この可能性をさらに調べるために、本研究では界面活性剤を用いたタンパク質の二相分配法を使用した。この方法は膜結合性タンパク質を分離する方法として知られている. 3). 。. ある種の界面活性剤の水溶液は、加温するとくもり点と呼ばれる温度を境に相分離する性質を持ち、界面活性剤相と水相に分画できる。本研究で実施した二相分配はこの性質に基づいている。くもり点は界面活性剤の種類によって異なるが、Triton X-114 などの界面活性. 28.

(36) 剤は、タンパク質が変性しにくい温度にくもり点を持つため、この手法に利用されている 3). 。タンパク質の界面活性剤溶解液を、くもり点を上回り、かつタンパク質が変性しない程. 度の温度まで加温し相分離させると、膜結合性タンパク質は界面活性剤相へ回収され、親水性のタンパク質から分離することができる。分子シャペロンなどの小胞体内腔に常在する可溶性タンパク質のいくつかは小胞体残留シグナルを持ち、回収装置による動的な回収機構により小胞体に留まる。よく知られている例としては、C 末端の小胞体残留シグナル、動物の場合典型的には KDEL 配列を持つ、カルレティキュリンや glucose regulated protein 78 (GRP78)などの小胞体内腔の常在タンパク質である 32,40)。これらのタンパク質は、小胞体からゴルジ体へもれでると、回収装置である KDEL 受容体と結合し小胞体へ連れ戻され、その後小胞体内で KDEL 受容体との結合から解放される 27,40)。KDEL 配列を持つ小胞体内腔タンパク質であるプロテインジスルフィドイソメラーゼ (protein disulfide isomerase)は、ヒト皮膚線維芽細胞を材料として界面活性剤を用いた二相分配を行ったところ、界面活性剤相には分離されなかった 23)。本研究において、小胞体残留シグナル KDEL を C 末端に持つタンパク質のモデルである GST-KDEL も、二相分配を行った結果界面活性剤相に分離されなかった (Fig. 2-5)。一方、KDEL 配列を持たない小胞体内腔タンパク質であるリシルハイドロキシラーゼ (lysyl hydroxylase)は、界面活性剤を用いた二相分配による解析において、界面活性剤相に分離されたと報告された 23,52)。著者らは、リシルハイドロキシラーゼが回収によるメカニズムとは異なる方法で小胞体に留められると述べている 23,52)。 (P)RR の細胞外領域を持つ FLAG-rECD や GST-ECD は、膜貫通領域および細胞質領域を欠損させているため、一次構造の点から可溶性タンパク質となることが予想されたが、二相分配で界面活性剤相に分離された (Fig. 2-5)。界面活性剤を用いた二相分配という手法では、膜貫通タンパク質と安定した複合体になっている可溶性タンパク質も界面活性剤相に分離される。(P)RR と相互作用するタンパク質として Cruciat らは、Wnt 受容体である膜貫通タンパク質 Frizzled 8 と低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質 (low-density lipoprotein receptor-related protein 6、LRP 6)、ならびに V-ATPase 複合体のサブユニット. 29.

(37) ATPV0C について報告している. 10). 。著者らは、これらのタンパク質と(P)RR が結合すると. 免疫沈降法によって示した 10)。この報告において、(P)RR の膜貫通領域および細胞質領域を欠損させた変異体では、Wnt 受容体との結合は減少し、ATPV0C との結合は失われた 10) 。従って、GST-ECD がそれらのタンパク質を介して細胞内に貯留されているとは考えにくい。しかし、別の膜タンパク質が、(P)RR と細胞内の膜との相互作用に介在している可能性も考えられる。これとは異なる可能性として、(P)RR のタンパク質としての性質により、疎水性の高い領域で細胞内の膜と直接結合しているとも考えられる。あるいは、何らかの翻訳後修飾を介して細胞内の膜に直接結合しているとも考えられる。後者に関しては、(P)RR の一次構造に既知の特徴的な翻訳後修飾配列の存在が、現時点では認められていない。本研究で使用した(P)RR 細胞外領域の、N 末端側の大部分を含む s(P)RR は、ゴルジ体にあるプロテアーゼの限定分解により生産され、細胞外に分泌されると報告されている 9,55) 。 Cousin らや Yoshikawa らは、細胞内および培地中に放出された内在性の(P)RR を、様々な種類の細胞を用いてイムノブロットで検出している 9,55) 。彼らの実験結果を詳細に見ると、いくつかのタイプの細胞では、かなりの量の s(P)RR が細胞内に認められる。彼らはこの点について特に述べていないが、彼らの報告と本論文の結果を鑑みると、細胞内の s(P)RR は、単にゴルジ体での生成から構成性分泌で細胞外に放出される過程の途中段階であるものが存在しているだけではなく、何らかのメカニズムによって調節を受けて、細胞の種類によっては細胞内に貯留するのではないかと推察される。その調節メカニズムが、本研究で認められた、細胞内の膜との細胞外領域の直接的または間接的な相互作用と関連しているのかもしれない。以上、第 2 章の研究において、(P)RR の細胞外領域は細胞内に貯留し、GST を融合させた細胞外領域は、細胞内の膜との直接的または間接的な相互作用を介して細胞内に貯留することが示唆された。. 30.