マウスをモデルとするES細胞及び核移植による遺伝
子改変動物作出技術の開発に関する研究
著者
水谷 英二
号
859
発行年
2005
URL
http://hdl.handle.net/10097/16779
氏
名(本籍)
学 位 の 種 類
学 位 記 番 号
学位授与年月 日
学位授与 の要件
研 究 科 専 攻
学 位 論 文 題 目
みず たに えい じ 水 谷 英 二 博 士(農 学) 農 博 第859号 平 成18年3,月24日 学 位 規 則 第4条 第1項 該 当 農 学研 究科 応用 生命 科学 専攻 (博 士課程) マ ウス を モデ ル とす るES細 胞 及 び核 移 植 に よ る遺 伝 子 改 変動物 作 出技 術 の開発 に関す る研 究論 文 審 査 委 員
(主 査)教 授 佐 藤 (副 査)教 授 西 森 助 教授 佐 々 田 助 教授 豊 水明
彦
志
昭
呂
英
克
比
正
論
文
内
容
要
旨
1.緒 言 体 外 で 生 殖 細 胞 を操 作 す る こ とに よ り産 子 を生 産 す る発 生 工 学 技 術 は,実 験 動 物 で の胚 培 養 ・体 外 受 精 技 術 に始 ま り,1980年 代 か らは ウ シ な どの産 業 動 物 で の体 外 成 熟 培 養 ・受 精 ・胚 培 養i(IVMFC)に 続 き,ご く最 近,1997年 に は体 細 胞 を ドナ ー 核 と した ク ロー ン ヒツ ジ を作 出す る核 移 植 技 術 ま で発 展 して き て い る。 この 間,胚 性 幹 細胞(ES細 胞)を 利 用 した ジー ン ター ゲ テ ィ ン グ法 が 開発 され, ES細 胞 を培 養 下 で遺 伝 子 操 作 した 後 に受 精 卵 へ 注 入 しキ メ ラマ ウス を作 り,F1 キ メ ラマ ウ ス 同 士 の 交 配 に よ りノ ック ア ウ ト動物 の作 出 が 可能 とな っ た。 しか しな が ら,ES細 胞 に よ りキ メ ラ個 体 を作 出す る能 力 は異 な り,ま た,F1キ メ ラマ ウス が作 出 され た場 合 で も生 殖 細 胞 にES細 胞 由来 の遺 伝 子 が導 入 され ず 目的 の 遺伝 子 改 変 マ ウス が得 られ ない 場 合 も多 い 。一方,1997年 に株 化 細 胞 の乳 腺 細 胞 を ドナ ー核 と した 核 移 植 技 術 に よ り体 細 胞 ク ロー ン ヒツ ジ が作 出 され,哺 乳 類 に お い て も体 細 胞 か ら ク ロー ン個 体 が 作 出 で き る こ とが 証 明 され,現 在 ま で に 10種 類 以 上 の動 物 種 にお い て 体 細胞 ク ロー ン個 体 の作 出 が 報 告 され て い る。 核 移 植 技 術 の大 き な利 点 と して,体 細 胞 に遺 伝 子 の 相 同組 換 え を行 う こ とに よ り, マ ウス 以外 の動 物 で樹 立 が 困難 なES細 胞 を用 い ず に遺伝 子 改 変 動 物 を作 出 で き る可能 性 が あげ られ る。しか しな が ら,現 在 の とこ ろ核 移 植 技術 に よ る体 細胞 ク ロー ン個 体 作 出 の 成 功 率 は数%と 低 い う え に ,体 細 胞 ク ロー ン個 体 に お け る 様 々 な異 常 も報 告 され,成 功 率 の 向上 お よび 正 常 個 体 作 出 系 の 開発 が 望 まれ て い る。 以 上 の 背 景 下,本 研 究 で は実 験 動 物 と して広 く利 用 され てい るマ ウス を用 い, 発 生 工 学 を利 用 した産 子 獲 得 技 術 の基 礎 研 究 と して,ま ずジ第 一 にES細 胞 を用 い た遺 伝 子 改 変 動 物 の作 出効 率 を上 げ るた め に,従 来 の体 外 受 精 や 自然 交 配 で は な く,顕 微 授 精 技 術 を用 い る こ とを発 想 した。 顕 微 授 精 技 術 で は,1個 の精 子 を直 接 卵 子 へ 注 入 す る こ とか ら,精 子 数 が少 ない 場 合 や 運 動 能 力 を持 た ない 精 子 か らで も産 子 を得 る こ とが可 能 で あ る。第 二 に,体 細 胞 ク ロー ン個 体 作 出 の効 率 向上 を 目的 に体 性 幹 細 胞 を用 い た体 細 胞 ク ロー ン個 体 作 出法 の 開発 お よび 体 細 胞 由来 耳S細 胞 注 入 法 に よ る ク ロー ン胚 の発 生 能 力 の改 良 を検 索 した 。 2.顕 微 授 精 を併 用 した 効 率 的 なES細 胞 由来 産 子 の作 出 2.1.GFPを 発 現 す るES細 胞 由 来 精 子 分 別 に よ る顕 微 授 精 Greenfluorescenceprotein(GFP)遺 伝 子 を導 入 した3種 類 のES細 胞 をマ ウ スの 胚 盤 胞;期胚 に注 入 後 仮 親 子 宮 へ 胚 移 植 し,キ メ ラマ ウス を作 出 した(Fig.1)。作 出 した6頭 の 雄 キ メ ラ マ ウ ス を 自然 交 配 した 結 果,3頭 の 個 体 でES細 胞 由 来 の 産 子 が 得 られES細 胞 の生 殖 細 胞 系 列 へ の分 化 が確 認 され た(Tablel)。 次 に,6頭 の個 体 か ら精 巣 を取 り出 し,UV照 射 下 で解 析 した と ころ,す べ て の キ メ ラマ ウ ス精巣 の 曲精 細 管 内 にGFP蛍 光 を発 現 す る領 域 が存 在 した。 この領 域 は発 現 して い な い領 域 とで縞 模 様 状 の コ ロニ ー を形 成 して い る こ とが観 察 され,2種 類 の 曲精 細 管 を容 易 に 分 離 す る こ とが 可能 で あ っ た(Fig.2お よび3)。 そ こ で,こ れ らの精 細 管 を別 々 に切 り出 し精 巣 内 精 子 を採 取 し,そ れ ぞ れ の精 子 を マ ウ ス の成 熟 卵 子 へ 顕微 注 入 し,翌 日2細 胞 期 へ発 生 した胚 を仮 親 子 宮 へ胚 移 植 した。そ の結 果, 6頭 す べ て の キ メ ラマ ウス精 巣 か ら採 取 したGFP蛍 光 を発 現 す る 曲精 細 管 内 の 精 子 に よ る顕微 授 精 に よ り,ES細 胞 由来 の産 子 を得 る こ とがで き た(Table2)。 特 に,6頭 中2頭 の個 体 で は 自然 交配 に よ りES細 胞 由来 産 子 が得 られ な か っ た が (Tablel),顕 微 授 精 に よ りES細 胞 由来 産 子 を効 率 的 に作 出す る こ とが で き た。 一方 ,GFP蛍 光 を発 現 しな い もの で はES細 胞 由来 の産 子 が得 られ なか っ た。 以上 の結 果,GFPを 導 入 し顕 微 授 精 技 術 を用 い る こ とで,ES細 胞 由来 の子 孫 が 得 られ る こ とが示 され た。 この こ とに よ り,キ メ ラ個 体 でES細 胞 の生 殖 細 胞 系 へ の 寄 与 率 が 低 く 自然 交配 で はES細 胞 由来 の 産子 が得 られ ない 場 合 で も,精 巣 内 に はES細 胞 に 由来す る生殖 細胞 が存 在 す る可能 性 が初 めて 明 らか に され,顕 微 授 精 に よ り確 実 にES細 胞 由来 の産 子 を作 出 で き る方 法 が開発 され た 。 2.2.GFPを 発 現 す るES細 胞 由来 円形 精 子 細 胞 を用 い た顕微 授 精 顕 微 授 精 法 の 応 用 技 術 と して 成 熟 精 子 に な る前 の 円 形 精 子 細 胞 を 用 い た Roundspemlatid切ection(ROSI)法 が あ る。 この方 法 に よ り,遺 伝 的 に希 少価 値 が 高 い モ デ ル 動 物 で あ る も の の精 子 形 成 不 全 や 乏 精 子 症 の個 体,あ るい は精 子 形 成 過 程 が完 成 す る前 の 未 成 熟 個 体 か らで も産 子 を得 る こ とが 可 能 で あ る。 そ こ でGFP蛍 光 を発 現 す るES細 胞 由来 の キ メ ラマ ウス を作 出 し,精 子 形 成 過 程 が完 成 して い な い20日 齢 の精 巣 か ら円形 精 子 細 胞 を採 取 後 顕微 授 精 し,ES細 胞 由来 産 子 を作 出す る可 能 性 を検 索 した。20日 齢 の キ メ ラマ ウス精 巣 をUV照 射 下 で 観 察 した ところ,成 熟 キ メ ラ マ ウス精 巣 と同様 に 曲精 細 管 内 にGFP蛍 光 を発 現 す る領 域 と発 現 しな い領 域 が存 在 した。続 い て,GFP蛍 光 を発 現 して い る 曲精 細 管 領 域 を切 り出 し採 取 した細 胞 懸 濁 液 を観 察 した 結 果,円 形 精 子 細 胞 が存 在 し てい た が成 熟 精 子 は認 め られ な か っ た。そ こで,円 形精 子 細 胞 を用 い てROSIを 行 っ た結 果,供 試 した3頭 す べ て でES細 胞 由来 の産 子 が得 られ,そ の率 は100% で あ っ た(Table3)。 2.3.GFP非 導 入ES細 胞 由来 精 子 分 別 に よ る顕 微授 精 前 節 ま で の実 験 でGFPを 導 入 したES細 胞 を用 い て作 製 した キ メ ラマ ウス精 巣 内生 殖 細 胞 の顕 微 授 精 に よ りES細 胞 由来 産 子 を効 率 的 に作 出す る こ とに成 功 した。 この場 合,GFP蛍 光 を指 標 に生 殖 細 胞 を分別 した が,ES細 胞 に遺 伝 子 導入 す る 場 合 必 ず し もGFP遺 伝 子 を並 行 導 入 す る あ る い は で き る と は 限 らず,前 節 ま で の 方 法 をそ の ま ま利 用 で き ない 可 能 性 が あ.る。 そ こで,GFPを 導 入 しな い ES細 胞 由来 精 子 を キ メ ラマ ウス精 巣 内で 分別 す るた め,キ メ ラ作 製 時 にGFPを
ホ ス ト胚 に導 入 し,GFPを 導 入 して い な い3種 類 のES細 胞 を用 い キ メ ラ個 体 を 作 出 した 。そ の結 果,作 出 した キ メ ラマ ウス精 巣 をUV照 射 下 で観 察 した ところ, GFP蛍 光 を強 く発 現 して い る曲精 細 管 領 域 と弱 い 領 域 が縞 状 に存 在 した。 二 つ の領 域 の 曲精 細 管 をそ れ ぞ れ切 り出 して精 子 を採 取 し,顕 微 授 精 を行 っ た結 果, 強 いGFP蛍 光領 域 か らは ホ ス ト胚 由来 の産 子 のみ が得 られ,弱 い領 域 か らはES 細 胞 由来 の産 子 が得 られ た(Table4)。 以 上,第1節 か ら3節 まで の結 果 か ら,本 章 で 開発 したES細 胞 由来 精 子 の 分 別 に よ る顕微 授 精 は キ メ ラ個 体 を作 出す る能 力 が低 いES細 胞,あ るい は 自然 交 配 で は 目的 の遺 伝 子 改 変 マ ウス が得 られ な い 場 合 で も応 用 範 囲 の広 い 技 術 で あ る こ とが 証 明 され た。 3.幹 細 胞 を用 い た体 細 胞 ク ロー ン個体 作 出 法 の 開発 3.1.神 経 幹細 胞 の採 取 とそ の特性 解 析 ク ロー ンマ ウス は卵 丘 細 胞 や セル トリ細 胞 な どの 分 化 した体 細 胞 や 多 能 性 を 持 つES細 胞 か ら作 出 され,後 者 で成 功 率 が 高 い こ とが報 告 され てい る。 こ の こ とは未 分 化 な ドナ ー 細 胞 が体 細 胞 ク ロー ン個 体 作 出 に適 して い る こ と を示 唆 し て い る。近 年,特 定 の組 織 へ 分化 す る種 々 の体 性 幹 細 胞 が見 つ か り,ES細 胞 が樹 立 され て い な い 動 物 種 にお い て遺 伝 子 改 変 動 物 作 出 の材 料 と して期 待 され て い る。 本 章 で は未 分 化 で あ る と考 え られ る体 性 幹 細 胞 の 一種 で あ る神 経 幹 細 胞 を ドナ ー 核 と して核 移 植 を行 い,体 細 胞 ク ロー ン個 体 作 出 効 率 の 向上 と共 に体 性 幹 細 胞 利 用 の 可能 性 を検 索 した。 生 後1∼4日 齢 の雄 マ ウス脳 か ら脳 室 周 辺 の 細胞 を採 取 した 。採 取後 単離 した 細 胞 を 浮遊 培 養 し,球 形 の細 胞 塊 を得 た 。得 られ た 細 胞 塊 が神 経 幹細 胞 の集 ま り に よ る ニ ュー ロス フ ェア で あ る こ とを確 認 す るた め,神 経 幹 細 胞 マ ー カ ー で あ るmusashi抗 体 お よび 分化 神 経 細 胞 マー カー で あ る β皿 一tubulin抗体 で免 疫 蛍 光 染 色 を行 った。 得 られ た細 胞 塊 はmusashi抗 体 陽性,β 皿一tubulin抗体 陰性 を示 し,神 経 幹細 胞 塊 で あ る こ とが確 認 で き た(Fig.4)。 さ らに,こ れ らの細 胞 塊 を接 着 培 養 した とこ ろ,培 養10∼14日 目にニ ュー ロ ン,オ リゴデ ン ドロサ イ ト,グ リア 細 胞 の 分 化 神 経 細 胞 マ ー カ ー に対 して 陽性 細 胞 が観 察 され,分 化 能 を維 持 して い る こ とが示 され た(Fig.5)。これ らの細 胞 塊 を ピペ ッテ ィ ン グに よ り単 離 し た 後 再 培 養 す る と新 た に 細 胞 塊 を 形成 す る こ とか ら,自 己増 殖 能 も持 って い る こ とが わ か っ た。 3.2.神 経 幹細 胞 核 移 植 に よる体 細胞 ク ロー ン胚 の発 生 能 ドナ ー 細 胞 と して,継 代 培 養3回 未 満 の 神 経 幹 細 胞,卵 丘 細 胞,セ ル ト リ細 胞 お よびES細 胞 を使 用 し核 移 植 を行 い,作 出 した2細 胞 期 胚 を仮 親 子 宮 へ 胚 移 植 した。そ の結 果,神 経 幹 細 胞 で は ク ロー ン個 体 作 出率 は0.5%(5/1072)で あ っ た の
に 対 し,卵 丘 細 胞 お よ び セ ル ト リ細 胞 で は そ れ ぞ れ2.7%(12/440)と2.2% (10/451)で あ り,ES細 胞 の場 合 で は3.5%(7/198)で あ っ た(Table5)。 神 経 幹細 胞 の 核 移 植 に よ って 得 られ た ク ロー ン個 体 は正 常 な 繁 殖 能 力 を示 した(Fig.6)。 次 に, ク ロー ン胚 の発 生 が どの段 階 で 停 止 して い るの か を体 外 胚 培 養 に よ り調 べ た 。 神 経 幹 細 胞 の場 合,2細 胞 期 へ の発 生 率 が セ ル トリ細胞 や 卵 丘 細 胞 と同様 で あ っ た の に対 し,4細 胞 期 へ の発 生 率 は急 激 に低 下 し桑 実 胚/胚 盤 胞 期 へ発 生 した もの は7.1%で あ った 。分 化 した体 細 胞 で は50%以 上 の ク ロー ン胚 が桑 実/胚 盤 胞 期 へ 発 生 した。ES細 胞 で は2細 胞 期 へ の発 生 率 が最 も低 く約30%で あ っ た が,こ れ らの大 部 分 は桑 実/胚 …盤胞 期 へ 発 生 した(Table6)。 以 上,第1節 お よび 第2節 の結 果 は,神 経 細 胞 で あ って も幹 細 胞 な らば核 移 植 に よ る初 期 化 が 可 能 で あ る こ とを示 し,生 後 の マ ウス 神 経 細 胞 か ら直 接 ク ロー シ個 体 を作 出 した,初 めて の成 功 例 で あ る。 さ らに,神 経 幹 細 胞 は未 分 化 状 態 を 維持 した ま ま 増殖 ・培 養 が可 能 な 細胞 で あ る こ とが わ か った 。 本 研 究 で は未 分 化 な 体 性 幹 細 胞 を ドナ ー 細 胞 と して用 い る こ とに よ り作 出効 率 の 向 上 を期 待 し た が,必 ず しも高 い結 果 で は な く,用 い る ドナ ー 細 胞 に適 した 処 理 が必 要 で あ る こ とが 示 唆 され た 。今 後,神 経 幹 細 胞 は種 々 の 改善 が必 要 で あ る とはい え核 移 植 技 術 を用 い た ノ ッ クア ウ ト動 物 作 出 な どの材 料 と して利 用 が期 待 で き る。 3.3.体 細 胞 由来 胚 性 幹 細 胞(ntES細 胞)注 入 に よる ク ロー ン胚 の発 生 能 力 向上 卵 丘細 胞 な どの体 細 胞 核 移 植 胚 で は胚 盤i胞期 胚 の 内部 細 胞 塊(ICM)に お け る 遺 伝 子 発 現 の異 常 が報 告 され て お り,ク ロー ン胚 で正 常 に遺 伝 子 発 現 す るICM の数 を増 や す こ とで,ク ロー ン胚 の発 生 能 力 向上 の可 能 性 を検 索 した。 そ こで, 核 移 植 技 術 に加 え て キ メ ラ作 出技 術 を併 用 す る こ とを発 想 した 。す な わ ち,体 細 胞 核 移 植 胚 を作 出後 培 養 す る こ とでntES細 胞 を樹 立 し,こ の細 胞 を他 の 同 じ起 源 を持 つ 体 細 胞 ク ロー ン胚 に移 植 す る こ とで,ク ロー ンキ メ ラ胚 を作 製 した 。通 常,キ メ ラ胚 を作 出す る場 合胚 盤 胞 期 胚 へES細 胞 を注 入 す るが,仮 親 へ の移 植 時 間 を考 慮 し,4∼8細 胞 期 胚 の囲 卵腔 内 へntES細 胞 を注 入 しキ メ ラ胚 を作 出 し た。対 照 と して,ES細 胞 を用 い た。作 出 した ク ロー ン キ メ ラ胚 盤 胞 期 胚 に つ い て,ICMを 認識 す るOct4抗 体 と栄 養 膜 細 胞 を認 識 す るcdx2抗 体 に よ る免 疫 染 色 後,全 細 胞 数,Oct4発 現 細 胞 数 お よび 個 体 へ の発 生 能 を調 べ た 。 そ の結 果,通 常 の卵 丘 細 胞 ク ロー ン胚 で胚 盤 胞 期 で の細 胞 総 数 が平 均41.4個,cdx2発 現 細 胞 数 が31.0個,Oct4発 現 細 胞 数 が7.2個 で あ った の に 対 し,胚 間 で バ ラツ キ は あ る も の のES細 胞 を 注入 した 区 で は細 胞 総 数 の平 均 は51.5個,cdx2発 現 細 胞 数 は36.5
個,Oct4発 現 細 胞 数 はll.5個 と増 加 した(Fig.7お よびFig.8)。 これ らの結 果 か ら,
ES細 胞 の 注 入 が 胚 盤 胞 期 で の 細 胞 増 殖 を促 進 して い る 可 能 性 が 示 唆 され た 。 作 出 した ク ロー ン キ メ ラ胚 を仮 親 子 宮 に移 植 し個 体 へ の発 生 能 を調 べ た 。 そ の結
ク ロー ン個 体 作 出効 率 は 向上 しな か った(Table7)。 本 節 の結果,ク ロー ン胚 に ES細 胞 を 注入 す る こ とで胚 盤 胞 期 にお け る細 胞 数 が増加 す る こ とが示 され た も の の,胚 移 植 して もク ロー ン作 出 効 率 は改 善 され な か った 。 以 上,本 研 究 は 実 験動 物 と して広 く利 用 され て い るマ ウ ス を用 い,発 生 工 学 を利 用 した 産 子 獲 得 技 術 の 基礎 研 究 と して, 1.顕 微 授 精 を併 用 した 効 率 的 なES細 胞 由来 産 子 の作 出 につ い て, ・ES細 胞 をGFPで 蛍 光 標 識 す る こ とに よ りキ メ ラ個 体 で のES細 胞 由来 生 殖 細 胞 とホ ス ト胚 由来 生殖 細 胞 を 区別 で き る ・ 作 出 した キ メ ラ個 体 の うち,自 然 交 配 で産 子 にES細 胞 由来 遺 伝 子 導 入 が認 め られ な い 場 合 で も精 巣 内精 子 の分 別 が 可能 で,ES細 胞 由来 精 子 の顕 微 授 精 に よ り非 常 に効 率 よ くES細 胞 由来 産 子 が得 られ る ・ ホ ス ト胚 にGFP蛍 光 を発 現 させ る こ とで ,キメ ラ個 体 で 蛍 光標 識 され て い な いES細 胞 由来 生 殖 細 胞 を選 択 的 に 採 取 で き,遺 伝 子 改 変 した あ らゆ るES 細 胞 に利 用 可能 で あ る こ とを 明 らか に し,ES細 胞 を利 用 した遺伝 子 改 変 動 物 を作 出す る発 生 工 学 技 術 に新 しい可 能 性 を提 供 し,さ らに, 2.体 性 幹 細 胞 を用 い た 体 細胞 ク ロー ン個 体 作 出 法 の 開発 につ い て, ・ 体 細 胞 ク ロー ンが 生 まれ な い と考 え られ て い た 生 後 の神 経 系 細 胞 で あ っ て も神 経 幹 細 胞 の核 移 植 に よ り作 出 可 能 で あ る 3.ntES細 胞 注 入 に よる ク ロー ン胚 の発 生 能 力 向 上 につ い て, ・ 体 細 胞 ク ロー ン胚 へ のntES細 胞 注 入 に よ りク ロー ン胚 盤 胞 期 胚 の細 胞 数 を 増加 させ る こ とが で き る こ とを 明 らか に し,マ ウス も含 め た 哺 乳 類 で の体 細 胞 ク ロー ン個 体 作 出 効 率 を 向上 させ る た め の手 がか りを提 供 す る もの と確 信 す る。
・ ≠ r 、 } τ こ F ゴ ・ 婁 ・ 隔 嶽 ・ 聖 ♪ ㌃ r コ ︺ p ﹂-・ み ρ 一 7 匹 . ﹄ ﹂ ∼ ﹁ ヂ ﹃畠 { .瓢 4 ・ ・洋 } 、 賢 ㌧ 幽 . 了 `曽 ⋮ 擁 . ﹂﹃ . { ゴ` 、 ↑ p ㌦ . 〃 厄 釜 . ﹁ ∴ ㌧ ∼ .∼ = 二 皆 ガ 隔35 . .・ ' 牛 ' マ . b ﹂ ニ ロ . ・㌢ 、繁 窒 で ﹁ -一 、 ∴ 二 . 一げ : ﹂ 一 、 日・ 二 ' 暴 慧 ゴ " 縦 馨 、. . ・ .桑 4 唯 .﹁" ' 二 ﹂ ' .て ・♪ , 壽 .婁 . .. . 硬 . マ ﹁ 藩 マ "-﹃ に 昌 ﹁ こ 呪 .二 . こ ﹂ ㌔ ; ﹁ = ゴ、 し r と . ↑ , ' ・ Table1.Germ-linetransmissionofEScellsinchimericmicebynatural mating Chimera No. Typeof donor EScell Parcentage ofES-derivedTotal sperm No.(%)oflitters withblackGFP-positiveand eyesblack-eyed 讐 噌 Fig.1.DonorEScells(129B6FIG1)anda chimericmalemouseproducedbyinjectionof thesecellsintoblastocysts.TheEScellsare shownunderlight(A)andfluorescence(A') microscopies.(B)Achimericmalemousecanbe distinguishedbytheircoatcolor.Scalebars= 600gym. 1 z 3 4 5 6 12966FIG1 12966FIG1 129B6FIG1 12966FIG2 EGFP EGFP 30.2費 2.7` 0費 0噛 ｫ. 禽★ 44 23 53 31 44 27 34(77) 3(13) 2(4) 0(0) 歪(2) 0(0) 13(30) 2(9) 1(2) 0(0) 0(0) 0(0) A H 晶-赫 一軸 藻o ...蚤 で ノ う ,寛ダ 珊.匪 乞・r ぢ じぷ ロ き ー茸ぎ 喜 『7 .セξ餐 ぎ ウドだ ド ここ なコモこ うココココ まこ ヘ ロア コ ミゴ ・棲 無,;、 ・ン`こ;三 誕 む れ ロ ひ イと み ニ ヨ ロニ =誕 ≒汐 戯 "BasedonGFPexpression ""MaturespermderivedfromEGFPEScelllinedidnotexpressGFP . . 逆 ゴ ' B
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ゴ 馳 ■ 卸 ' ` ∼ ナ ㍉ ﹁ 気 ∴ 濤 簗 = ﹂. . ゴ と モ き ヨ マ ひ ニ ド な ル ・ ; ㌃ 、 ﹂ 、 ∵ ∵ ∼ 一 ∴ 一 臥 ﹄ . . て Fig.2.AnalysisoftestesofchimericmicewithGFP-labeledEScellsandmicroinsemination usingtesticularsperm.(A)Testisderivedfromadultchimericmalemouse(ChimeraNo.10f Table1,eightweeksold).(A")ThetestisisshownundertheexcitationlightforGFP.(B)A seminiferoustubuleremovedfromthetestis.(B")Aseminiferoustubuleundertheexcitation light.GFP-expressingmalegermcellsaredistinguishablebytheirgreencolor.Greenandnon-greenregionsoftheseminiferoustubuleswereclearlyseparated(arrowhead).(C) Seminiferoustubulescollectedfromtestisofchimericmouse.(C")Thesametubulesare shownundertheexcitationlightforGFP.Greenandnon-greenregionsofseminiferous tubuleswerecollectedseparately.(D)Two-day-oldprogenywithblackeyeswereproduced withmicroinseminationusingthespermfromgreentubules.(D")Thesameprogenyare shownundertheexcitationlightforGFP.HalftheprogenyexpressedGFP.Scalebars:(A), (A")=1mm;(B),(B")=0.3mm;(C),(C")=0.5mm. A A' 二 ﹃ 二 ・ ﹂ご 劉 霧 讐 ぜ `夢 ∴貫 ∴、隔 黛 ぶ 灘 薯 越 . ♂ ﹂ 一﹃ .∵ . 一 馳 .i ﹃ ﹃ 、 、一 ﹁ . B ド ガ ゴう ユレで ロロコゴ くゑ 駕i∴職㌦ 戯 B' ヒ マ . ㍉ し 皇 Fig.3.Thetestisofachimeric mousethatdidnotproduce progenyfromEScellsbynatural mating.(A,A")Atestisfroma chimericmalemousewithavery lowrateofcolonizationbydonor EScells(ChimeraNo.40fTable1). Undertheexcitationlight(A"),a verylimitedregionexpressedGFP (arrowhead).(B,B.")Greenand non-greenseminiferoustubules werecollectedseparatelyfromthe testisin(A).Scalebars(A),(A")_ 1mm;(B),(B')=0.5mm.丁able2.MicroinseminationusingtesticularspermderivedfromGFP-labeledEiScells Chimera N◎.需 Regionof Seminiferous tubules No.ofembryos transferred**Total No.(%)oftitters Withblack eyes GFP-positiveand black-eyed 1 z 3 4 5 6 green non-green green non-green green non-green green non-green green non-green green non-green 130 79 89 51 n ∠ ハ O F O 4 τ 7 眞 り 4 3 4 Ω U Ω U 7 ハ ◎ ハ0 ハ δ 3 64 30 ハ ◎ (0 4 τ 、 リ ム 7 β 0 ∩∠ -﹃ 0 β0 1 1 5 β 0 向0 ∩∠ ハ◎ n∠ 1 1 64(100) 0(0) 46(100) 0(0) 27(100) 0(0) 10(67) 0(0) 35(100) 0(0) 11{69) 0(0) 39(61) 0(0) 24(52) 0(0) 16(59) 0(0) 5(33) 0(0) 16(46) 0(0) 4(25) 0(0) *ThesamenumberrepresentsthesamechimericmouseinthistableandinTable1 . **Allembryosweretransferredatthetwo -cellstage. Table3.Microinseminationusingroundspermatidsfromgreenseminiferoustubulesof 20-day-oldchimeras No.(%)of撒ers Chimera No.壷 No.ofembryos
transferred*" Total Withblack
eyes GFP-positiveand black-eyed 1 40 6 6(100) 2(33) 2 3 72 80 2 14 2(100) 14(100) 1(50) 7(50) "Allembryosweretransferredatthetwo -cellstage . Table4.Microinseminationusingtesticularspermderivedfromnon-GFPlabeled, transgenicallymarkedEScells Typeof donorES cell Regionof Seminiferous tubules No.ofembryos transferred*Total No.(%)oflitters Withblack eyes Retg transgenic 1 2 green non-green green non-green 76 77 43 64 36 27 18 29 0(0) 27(100) 0(0). 29(100)
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一 ・玉 噛 =垣 ■一 ■B".: Fig.4.Immunofluorescentstsiningof neurospheres. Neurosphereswerepositiveforthe neuralstemcellmarker,Musashi(A,A', A"),andwerenegativeforthemature neuralcellmarker,βlll-tubulin(B,B', B").A:Abright-fieldimageof neurospheresstainedwsthMusashi antibody,A':DAPIstaining,A" Musashiantibody,aneuralstemcell marker,B:abright-fieldimageof neurospherestainedwithβm-tubulin antibody,B':DAPI,B":βm-tubulin. Scalebar=100um.
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C' ・」彊遡
﹁ C" Fig.5.Immunofluorescentstainingof differentiatedneurospheres. Neurosphereswereculturedongelatin-coatedplatesfor10days. Morphologicallydifferentiatedneural cellswereobservedaroundtheattached neurospheres.A:Abright-fieldimageof neurospheresstainedwithMusashi antibody,A':DAPIstaining,A" Musashi,B:abright-fieldimageof/3111-tubulinantibody,B':DAPI,B":βllト tubutin.C:abrightfieldofmouseanti-glialfibrillaryacidicprotein(GFAP) antibody,C':DAPI,C":GFAP,D:a brightfieldimageofO4,anti-oligodendrocytemarker,D':DAPI, D":04.Scalebar=30um. D' D" Table5.FulltermdevelopmentofclonedembryosfromNSCs,Sertoli,CumulusandES cellnuclei Typeof donor cell No.of oocytes il噂ected No.of oocytes With PN(ｰJo) No.ofembryos developedto two-cell stage(%ア No.of embryos transfereed No.of髄ve of『sp餉g (%)鼎 NSC 1887 1503(79.7)a 1097(71.8) 1072 5(0.5) Sertoli 686 581(84.7)a,e 451(77.6) 451 10(2.2) cumulus ES 573 569 529(92.3)b・c 541(95.1)b・c 440(83.2) 198(36.6)a aao 198 12(2.7) 7(3.5) Percentagesagainstnumberofpronuclearformation(PN)...一.嚢.矧 霧..・.. ..`』 欝:・.. r..1..緊 .1馨護ぎ i…難 …… ;攣.. li轟i・ ・灘 Fig.6.Clonemicefrom neuralstemcells.A:Clone mouseat14.5dpc.B: Adultclonemouse(arrow). Themousehasnormal abilityofreproduction. Table6.InvitrodevelopmentofclonedembryosfromNSCs,Sertoli,CumulusandEScell nuclei Typeof donor cell No.of oocytes injected No.of oocytes withPN(%) No.ofreconstructedembryosdevelopedto two-cell stage(%)" 4-8cell stage(%)" Morula/ Blastocyst (%)★ NSC 333 295(88.6)e,b 214(72.5) 68(23.1) 21(7.1) Sertoli 277 267(96.4)8 227(85.0) ND 134(50.2)a
cumulus 319 239(74.9)h 180(75.3) 147(61.5)a 129(54.0)a
ES 374 363(97.1)a 135(37.2)a 118(32.5)h 111(30.6)b "Percentagesagainstnumberofpronuclearformation(PN) . 恥cP<0 .05. A B 60 50 40 30 20 A' B蟹 Fig.7:Clonedblastocystfromcumuluscellsand clonedblastocystfromcumuluscellinjectedEScells. A:DAPIstainingofclonedblastocystfromcumulus cell.A':cdx2(Red)andOct4(Green)antibody stainingofA.B:DAPIstainingofEScellinjected clonedblastocystfromcumuluscell.B':cdx2(Red) andOct4(Green)antibodystainingofB.Bar-10um 10 0 No.of totalcells No.ofcdx2 positive ce襲S .・雛 No.ofOct4 positive ICMcells Fig.8.Blastocystcellnumberofclonedembryosfromcumulus cellsandEScellinjectedclonedembryosfromcumuluscells. EachvalueindicatesmeanｱSE. 團:cumulusclone,■:cumulusclone+EScelI
Table7.EffectofntEScellinjectionintoclonedembryosfromcumuluscells Treatment No.of oocytes injected No.ofembryosthat developedto 2-cell stage (%) 4-ce麗 stage (%) No.of embryos .ESce闘 injected No.of embryos transferred No.of live offspring (%)冑 No.of dead o什 §pring (%)★ No.of only placenta (%)★ Cumulus clone 256 158 (61.7> 131 (51.2) 100 1(1.0) 0(0) 0(0) GFP-ntES Cellinjected 202 156 (77.2) 147 (72.8) 14プ 131 0(0) 0(0) 0(0) EScell injected 217 190 (87.5) 153 (70.5) 153 132 1(0.7) 0(0) 0(0) *Percentagesagainstnumberofembryotransfer .
